Preview

Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств

Расширенный поиск

Ингибиторы нейраминидазы: разработка и валидация методики определения ингибирующего действия in vitro

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2022-387

Полный текст:

Аннотация

Ингибиторы нейраминидазы — класс препаратов, применяемый для лечения инфекции, вызываемой вирусами гриппа. Для скрининга потенциальных ингибиторов нейраминидазы представляет интерес разработка in vitro методик без использования вирусов в реакции.

Цель работы: разработать и валидировать методику определения ингибирующего действия веществ по отношению к ферменту нейраминидаза (КФ 3.2.1.18) с использованием флуоресцентного субстрата 2’-4(4-метилумбеллиферил)-α-D-N-ацетилнейраминовой кислоты (4MU-NANA) in vitro на примере хиноидных пигментов — потенциальных ингибиторов нейраминидазы.

Материалы и методы: в основе метода лежит ферментативное расщепление субстрата 4MU-NANA ферментом нейраминидазой с образованием флуоресцентного маркера 4-метилумбеллиферона с детекцией при длинах волн возбуждения/испускания 360/450 нм.

Результаты: методика валидирована по параметрам: специфичность, линейность, точность, прецизионность. Линейность методики составила 0,31–80 мкМ 4-метилумбеллиферона. Точность для четырех уровней концентраций, включая нижний предел количественного определения, находилась в пределах 87–114%, т.е. относительная погрешность при оценке точности не превышала 15%. Внутридневная прецизионность составила 1,5–10,4%, междневная прецизионность 2,3–9,6%. При оценке ингибирующего действия на примере занамивира гидрата (0,6–150 нМ) точность составила 89–120%, прецизионность 3,1–11,0%. Для контрольных образцов занамивира гидрата значение IC50 составило 27 ± 3 нМ, д ля осельтамивира IC50 = 16 ± 2 нМ. Для тестирования субстанций допустимо использовать растворители: диметилсульфоксид 50%, полисорбата 80 раствор 5%, этанол 50% и метанол 50 и 100%. Для соединений, нерастворимых в перечисленных растворителях, предложено получение комплексов включения с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином. Для исследуемого вещества биснафтазарина, хиноидного пигмента природного происхождения, IC50 составила 273 ± 28 нМ.

Заключение: методика характеризуется удовлетворительной точностью и воспроизводимостью и может быть использована для скрининга потенциальных ингибиторов нейраминидазы. Для тестирования нерастворимых веществ предложено их применение в виде комплексов включения с циклодекстринами.

Об авторах

Н. М. Фаустова
Закрытое акционерное общество «Санкт-Петербургский институт фармации»
Россия

Фаустова Наталья Михайловна, канд. хим. наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663



С. С. Петлицкая
Закрытое акционерное общество «Санкт-Петербургский институт фармации»
Россия

Петлицкая Серафима Сергеевна.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663



И. Н. Ампилогова
Закрытое акционерное общество «Санкт-Петербургский институт фармации»
Россия

Ампилогова Ирина Николаевна, канд. хим. наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663



М. В. Карлина
Закрытое акционерное общество «Санкт-Петербургский институт фармации»
Россия

Карлина Марина Валерьевна, канд. биол. наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663



М. Н. Макарова
Акционерное общество «Научно-производственное объединение «ДОМ ФАРМАЦИИ»
Россия

Макарова Марина Николаевна, д-р мед. наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663



В. Г. Макаров
Закрытое акционерное общество «Санкт-Петербургский институт фармации»
Россия

Макаров Валерий Геннадьевич, д-р мед. наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663



Список литературы

1. Лусс ЛВ. Современные принципы диагностики и терапии гриппа. Русский медицинский журнал. 2007;(5):407.

2. Митрофанова ВН, Мельников ВЛ, Юрина НВ, Бурко ПА. Сравнительный анализ клинико-эпидемиологических особенностей течения гриппа А (H1N1/2009) в период эпидемиологического подъема заболеваемости. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2010;15(3):74–5.

3. Якимов СС. Рациональный подход к комплексной терапии гриппа. Медицинский совет. 2013;1–2:26–31.

4. Филдс Б, Найп Д, ред. Вирусология. Т. 2 . М.: Мир; 1989.

