Элементный состав настоек пустырника, изготовленных различными методами экстракции

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в медицинской практике широко используются лекарственные растительные препараты (ЛРП). На российском фармацевтическом рынке их доля среди всех препаратов составляет около 25%. Одной из самых часто употребляемых лекарственных форм таких препаратов являются настойки [1–4].

Изучению элементного состава лекарственного растительного сырья (ЛРС) и препаратов из него уделяется недостаточно внимания, несмотря на важнейшую роль металлов и металлоидов в метаболизме растений и их терапевтическом потенциале. Фармакологическое действие экстракционных препаратов обусловлено не только биологически активными соединениями, но и минеральными комплексами. ЛРП можно рассматривать как дополнительный источник микроэлементов для организма человека за счет содержания ионов металлов в легкодоступной органической форме. В исходном ЛРС содержатся эссенциальные элементы, необходимые для организма человека и дополняющие терапевтическое действие биологически активных веществ, и токсичные, которые потенциально опасны [5]. При производстве ЛРП элементы могут переходить в готовые лекарственные формы, поэтому для обеспечения безопасности фитотерапии их содержание контролируется как в исходном ЛРС, так и в готовых лекарственных формах. В настоящее время селективно нормируются токсичные элементы (Pb, Cd, As, Hg), однако ЛРС¹ не применяется в чистом виде (за исключением льна семян и тыквы семян), а используется для дальнейшего изготовления лекарственных форм. В жидких лекарственных формах (настойках², экстрактах) суммарное содержание элементов определяется полуколичественным методом, но этот способ не позволяет обеспечить достоверную оценку содержания отдельных тяжелых металлов (ТМ) и мышьяка. Поэтому для ЛРП, аналогично ЛРС, необходимо установление норм содержания ТМ и As, а возможно, и с более расширенным списком элементов для оценки безопасного уровня их поступления в организм.

В случае биологически активных добавок (БАД), также применяющихся в медицинской практике, контролируется как содержание токсичных элементов (для настоек, мг/кг: Pb — 0,5; Cd — 0,03; As — 0,05; Hg — 0,01)³, так и уровень суточного потребления эссенциальных микроэлементов (V, Cr, Mn, Fe, Co, Cu, Zn)^4,5.

Экстракционные препараты получают как классическими методами (мацерация, ремацерация (дробная мацерация (МЭ)), перколяция)⁶ [6], так и с использованием более современных технологий (ультразвуковая обработка (УЗЭ) [6–9], вихревая экстракция⁷ (ВЭ) [10]), которые позволяют повысить выход биологически активных веществ при уменьшении времени экстракции. Вместе с тем исследования влияния способа получения на степень извлечения элементов, в том числе токсичных (Pb, Cd, As, Hg), немногочисленны. В настоящее время имеются единичные данные об элементном составе настоек [5][11][12], систематические исследования на эту тему ранее не проводились⁸.

Цель работы — оценка перехода элементных примесей из лекарственного растительного сырья в настойки, изготовленные различными методами экстракции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе исследования был изучен элементный состав травы пустырника, используемой при производстве настоек (АО «Флора Кавказа»), а также настоек, полученных в лабораторных условиях из этого сырья в соотношении сырье (г) : экстрагент (мл) 1:5 методами ДМ, УЗЭ и ВЭ. В качестве экстрагента использовали этанол 70% (ООО «Гиппократ»)⁹. Снижение вероятности внесения тяжелых металлов и мышьяка из внешней среды и уменьшения потерь элементов при анализе достигали использованием полипропиленовой посуды¹⁰ и расходных материалов, обработанных 3% азотной кислотой и деионизованной водой, для удаления возможных сорбированных металлов со стенок посуды.

Дробная мацерация. Весь объем экстрагента (200 мл) делили на 2 части. Точную навеску сырья (20,0 г) помещали в полипропиленовый стакан, добавляли первую порцию экстрагента и встряхивали на шейкере орбитальном (IKA KS 260 basic, Германия) (скорость вращения — 150 об/мин, длительность обработки — 1 ч), затем выдерживали 2 сут при комнатной температуре. После этого добавляли оставшийся экстрагент, повторяли встряхивание на шейкере при тех же условиях и оставляли на 5 сут при комнатной температуре. Готовую настойку сливали, отстаивали в холодильнике в течение 2 сут и фильтровали через фильтр беззольный с диаметром пор 2–3 мкм (синяя лента).

