Критические показатели качества липидных наночастиц для мРНК: выбор, обоснование и контроль

ВВЕДЕНИЕ

Липидные наночастицы (ЛНЧ) являются одной из основных транспортных систем лекарственных средств (ЛС), действуя в качестве платформы для адресной доставки и защиты активных фармацевтических субстанций (АФС), что приводит к повышению эффективности лечения за счет таргетности и избирательности действующих веществ. ЛНЧ способны инкапсулировать различные типы соединений — от малых молекул нифедипида, пироксикама [1] до биомакромолекул нуклеиновых кислот и белков, что было успешно реализовано при создании компаниями Moderna и Pfizer-BioNTech вакцин для профилактики COVID-19, разработанных на основе мРНК [2].

В контексте мРНК-терапии изучение ЛНЧ особенно актуально, поскольку именно данные наноносители обеспечивают защиту лабильной мРНК от ферментативной деградации и возможность эффективной доставки нуклеиновой кислоты в цитозоль клетки-мишени. Однако в отличие от традиционных парентеральных лекарственных форм (ЛФ), представляющих собой гомогенные растворы или дисперсии, ЛНЧ являются сложно организованными супрамолекулярными системами, состоящими из нейтральных, стероидных, ПЭГилированных и ионизируемых липидов. Каждый из этих четырех компонентов ЛНЧ вносит уникальный вклад в стабильность, структурную целостность и функциональные характеристики конечного продукта — мРНК, инкапсулированной в ЛНЧ [3][4]. Следовательно, функциональность ЛНЧ для мРНК определяется эффективностью инкапсуляции нуклеиновых кислот, эндосомальным выходом и клеточным захватом. Эти характеристики формируются не на уровне отдельных молекул, а на уровне коллоидной структуры, которая самоорганизуется в процессе смешивания липидных компонентов. При этом характер самоорганизации зависит от ряда технологических параметров (скорость смешивания, температура раствора), которые способствуют формированию коллоидной системы, а в случае традиционных ЛФ влияют на растворимость и однородность распределения АФС.

Именно сложность структуры и чувствительность к показателям качества производства ЛНЧ являются проблемой для контроля качества как собственно частиц, так и конечного продукта. Основные показатели качества ЛНЧ для мРНК (размер частиц, доля инкапсулированной нуклеиновой кислоты, индекс полидисперсности) формируются в процессе их самоорганизации и не могут быть скорректированы после завершения производства. Применение традиционных подходов к контролю качества ЛФ не отвечает на вопрос, на каком этапе производства произошло отклонение и как его можно предотвратить, что особенно критично для таких систем, как ЛНЧ, где вариабельность одного показателя может привести к значительному изменению биораспределения и снижению эффективности. Перед специалистами в области разработки ЛФ возникает проблема перехода к модели предотвращения отклонений, где качество закладывается в продукт на этапе его разработки, что привело к внедрению в фармацевтическую промышленность подхода «концепция встроенного качества» (Quality by Design, QbD) [6][7].

Данная методологическая проблема приобретает особую актуальность в контексте текущей научно-технической повестки Российской Федерации, поскольку исследования в области разработки и производства ЛНЧ для мРНК являются одним из стратегических приоритетов в рамках реализации политики импортозамещения.

Согласно официальному определению, приведенному в руководстве ICH Q8(R2), QbD определяется как «стратегический подход к фармацевтической разработке, который начинается с определенных целей и фокусируется на экспертизе продуктов и контроле процессов, основанном на научных знаниях и управлении рисками качества»¹. Ряд руководящих принципов ICH и ВОЗ по управлению рисками при обеспечении качества также поддерживает разработку подходов к анализу новых ЛФ с использованием подхода QbD, в котором предполагается, что качество является результатом преднамеренного проектирования. Практическая реализация подхода QbD возможна при интеграции трех взаимодополняющих руководств ICH Q8–10. С помощью данных нормативных документов может быть построена надежная система обеспечения качества для сложных ЛФ, в том числе содержащих ЛНЧ для мРНК.

Цель работы — систематический анализ существующих методологических подходов к определению, оценке и контролю качества липидных наночастиц для мРНК и определение критических показателей качества согласно требованиям руководств ICH Q8(R2), Q9, Q10.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе работы был проведен анализ нормативных требований и методологических подходов к определению критических показателей качества (Critical Quality Attributes, CQA) ЛНЧ для мРНК в рамках подхода «концепция встроенного качества», интегрирующего требования руководств Международного совета по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для человека (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH) — ICH Q8, ICH Q9², ICH Q10³. Анализ руководств проводился с использованием актуализированных обучающих материалов, опубликованных на официальном сайте ICH⁴.