5. Ohuchi M, Feldmann A, Ohuchi R, Klenk HD. Neuraminidase is essential for fowl plague virus hemagglutinin to show hemagglutinating activity. Virology. 1995;212(1):77–83. https://doi.org/10.1006/viro.1995

6. Jagadesh A, Salam AA, Madgal PP, Arunkumar G. Influenza virus neuraminidase (NA): a target for antivirals and vaccines. Arch Virol. 2016;161(8):2087–94. https://doi.org/10.1007/s00705-016-2907-7

7. Штыря ЮА, Мочалова ЛВ, Бовин НВ. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция. Acta Naturae. 2009;1(2):28–34. https://doi.org/10.32607/20758251-2009-1-2-26-32

8. Jeong HJ, Ryu YB, Park SJ, Kim JH, Kwon HJ, Kim JH, at al. Neuraminidase inhibitory activities of flavonols isolated from Rhodiola rosea roots and their in vitro anti-influenza viral activities. Bioorg Med Chem. 2009;17(19):6816–23. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2009.08.036

9. Sharshov KA, Yurlov AK, Li X, Wang W, Li L, Bi Yu, et al. Avian influenza virus ecology in wild birds of Western Siberia. Avian Res. 2017;8(12):1–5. https://doi.org/10.1186/s40657-017-0070-9

10. Buxton RC, Edwards B, Juo RR, Voyta JC, Tisdale M, Bethell RC. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir. Anal Biochem. 2000;280(2):291–300. https://doi.org/10.1006/abio.2000.4517

11. Potier M, Mameli L, Belisle M, Dallaire L, Melancon SB. Fluorometric assay with a sodium (4-methylumbelliferyl-α-D-N-acetylneuraminate) substrate. Anal Biochem. 1979;94(2):287–96. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90362-2

12. Engstler M, Talhouk JW, Smith RE, Shauner R. Chemical synthesis of 4-trifluoromethylumbelliferyl-α-D-N-acetylneuraminic acid glycoside and its use for the fluorometric detection of poorly expressed natural and recombinant sialidases. Anal Biochem. 1997;250(2):176–80. https://doi.org/10.1006/abio.1997.2205

13. Leang SК, Hurt AC. Fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals. J Vis Exp. 2017;(122):55570. https://doi.org/10.3791/55570

14. Wetherall NT, Trivedi T, Zeller J, Hodges-Savola C, McKimm-Breschkin JL, Zambon M, Hayden FG. Evaluation of neuraminidase enzyme assays using different substrates to measure susceptibility of influenza virus clinical isolates to neuraminidase inhibitors: report of the neuraminidase inhibitor susceptibility network. J Clin Microbiol. 2003;41(2):742–50. https://doi.org/10.1128/JCM.41.2.742-750.2003

15. Nishikawa T, Shimizu K, Tanaka T, Kuroda K, Takayama T, Yamamoto T, et al. Bacterial neuraminidase rescues influenza virus replication from inhibition by a neuraminidase inhibitor. PLoS One. 2012;7(9):e45371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045371

16. Pozharitskaya ON, Shikov AN, Makarova MN, Ivanova SA, Kosman VM, Makarov VG, et al. Antiallergic effects of pigments isolated from green sea urchin (Strongylocentrotus droebachiensis) shells. Planta Med. 2013;79(18):1698–704. https://doi.org/10.1055/s-0033-1351098

17. Никитин НА. Циклодекстрины и их комплексы включения. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2015;(6):3–11.

18. Quosdorf S, Schuetz A, Kolodziej H. Different inhibitory potencies of oseltamivir carboxylate, zanamivir, and several tannins on bacterial and viral neuraminidases as assessed in a cell-free fluorescence-based enzyme inhibition assay. Molecules. 2017;22(11):1989. https://doi.org/10.3390/molecules22111989


Рецензия

Для цитирования:


Фаустова Н.М., Петлицкая С.С., Ампилогова И.Н., Карлина М.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Ингибиторы нейраминидазы: разработка и валидация методики определения ингибирующего действия in vitro. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2022;. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2022-387

For citation:


Faustova N.M., Petlitskaya S.S., Ampilogova I.N., Karlina M.V., Makarova M.N., Makarov V.G. Neuraminidase inhibitors: development and validation of a procedure for in vitro determination of the inhibitory effect. The Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2022;. (In Russ.) https://doi.org/10.30895/1991-2919-2022-387

Просмотров: 79


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1991-2919 (Print)
ISSN 2619-1172 (Online)