Мацерация с обработкой сырья на ультразвуковой бане. Точную навеску сырья (20,0 г) помещали в полипропиленовый стакан, добавляли весь объем экстрагента (200 мл) и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Стакан помещали в ультразвуковую баню (VBS-3DP, ООО «Вилитек», Россия) и проводили обработку смеси ультразвуком в течение 30 мин при нагревании при температуре 45 ºС [7]. После этого настойку выдерживали при комнатной температуре в течение 3 ч, сливали готовую настойку, отстаивали в холодильнике в течение 2 сут и фильтровали через фильтр беззольный с диаметром пор 2–3 мкм (синяя лента).

Вихревая экстракция. Точную навеску сырья (20,0 г) помещали в полипропиленовый стакан, добавляли весь объем экстрагента (200 мл) и оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Содержимое стакана обрабатывали с помощью лабораторного гомогенизатора (IKA 250 digital ULTRA-TURRAX, Германия) в течение 25 мин, полученную смесь отстаивали в течение 3 ч при комнатной температуре, сливали готовую настойку, отстаивали в холодильнике в течение 2 сут и фильтровали через фильтр беззольный с диаметром пор 2–3 мкм (синяя лента) [9].

Элементный состав определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе Agilent ICP-MS 7900 (Agilent Technologies, Inc., США) после предварительной минерализации образцов методом микроволнового разложения, фиксируя интенсивность сигналов по следующим единицам массы (а.е.м.): V — 51, Cr — 52, Mn — 55, Fe — 56, Co — 59, Ni — 60, Cu — 63, Zn — 66, As — 75, Sr — 88, Cd — 111, Hg — 202, Tl — 205, Pb — 208 [14]. Измерения проводили для трех параллельных проб каждого объекта, показания прибора регистрировали в пяти повторностях. Концентрации элементов рассчитывали методом калибровочной кривой с использованием стандартных растворов (мультиэлементный стандарт качества IV (Merck, Германия); стандартный раствор ртути 1000 мг/л (Inorganic ventures, США); стандартный раствор мышьяка 100 мг/л (ООО «ЭКРОСХИМ», Россия)). Статистическую обработку и анализ результатов осуществляли с помощью программы Microsoft Office Excel 2019.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В сырье и полученных извлечениях найдены V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Sr, Cd, Tl, Pb, не обнаружена Hg (табл. 1). В исходном сырье содержание элементов составило 0,007–121,1 мг/кг, что согласуется с проведенными ранее исследованиями [15][16]. Fe, Sr, Mn и Cu обнаружены в сырье в наибольших количествах, Cd, As, Pb и Tl — в наименьших. Эссенциальные элементы (Fe, Mn, Zn, Cr, Cu, Co, V)¹¹ найдены в концентрациях 0,11–121,1 мг/кг; условно эссенциальные и потенциально токсичные (Ni, Sr, Tl) — 0,013–59,9 мг/кг. Эти элементы в настоящее время не нормируются; в качестве ориентировочных критериев допускается использовать суточные нормы потребления¹². Количества токсичных элементов (Pb, Cd, As) находились в пределах 0,007–0,066 мг/кг, что не превышает предельно допустимые уровни¹³.

В настойках концентрации элементов не превышали 1,35 мг/кг: Zn найден в наибольших количествах, Tl и Cd — в наименьших. Содержание токсичных элементов (Pb, Cd, As) составило 0,0001–0,0046 мг/кг, что не превышает допустимого уровня их содержания¹⁴. Полученные результаты подтверждаются данными литературы по элементному составу настоек пустырника [17][18]. Элементы в наибольших концентрациях были обнаружены в настойке, изготовленной методом ВЭ, в наименьших — методом УЗЭ. Наиболее высокое содержание Zn, Cu и Ni было зафиксировано в образцах, изготовленных методом ДМ.

