«Не навреди» — основной принцип обеспечения безопасности пациента, таким образом, очевидна оправданная жесткость и требовательность к безопасности лекарственных препаратов, определенная законодательно. Доклиническая оценка безопасности направлена на защиту здоровья человека за счет исключения потенциальных препаратов, прогнозируемый риск клинического применения которых превышает возможную пользу. Токсикология традиционно определяется как «наука о пагубном воздействии химических веществ на живые организмы», а токсикологические исследования являются неотъемлемой частью доклинического изучения новых лекарственных препаратов. О роли токсикологии в доклинических исследованиях рассказывает член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, лауреат Государственной премии Российской Федерации Андрей Дмитриевич ДУРНЕВ — руководитель отдела лекарственной токсикологии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», председатель комиссии Министерства здравоохранения Российской Федерации по аттестации экспертов на право проведения экспертизы лекарственных средств для медицинского применения, заместитель председателя Межведомственного совета РАН по научному обоснованию и сопровождению национальной лекарственной политики Российской Федерации.

Отсутствие в достаточном количестве зарегистрированных лекарственных средств для педиатрической популяции является общемировой проблемой. Поскольку дети являются пациентами, входящими в группы повышенного риска, при разработке лекарственных препаратов для педиатрии необходимо заранее оценить и максимально минимизировать неоправданные риски.

Цель работы — анализ действующей нормативно-правовой  и  методической базы  доклинических  исследований  и  выделение  ключевых  факторов риска для обоснования безопасности педиатрических пациентов при разработке препаратов, предназначенных для детей.

Одна из основных задач доклинической оценки безопасности препаратов, предназначенных для применения в педиатрии, состоит в выявлении нежелательного воздействия на процессы роста и развития организма. Согласно методическим руководствам национального и международного статуса, данные по безопасности, полученные в ходе клинических исследований с участием взрослых, представляют наиболее ценную информацию для решения вопроса о безопасности включения педиатрических пациентов в клинические испытания. Вопрос о проведении доклинических исследований с использованием неполовозрелых (ювенильных) животных рассматривается в тех случаях, когда имеющиеся данные по безопасности, полученные из экспериментов на половозрелых животных и у взрослых пациентов в клинических исследованиях, признаются недостаточными для оценки безопасности клинических испытаний с участием детей. Программа доклинических исследований педиатрических препаратов разрабатывается на основании комплексной оценки ключевых факторов риска в каждом конкретном случае с использованием анализа весомости доказательств (WoE). Вывод о безопасности применения лекарственного препарата у детей должен базироваться на оценке риска в релевантных клинических и доклинических исследованиях.

Эндокринная система координирует работу практически всех органов и систем организма позвоночных, в том числе  такие  важные  биологические  функции,  как метаболизм, развитие, размножение и поведение. На сегодняшний день накоплено значительное количество информации об эндокринных нарушениях при использовании химических соединений (эндокринных дизрапторов) в различных отраслях деятельности человека. Цель работы — оценка возможности проведения на стадии доклинических исследований анализа рисков функционального нарушения эндокринной системы при применении новых лекарственных средств. С эндокринными дизрапторами связан широкий спектр нежелательных явлений, включая проблемы развития, возникающие из-за нарушения функционирования эндокринной системы. Особенностями эндокринных нарушений, вызванных дизрапторами, являются длительный латентный период между воздействием и проявлением дисфункции, отсутствие линейной зависимости  «доза–эффект»,  зависимость  степени  нарушений  от  момента  начала  и длительности воздействия. К основным механизмам влияния химических веществ на эндокринную систему относят их взаимодействие с рецепторами клеток, чувствительных к влиянию определенных гормонов, влияние на экспрессию  генов  и   внутриклеточную   передачу   сигналов,   транспорт   гормонов и др. В обзоре обсуждена возможность использования показателей уровней гормонов как индикаторов эндокринной токсичности и приведены  литературные и собственные данные о нормах содержания основных гормонов в крови животных.  Включение  анализа  уровней  основных  гормонов  крови  животных   в программу регистрационных доклинических исследований позволит оценить риски потенциальных угроз ятрогенного происхождения.