С целью количественной оценки рисков, связанных с качеством ЛНЧ, был применен рекомендованный ICH Q9 метод анализа характера, влияния и критичности отказов (Failure Mode and Effects and Criticality Analysis, FMECA-метод). В рамках данного анализа каждый потенциальный критический показатель оценивали по трем параметрам:

1) «Значимость (Severity, S) несоответствия», выставляемая по 5-балльной шкале, где высшему баллу соответствует прямое влияние на эффективность и безопасность ЛНЧ;

2) «Вероятность (Occurrence, О) возникновения несоответствия» по 5-балльной шкале, где высший балл характеризует наибольшую вероятность возникновения;

3) «Вероятность (Detectability, D) обнаружения несоответствия» по 5-балльной шкале, где высшему баллу соответствует низкая вероятность обнаружения отклонения при существующих методах контроля.

Для каждого потенциального критического показателя рассчитывали приоритетное число риска (Risk Priority Number, RPN) как произведение трех параметров (RPN=S×O×D). Показатели с RPN≥50 классифицировали как CQA.

Для систематизации факторов, которые непосредственно влияют на CQA ЛНЧ для мРНК, была использована диаграмма Исикавы (причинно-следственная диаграмма), рекомендованная ICH Q9 как один из признанных инструментов управления рисками для качества и позволяющий визуализировать множественные потенциальные причины, а также структурировать процесс идентификации рисков [8][9].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный систематический анализ руководств ICH Q8, Q9, Q10 применительно к ЛНЧ для мРНК выявил ключевые закономерности определения и оценки CQA. Первым этапом разработки стратегии контроля качества любой ЛФ является определение целевого профиля качества продукта (Quality Target Product Profile, QTPP), что предшествует определению CQA.

В результате анализа литературы и существующих руководств по качеству было установлено, что исходя из QTPP к CQA ЛНЧ для мРНК могут быть отнесены такие показатели, как индекс полидисперсности, средний диаметр частиц, эффективность инкапсуляции нуклеиновых кислот, содержание мРНК, поверхностный заряд частиц, липидный состав. Каждый из перечисленных показателей был проанализирован с точки зрения его влияния на безопасность и эффективность конечного продукта, что позволило обосновать необходимость включения вышеуказанных показателей в стратегию контроля качества ЛНЧ для мРНК.

Применение методов анализа рисков в соответствии с руководящими принципами ICH Q9 продемонстрировало, что не все показатели качества имеют одинаковую степень критичности. С использованием FMECA-метода, учитывающего серьезность последствий, вероятность возникновения и обнаружения несоответствий, была проведена количественная оценка рисков для каждого потенциального критического показателя, результаты которой представлены в таблице 1. Наиболее высокие показатели риска (RPN≥50), классифицированные как CQA, были получены для эффективности инкапсуляции, размера частиц, содержания мРНК, индекса полидисперсности и липидного состава ЛНЧ.

Для таких показателей качества, как «pH готового раствора» и «Осмоляльность», установлены низкие значения RPN, поскольку влияние данных показателей на эффективность и безо­пасность ЛФ хорошо изучено и может быть легко скорректировано на заключительных этапах производства.

Построение диаграммы Исикавы для постоянной идентификации рисков, влияющих на установленные CQA, позволило структурировать факторы, влияющие на качество ЛНЧ, и выявить наиболее значимые источники отклонений. На рисунке 1 представлена диаграмма Исикавы, где проиллюстрированы потенциальные причины возникновения несоответствия спецификации качества ЛНЧ для мРНК, сгруппированные по пяти категориям: «Технологический процесс», «Оборудование», «Исходные материалы», «Условия проведения работ» и «Персонал».

На основании идентифицированных CQA нами была разработана трехуровневая стратегия контроля качества, охватывающая все этапы жизненного цикла продукта начиная с входного контроля качества сырья. Традиционные подходы к контролю качества ориентированы на оценку профиля примесей и количественное определение исходных компонентов, что может быть недостаточным для последующего получения качественных ЛНЧ для мРНК. В связи с этим рекомендуется также проведение испытаний для оценки функциональных характеристик ионизируемых липидов, в частности, оценки способности к протонированию при физиологических условиях среды путем определения pKa ионизируемых липидов с помощью потенциометрического титрования.

Второй этап стратегии — постадийный (операционный) контроль этапов технологических процессов, в рамках которого проводится контроль как вспомогательных реактивов и растворов, так и растворов липидов. Кроме того, данный этап включает в себя регулярный мониторинг работоспособности и квалификацию оборудования. Идеальным решением для установления отклонений в режиме реального времени является использование технологий процессного анализа (Process Analytical Technology, PAT), упоминаемое в ICH Q9. Применение PAT позволяет осуществлять контроль критических параметров путем внедрения его отдельных элементов на участки производственных линий, что может обеспечить значительное сокращение времени между производством ЛНЧ и выявлением несоответствий требованиям ICH.