На основании полученных данных были построены ряды по убыванию концентраций элементов в изученных объектах:

• дробная мацерация: Zn ≥ Fe ≥ Cu ≥ Ni ≥ Mn ≥ Sr ≥ Cr ≥ V ≥ As ≥ Co ≥ Pb ≥ Tl ≥ Cd;
• мацерация с обработкой сырья на ультразвуковой бане: Zn ≥ Fe ≥ Cu ≥ Ni ≥ Mn ≥ Sr ≥ Cr ≥ V ≥ As ≥ Co ≥ Pb ≥ Tl ≥ Cd;
• вихревая экстракция: Fe ≥ Zn ≥ Cu ≥ Sr ≥ Mn ≥ Ni ≥ Cr ≥ V ≥ As ≥ Co ≥ Pb ≥ Tl ≥ Cd.

Содержание элементов в настойках разных технологий получения в определенной степени схожи. В частности, в наибольших концентрациях содержатся Fe и Cu, в минимальных — Tl, Pb и Cd. Вместе с тем имеются различия: при использовании метода ВЭ содержание Fe и Sr сравнительно выше.

Оценку возможного поступления элементов с настойками пустырника в организм человека проводили согласно инструкции по медицинскому применению (разовая доза 30–50 капель)¹⁵. Расчеты проведены по среднему значению разовой дозы (40 капель, 1 мл) 0,887 г, поэтому суточная доза составляет 3,5 г. Проведенный анализ показал, что в организм вместе с настойками пустырника поступают элементы в концентрациях не более значений верхних допустимых уровней суточного потребления. Этот факт позволяет считать их безопасными для медицинского применения по содержанию тяжелых металлов, включая токсичные элементы (табл. 2).

Установлено, что в наибольших количествах в организм человека поступают Zn, Cu и Fe. Настойку, полученную методом ДМ, можно рассматривать как потенциальный источник Cr (1,5% от суточной нормы поступления).

Переход большинства элементов (V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, As, Sr, Cd, Hg, Tl, Pb) в спиртовые извлечения не превышал 46%, однако в случае Zn достигал 77% от исходного содержания в сырье (табл. 3). В наибольшей степени (30% и выше от исходного содержания в сырье) во все спиртовые извлечения переходили Zn и As. В случае образцов, полученных ДМ, в эксткракты переходили Tl и Ni. В количествах 10–30% извлекались Cr, Co, Cu, Pb. В минимальных (до 10% от исходного содержания в сырье) — Mn, Fe, Sr, Cd, что согласуется с ранее полученными данными [19].

Степень перехода V и Cr в настойки зависела от способа их получения. Ni, Cu, Zn и Tl максимально извлекались при использовании ДМ; V, Cr, Co — при ВЭ; при УЗЭ — переход большинства элементов был наименьшим.

Степень экстракции элементов из исходного сырья в настойки разных способов получения убывает в рядах:

• дробная мацерация: Zn > Ni > As > Tl > Cu > Cr > Co > V > Pb > Cd > Mn > Fe > Sr;
• мацерация с обработкой сырья на ультра звуковой бане: Zn > Ni > Tl > As > Cu > Pb > V > Co > Cr > Cd > Fe > Mn > Sr;
• вихревая экстракция: Zn > Ni > As > Tl > Cr > V > Cu > Co > Pb > Cd > Mn > Fe > Sr.