В качестве перспективной группы веществ для создания опиоидных анальгетиков с оригинальным механизмом действия без риска развития респираторной депрессии и наркотической зависимости рассматриваются каппа-селективные агонисты. В предыдущих исследованиях было выявлено соединение РУ-1205 (фторфенилпроизводное имидазо[1,2-а]бензимидазола) с установленным в экспериментах in vitro и in vivo каппа-рецепторным механизмом анальгетической активности.

Цель работы: оценка влияния дигидрохлорида 9-(2-морфолиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола  на  уровень  повреждений  ДНК   у   крыс при однократном подкожном введении.

Материалы и методы: исследование выполнено на половозрелых белых беспородных лабораторных крысах обоего пола. Повреждения ДНК учитывали методом ДНК-комет. Использовалась схема c однократным подкожным введением водного раствора субстанции РУ-1205 в трех дозах: 1, 10 и 100 мг/кг. В качестве положительного контроля использовали метилметансульфонат в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно, в качестве отрицательного  контроля  —  0,9%  раствор  NaCl (100 мкл на 100 г массы животного).

Результаты: при однократном подкожном введении крысам РУ-1205 дозозависимо не увеличивает показатель %ДНК в хвостах комет. Изменения не носят достоверного характера по сравнению с состоянием генома клеток соответствующих органов/тканей животных, получавших в эти же сроки физиологический раствор. %ДНК в хвостах комет в клетках различных органов/тканей в группах животных отрицательного контроля составляет 1,83–3,82% (медианное значение [25–75%]). Введение генотоксиканта метилметансульфоната в дозе 40 мг/кг приводит к увеличению количества поврежденной ДНК по сравнению с группой отрицательного контроля во всех исследуемых органах и тканях.

Выводы: в результате исследования генотоксических свойств дигидрохлорида 9-(2-морфолиноэтил)-2-(4-фторфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола установлено, что при однократном подкожном введении крысам в дозах 1, 10, 100 мг/кг РУ-1205 не оказывает повреждающего действия на геном клеток исследуемых органов.

Неотъемлемой частью надлежащей лабораторной практики является гуманное отношение к лабораторным животным. Актуальными  остаются  исследования  по изучению анестезирующего действия различных препаратов, позволяющих снизить болевой синдром и дистресс у лабораторных животных.

Цель работы: оценка  влияния  α₂-адреноблокаторов  пророксана  и  атипамезола на изменение отношения индексов ритмов  волн  электроэнцефалограмм при введении дексмедетомидина.

Материалы и методы: в исследовании были использованы кролики-самцы линии Советская шиншилла массой 3,0±0,3 кг (n=12). Дексмедетомидин вводили однократно подкожно в дозе 100 мкг/кг, атипамезол — 50 мкг/кг внутримышечно, пророксан — 170 мкг/кг внутривенно (дозы эквимолярны дозе дексмедетомидина). Действие препарата оценивали методом фармакоэлектроэнцефалографии. Запись электроэнцефалограмм животных осуществляли с помощью чашечковых электродов с использованием 8-канального энцефалографа «Нейрон-Спектр-1» с полосой пропускания 0,5–35 Гц и частотой квантования 500 Гц. Осуществляли проверку распределения количественных признаков с использованием W-критерия Шапиро–Уилка. При нормальном распределении количественных признаков значимость различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного  анализа  ANOVA  с  post-hoc-тестом  по  Даннетту; при распределении, отличном от нормального, — с помощью непараметрического критерия Краскела–Уоллиса с post-hoc-тестом по Данну.

Результаты: в результате введения дексмедетомидина наблюдали достоверное увеличение δ-ритма и снижение θ-ритма головного мозга кроликов на протяжении 2 ч. Введение атипамезола в эквимолярных количествах возвращало соотношение индексов ритмов к исходным значениям, эквимолярное введение пророксана не влияло на соотношение индексов ритмов волн.