На заключительном этапе стратегии проводится финальный выпускающий контроль, в ходе которого могут быть обнаружены несоответствия конечного продукта требованиям ICH, проводится верификация производственного процесса и подтверждение того, что он происходил в условиях установленной области проектных решений (Design Space).

На основании проведенного анализа руководств ICH Q8–10, систематизации выявленных рисков технологического процесса, а также идентифицированных CQA с помощью PAT, нами были сформулированы ключевые требования к выпускающему контролю ЛНЧ, что позволит подтвердить их соответствие целевому профилю качества продукта (QTPP).

Поскольку ЛНЧ для мРНК представляют собой сложные многокомпонентные структуры, для их анализа необходима комбинация методов, способных охарактеризовать их физико-­химические свойства. Рекомендуемые показатели, среди которых CQA для ЛНЧ с мРНК и общие тесты для конечной ЛФ, а также методы их оценки в соответствии с действующими нормативными документами, представлены в таблице 2.

Одним из ключевых выводов является то, что объем и частота выпускающего контроля ЛНЧ для мРНК должны быть определены на основе оценки рисков — для показателей с высоким значением RPN контроль необходимо проводить для каждой производственной серии, для показателей с низким значением RPN может быть допустим периодический контроль.

Стоит отметить, что аналитические методики, применяемые для контроля качества ЛНЧ для мРНК, должны быть валидированы в соответствии с требованиями ICH Q2(R2)⁵, т.к. стандартные фармакопейные методики, разработанные для анализа низкомолекулярных соединений, могут давать недостоверные результаты в отношении коллоидных систем ввиду наличия матричных эффектов. Например, при использовании метода спектрофлуориметрии для оценки эффективности инкапсуляции мРНК в ЛНЧ следует учитывать, что наличие ЛНЧ может вызывать сдвиг длины волны возбуждения и эмиссии флуофора, что приводит к получению недостоверных результатов в отношении доли неинкапсулированной мРНК⁶.

Данный трехуровневый подход позволит обеспечить не только качество конечного продукта, но и воспроизводимость от серии к серии, что является необходимым условием для коммерческого производства ЛНЧ для мРНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное систематическое исследование, основанное на изучении требований руководств ICH Q8, Q9, Q10, позволило выполнить анализ методологических подходов к определению, оценке и контролю CQA ЛНЧ для мРНК, активно применяемых в качестве носителя ЛС.

В работе предложен и апробирован подход, сочетающий в себе два инструмента управления рисками, рекомендованных ICH Q9: диаграмма Исикавы для систематической идентификации факторов риска и FMECA-метод для их количественной оценки. Использование FMECA-метода с расчетом RPN позволило ранжировать показатели качества ЛНЧ по степени критичности их влияния на достижение целевых показателей качества. Количественный анализ продемонстрировал, что наиболее высокие значения RPN отмечаются у таких показателей, как «Эффективность инкапсуляции», «Размер частиц», «Индекс полидисперсности», «Липидный состав». Показатели «pH» и «Осмоляльность» не были отнесены к критическим.

На основании идентифицированных CQA была разработана трехуровневая стратегия качества, охватывающая все этапы производства ЛНЧ для мРНК. Предложенная стратегия контроля качества основана на анализе нормативных требований, изложенных в руководствах ICH Q8–10, и не была апробирована экспериментально на технологической линии получения ЛНЧ для мРНК.

Полученные результаты определяют актуальность разработки протоколов принятия решений (decision trees) для ситуаций, когда один или несколько CQA выходят за пределы норм, указанных в спецификации, что позволит персоналу оперативно реагировать на отклонения.

Предложенные методологические подходы, со­четающие FMECA-метод и диаграмму Исикавы, в дальнейшем могут быть адаптированы под конкретные задачи, позволяя идентифицировать критические параметры процессов получения ЛНЧ для мРНК. Такой подход, ориентированный на глубокое понимание изучаемого продукта и технологического процесса, может быть залогом успешной разработки и производства эффективных и безопасных ЛС.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: У.А. Ефремова — выполнение работы, написание текста рукописи, формулировка выводов; И.И. Тернинко — концепция работы, участие в формулировании выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации.

Использование генеративного искусственного интеллекта. Авторы заявляют, что не использовали генеративный ИИ при подготовке рукописи.

Author contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Ulyana A.
Efremova performed the experiments, drafted the manuscript, and formulated the conclusions. Inna I. Terninko conceptualized the study, partici­pated in formulating the conclusions, and approved the final version of the manuscript for publication.

Use of generative artificial intelligence. The authors declare that no generative AI was used during the preparation of this manuscript.