Наибольшее извлечение выявлено для Zn и Ni, наименьшее — для Sr, Fe и Mn. Показано, что в целом ряды степеней переходов ТМ и мышьяка из исходного сырья в спиртоводные извлечения при использовании различных способов экстракции сходны, однако на выход некоторых элементов (V, Cr, Sr) технология получения оказывает значительное влияние. Различия в степени извлечения, по всей вероятности, обусловлены формой элементов в исходном растительном сырье и эффективностью разрушения органической матрицы выбранным методом экстракции [20–24]. Высокая степень экстракции Zn согласуется с данными литературы о его преимущественном нахождении в сырье в составе растворимых комплексов с органическими лигандами¹⁶, которые легко переходят в спиртоводные смеси [20]. Малая доля извлечения Fe, Mn и Sr (<5%), очевидно, связана с депонированием в виде труднорастворимых соединений [21][22]. Увеличение доли перехода V, Cr, Sr и Co при использовании ВЭ, по сравнению с другими методами получения настоек, вероятно, происходит за счет интенсивного механического перемешивания и гомогенизации, которые приводят к разрушению клеточных структур и максимальному контакту поверхности сырья с экстрагентом [9][23]. При использовании ДМ в максимальных количествах извлекались Zn, Ni, Cu и Tl. Это обусловлено длительным суммарным временем экстракции (7 сут) и созданием большого градиента концентрации при добавлении свежих порций экстрагента, что способствует более полному переходу наиболее растворимых форм элементов [5]. При использовании ультразвуковой обработки выход большинства элементов был ниже в сравнении с остальными методами. Возможно, это связано с недостаточным временем экстракции после ультразвуковой обработки, а также реадсорбцией высвобожденных ионов на матрице сырья [24]. Это согласуется с данными исследований, в которых для достижения более высокого выхода биологически активных веществ при использовании ультразвуковой обработки была введена дополнительная стадия мацерации [7][8]. Установлено, что при всех методах экстракции выход токсичных элементов не превышал установленных уровней допустимых концентраций и все полученные настойки безопасны для медицинского применения. Извлечение эссенциальных элементов максимально при дробной мацерации и вихревой экстракции, что позволяет обогатить состав готовых лекарственных форм.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено присутствие 13 элементов (V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Sr, Cd, Tl, Pb) в настойках, произведенных различными методами, в количествах 0,0001–1,34 мг/кг. Установлено, что при всех методах экстракции выход токсичных элементов не превышал допустимых концентраций. В случае использования способов дробной мацерации и вихревой экстракции могут быть получены настойки с более высоким содержанием эссенциальных элементов, а при использовании ультразвуковой экстракции — с минимальными концентрациями токсичных примесей тяжелых металлов (Pb, Cd) и As.
2. Проведена оценка возможного поступления тяжелых металлов и мышьяка в организм человека с изученными настойками. Обнаружено, что количество потребляемых элементов не превышает допустимых уровней суточного потребления и настойки безопасны для медицинского применения. Возможное суточное поступление элементов выше при употреблении настоек, полученных методами дробной мацерации и вихревой экстракции.
3. Рассчитаны переходы тяжелых металлов и мышьяка из исходного растительного сырья в настойки. Установлено, что в наибольшей степени извлекается Zn (до 77%), в минимальных — Cd (4,61–6,78%). При использовании дробной мацерации максимально извлекаются Zn (76,6%), Ni (46,6%), Cu (26,4%) и Tl (33,6%), вихревой экстракции — V (22,2%), Cr (26,4%), Co (15,2%) и Sr (1,03%). Ультразвуковая экстракция приводит к наименьшему переходу большинства элементов (0,33–42,7%).

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: М.С. Галенко — определение содержания элементов методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, интерпретация результатов исследования, сбор, анализ и систематизация данных научной литературы, написание текста рукописи; Е.О. Бахрушина — ответственность за технологические аспекты изготовления настоек, критический пересмотр содержания рукописи; И.В. Гравель — разработка дизайна исследования, критический пересмотр содержания рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории спектральных методов анализа ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России Щукину В.М., Ериной А.А., Швецовой Ю.Н. и начальнику лаборатории Кузьминой Н.Е. за помощь в выполнении экспериментальных исследований.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Marta S. Galenko quantified the elements by inductively coupled plasma mass spectrometry, interpreted study results, collected, analysed and systematised the literature, and drafted the manuscript. Elena O. Bakhrushina provided technological aspects of tincture production, and critically revised the manuscript. Irina V. Gravel developed the research design, critically revised the manuscript, and approved the final version for publication.

Acknowledgements. The authors express their gratitude to the employees of the Laboratory of Spectral Analysis Methods, Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products: Viktor M. Shchukin, Alina A. Erina, Yulia N. Shvetsova and Natalia E. Kuzmina, laboratory supervisor, for their assistance in carrying out experiments.