Выводы: атипамезол устраняет седативное и гипнотическое действие дексмедетомидина, что подтверждает возможность его применения в ветеринарной практике для вывода из наркоза. В свою очередь, применение пророксана с целью устранения седативного эффекта дексмедетомидина неэффективно.

Ингибиторы нейраминидазы — класс препаратов, применяемый для лечения инфекции, вызываемой вирусами гриппа. Для скрининга потенциальных ингибиторов  нейраминидазы  представляет  интерес  разработка  in  vitro  методик без использования вирусов в реакции. Цель работы: разработать  и  валидировать  методику  определения  ингибирующего   действия  веществ  по   отношению к ферменту нейраминидаза (КФ 3.2.1.18) с использованием флуоресцентного субстрата 2’-4(4-метилумбеллиферил)-α-D-N-ацетилнейраминовой кислоты (4MU-NANA) in vitro на примере хиноидных пигментов — потенциальных ингибиторов нейраминидазы. Материалы и методы: в основе метода лежит ферментативное  расщепление  субстрата   4MU-NANA   ферментом   нейраминидазой с образованием флуоресцентного маркера 4-метилумбеллиферона с детекцией при длинах волн возбуждения/испускания 360/450 нм. Результаты: методика валидирована по параметрам: специфичность, линейность, точность, прецизионность. Линейность методики составила 0,31–80  мкМ  4-метилумбеллиферона. Точность для четырех уровней концентраций, включая нижний предел количественного определения, находилась в пределах 87–114%, т.е. относительная погрешность при оценке точности не превышала 15%. Внутридневная прецизионность составила 1,5–10,4%, междневная прецизионность 2,3–9,6%. При оценке ингибирующего действия на примере занамивира гидрата (0,6–150 нМ) точность составила 89–120%, прецизионность 3,1–11,0%. Для контрольных образцов занамивира гидрата значение IC₅₀ составило 27 ± 3 нМ,  для  осельтамивира IC₅₀ = 16 ± 2 нМ. Для тестирования субстанций допустимо использовать растворители: диметилсульфоксид 50%,  полисорбата 80  раствор 5%,  этанол 50% и метанол 50 и 100%. Для соединений, нерастворимых в перечисленных растворителях, предложено получение комплексов включения с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином. Для исследуемого вещества биснафтазарина, хиноидного пигмента природного происхождения, IC₅₀ составила 273 ± 28 нМ. Заключение: методика характеризуется удовлетворительной точностью и воспроизводимостью и может быть использована для скрининга потенциальных ингибиторов нейраминидазы. Для тестирования нерастворимых веществ предложено их применение в виде комплексов включения с циклодекстринами.

Согласно требованиям нормативных документов, как российских, так и международных, методики, применяющиеся при исследовании биоэквивалентности, сопоставимости показателей качества биотехнологических (биологических) препаратов, выпускающем контроле качества лекарственных препаратов и прочих не менее важных in vitro исследованиях, должны быть валидированы. Для этих исследований in vitro используют тесты на связывание молекулы с рецептором   и на биологическую активность препаратов. Однако в настоящее время не существует единого подхода к валидации биоаналитических методик in vitro, не связанных с определением концентрации действующего вещества в биологических жидкостях. Цель работы: валидировать методику оценки инсулинозависимого захвата глюкозы и доказать пригодность набора ГЛЮКОЗА GOD-PAP для определения глюкозы в культуральной среде. Материалы и методы: в исследовании использовали препараты производства ОАО «ГЕРОФАРМ» РинФаст® и плацебо  к инсулину аспарт, клеточную линию миобластов крысы L6J1, набор ГЛЮКОЗА GOD-PAP для определения концентрации глюкозы.  Исследование  проводили на дифференцированных клетках, которые культивировали в течение 7 сут. Для дифференцировки L6J1 использовали питательную среду DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л и 2% сыворотки лошадиной. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения Prism 9. Результаты: продемонстрированы показатели специфичности методики; в максимальной концентрации препарат отличается от плацебо в 4 раза по остаточному уровню глюкозы в культуральной среде. Определена прецизионность методики: сходимость составила 4–9%, внутрилабораторная прецизионность 11–16%. Коэффициент вариации устойчивости методики составил 14% в 4 независимых экспериментах в 9 аналитических сериях. Проведено сравнение инсулиновых продуктов (инсулин аспарт и генно-инженерный инсулин человека), для которых показатели концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) различались в 1,5 раза. Для набора ГЛЮКОЗА GOD-PAP коэффициент детерминации линейной регрессии составил 0,9983; чувствительность — 1 ммоль/л, диапазон правильности — 95–107%. Выводы: можно утверждать, что методика является специфичной, высокопрецизионной и устойчивой для проведения оценки инсулинозависимого захвата глюкозы с использованием клеточной линии миобластов крысы L6J1 в качестве тест-системы и является пригодной для детектирования биологической активности препаратов инсулина в in vitro исследованиях.

Для сравнительного изучения фармакодинамики и подтверждения эквивалентности препаратов низкомолекулярных гепаринов (НМГ) согласно современным регуляторным требованиям необходимо сопоставить три фармакодинамических показателя: анти-Ха и анти-IIа активности и концентрацию ингибитора пути тканевого фактора (TFPI). Цель работы — анализ особенностей проведения биоаналитической части исследования эквивалентности биоаналогичного препарата надропарина кальция при подкожном введении. Материалы и методы: определение анти-Ха и анти-IIа активности НМГ и содержания TFPI в образцах плазмы крови человека, полученных после однократного подкожного введения тестируемого и референтного препаратов в одной дозе, выполнено с применением коммерчески доступных наборов реагентов и предварительно валидированных методик. Основные фармакодинамические параметры (суррогатные фармакокинетические маркеры): максимальная активность или концентрация (A_max или С_max), время достижения максимальной активности или концентрации (Т_max), площадь под кривой «активность (концентрация) — время» (AUC), период полувыведения (T_1/2) рассчитаны внемодельным методом статистических моментов и  выполнена их дальнейшая статистическая обработка. Результаты: полученные результаты оценки анти-Ха активности и TFPI позволили рассчитать и сопоставить фармакодинамические параметры (А_max или C_max, AUC_0-24, AUC_0-∞, Т_max, T_1/2), а также оценить доверительные интервалы, необходимые для подтверждения эквивалентности исследованных препаратов. Данные по значениям анти-IIа активности имели характер колебаний в пределах одного уровня, что не позволило рассчитать и сопоставить фармакодинамические параметры. Выводы: выявлены особенности, которые необходимо учитывать при планировании исследований фармакодинамики препаратов надропарина кальция: целесообразность разделения каждого образца при отборе с получением двух испытуемых аликвот (одна для определения анти-Ха и анти-IIа активностей, вторая — для анализа TFPI) для корректного выполнения аналитического этапа; достаточность подтверждения отсутствия мешающего  влияния  действующего  вещества  на   аналитическую   процедуру  при валидации  биоаналитических  методик  оценки  анти-Ха  активности,  анти-IIа активности и  содержания  TFPI  в  плазме  крови  человека,  валидированных в диапазоне концентраций 0,024–0,182 МЕ/мл, 0,0069–0,052 МЕ/мл и  1,56–100  нг/мл соответственно; возможность получения данных, не позволяющих рассчитать фармакодинамические параметры и сопоставить доверительные интервалы для всех трех фармакодинамических показателей.  Указанные  особенности  могут быть характерны для других препаратов НМГ.

Митоксантрон — маркерный субстрат белка устойчивости рака молочной железы (BCRP), участвующего в ряде фармакокинетических межлекарственных взаимодействий. При проведении исследований in vitro в связи с возможной насыщаемостью транспортера BCRP целесообразно применять невысокие концентрации митоксантрона, поэтому  необходим  высокочувствительный  метод его количественного определения.

Цель работы: разработка и валидация методики количественного определения митоксантрона в среде для культивирования клеток Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.

Материалы и методы: анализ выполняли на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Ultimate 3000» (Thermo Fisher Scientific) с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором TSQ Fortis и колонкой UCT Selectra C18 4,6×100 мм, 5 мкм, 100 Å. Использовали градиентный режим элюирования, подвижная фаза — смесь раствора муравьиной кислоты 1% и метанола. Скорость подвижной фазы — 0,3 мл/мин, температура разделения — 35 °С, объем пробы — 5 мкл. Длительность анализа — 10 мин, время удерживания митоксантрона — 5,51 мин. Пробоподготовка заключалась в осаждении белка среды для культивирования метанолом и центрифугировании (13000 g, 10 мин). Детектирование проводили в режиме регистрации положительных ионов, метод ионизации — электрораспыление (3700 В), оболочечный газ 50 л/мин, вспомогательный газ 10 л/мин, продувочный газ 1 л/мин, температура трубки для переноса ионов 300 °С, температура испарителя 350 °С. Переходы масс: 455 m/z → 88,2 m/z при энергии столкновения 25 В, 455 m/z → 358,1 m/z при 18 В, фрагментация источника 0, CID gas 2 мТорр.

Результаты: методика характеризовалась селективностью, чувствительностью (предел обнаружения — 10 нмоль/л, нижний предел количественного определения — 50 нмоль/л), правильностью, прецизионностью и линейностью (50−1000 нмоль/л). Отсутствовал перенос пробы и матричный эффект, образцы проб обладали стабильностью при моделировании реальных условий хранения. Методика позволяет проводить доклинические исследования  влияния  лекарственных веществ на активность BCRP путем оценки трансцеллюлярного переноса митоксантрона в присутствии тестируемого вещества.

Выводы: разработана и валидирована ВЭЖХ-МС/МС методика количественного анализа митоксантрона в среде для культивирования клеток Caco-2.

Широкое применение лекарственных препаратов на основе  растительных  масел требует строгой регламентации и оценки показателей качества, установления срока годности и контроля условий хранения. Наиболее часто для определения ненасыщенных соединений, входящих в состав растительных масел, используется метод определения йодного числа, однако он имеет ряд недостатков. Альтернативой ему является способ определения ненасыщенности, основанный на реакции эпоксидирования.

Цель работы: оценка возможности определения степени ненасыщенности терпеноидов и эфирных масел с использованием пероксикарбоновых кислот.

Материалы и методы: в исследовании использовали линалоол, мирцен, лимонное масло, эпоксидирование проводили пероксидекановой и пероксиоктановой кислотами. Избыток кислоты определяли йодометрическим титрованием. Результаты: показана возможность количественного определения ненасыщенности отдельных терпеноидов и эфирного масла путем проведения эпоксидирования  пероксикислотами.  Разработана  методика   определения   йодного  числа  эфирного  масла.  Рассчитаны  йодные  числа  для  линалоола,  мирцена и лимонного масла. Определено, что эпоксидирование протекает как реакция второго порядка, рассчитаны константы скорости  реакции  (для  линалоола  —  3,9  л×моль^–1×мин^–1  (298  К),  мирцена  (до  монооксида)  —  1,76  л×моль^–1×мин^–1 (298 К), эпоксида мирцена (до диэпоксида) — 0,044 л×моль^–1×мин^–1 (298 К), лимонного масла — 3,9 л×моль^–1×мин^–1 (297 К)).

Выводы: предложена методика быстрого и эффективного  определения  степени ненасыщенности (определения  йодного  числа),  основанная  на  титрометрии с использованием пероксикислот, которая может быть принята за основу метода количественного определения суммы ненасыщенных  биологически  активных веществ в эфирных маслах.