Определение бета-глюканов и пептидогликанов в лекарственных препаратах

ВВЕДЕНИЕ

Бета-глюканы и пептидогликаны, наряду с бактериальными эндотоксинами (БЭ), являются основными маркерами микробиологического загрязнения лекарственных препаратов. И если методы определения БЭ широко известны, утверждены ведущими фармакопеями мира¹, постоянно совершенствуются и позволяют поддерживать высокий уровень безопасности в отношении данной пирогенной примеси, то мониторинг за примесями бета-глюканов и пептидогликанов практически не регламентирован. Неконтролируемое присутствие этих примесей в парентеральных препаратах может увеличить риск их применения. Даже если присутствие бета-глюканов и пептидогликанов не приводит к повышению температуры тела, они представляют собой пирогенные загрязнения, которые при взаимодействии с кровью или ее клеточными элементами способны вызывать нарушение гомеостаза и провоспалительную цитокиновую реакцию² [1].

Бета-глюканы или (1→3)-β-D-глюканы (БГ) представляют собой полисахариды из мономеров D-глюкозы, в которых мономерные звенья глюкозы связаны в полимерную структуру через β-1,4 и β-1,3 связи. БГ присутствуют в клеточных стенках широкого спектра прокариотических и эукариотических организмов, включая дрожжи, грибы, морские водоросли и злаки³. БГ являются потенциальными загрязнителями в фармацевтических продуктах, выделяющихся, например, из фильтров на основе целлюлозы или из фармацевтического сырья. Они схожи с БЭ тем, что являются крупными молекулами, которые также могут вызывать воспалительную реакцию [2].

На долю пептидогликанов в клеточной стенке грамположительных бактерий приходится 40%, у грамотрицательных — 1–10%⁴. Причиной пристального внимания к ПГ послужили многократные случаи асептического перитонита, связанные с применением препаратов икодекстрина в 2001–2003 г. Тогда у пациентов, находящихся на перитониальном диализе, наблюдались лихорадка и боли в животе. В связи с этим был проведен добровольный всемирный отзыв нескольких сотен партий раствора для диализа, содержащего икодекстрин. Было обнаружено, что икодекстрин загрязнен термофильным ацидофильным грамположительным микроорганизмом Alicyclobacillus acidocaldarius, который и являлся источником ПГ. Нагревание и стерильная фильтрация устранили бактерии, но не ПГ, загрязнившие конечный продукт [3–5].

В результате анализа накопленной информации было установлено, что БГ и ПГ, которые могут образовываться в лекарственных препаратах на стадии их производства, могут потенцировать воздействие эндотоксинов, а также действие других иммунологически активных примесей. Именно поэтому некоторыми регуляторными органами, Управлением по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (Food and Drug Administration (FDA))⁵ было предложено минимизировать уровни ПГ в терапевтических белковых препаратах для снижения рисков возникновения иммунного ответа [5][6].

Несмотря на отсутствие гармонизированного подхода к обнаружению БГ и ПГ в лекарственных препаратах, в последнее время уделяется внимание мониторингу наличия данных примесей, а также установлению норм их предельного содержания для безопасного применения лекарственных препаратов [6]. Существует несколько подходов к нормированию БГ и ПГ:

1) согласно научным данным их эндогенный уровень у здорового человека составляет менее 60 пг/мл;

2) клинические исследования показали, что однократная доза 500 нг создает концентрацию в плазме около 100 пг/мл;

3) другие подходы основаны на расчетах, в которых учитываются индивидуальные характеристики препарата, путь и частота его введения, объем циркулирующей крови и вес пациента [2][6];

4) в испытании на кроликах установлено, что минимальная пирогенная доза ПГ составляет 7,3 мкг/кг, в случае с БЭ — 0,0027 мкг/кг [4].

Методы определения БГ и ПГ могут быть использованы для контроля загрязнений диализных растворов, фармацевтических и биологических препаратов, медицинских устройств или продуктов генной инженерии и т.д., а также для оценки микробиологического загрязнения воды⁶.

Для определения БГ и ПГ в фармацевтической практике используют два типа реактивов, которые реагируют на такие примеси: лизат амебоцитов и реактив из плазмы личинок шелкопряда.

Метод 1. Качественное определение с помощью лизата амебоцитов. Лизат амебоцитов, содержащий два белка (фактор C и фактор G), пригоден для качественного определения примесей БЭ и БГ в лекарственных препаратах. Реактив запускает активацию протеолитического каскада в ответ на присутствие БЭ и БГ [6]. Получив положительный результат, необходимо уточнить, на какой тип примеси реактив отреагировал. Для этого следует повторить опыт, используя реактив лизата амебоцитов, восстановленный эндотоксин-специфическим буфером, в составе которого присутствует карбоксиметилированный курдлан, блокирующий влияние фактора G, оставляя способность фактора C специфически реагировать только на БЭ. Если в повторном испытании будет получен положительный результат, то можно сделать вывод, что в образце препарата присутствуют БЭ в определяемом количестве, а в случае, если результат отрицательный, БЭ в образце отсутствуют, а результат первого испытания говорит о наличии БГ (рис. 1) [7].

Метод 2. Количественное определение с помощью лизата амебоцитов. Для обнаружения БГ используют реактив на основе лизата амебоцитов с удаленным фактором С. Такой реактив доступен под разными торговыми наименованиями: Glucatell (Associates of Cape Cod, США), Endosafe®-PTS™ Glucan Assay (Charles River, США) и др. Методика определения и оценка результатов аналогичны хромогенному методу определения БЭ [6]. Фактор G лизата амебоцитов активирует путь прокоагуляции ферментов в присутствии БГ, что приводит к расщеплению хромогенного пептидного субстрата паpа-нитроанилина [8][9]. Количество БГ определяют кинетическим методом по скорости изменения интенсивности окраски (интенсивность окраски определяют по поглощению при длине волны 405 нм). В качестве альтернативы используют метод по конечной точке, согласно которому добавление диазореагентов позволяет остановить реакцию, после чего выполняют измерение поглощения при длине волны 540–550 нм⁷ [10].

Метод 3. Качественное и количественное определение с реактивом, содержащим плазму личинок шелкопряда. Действие специального реактива Silkworm Larvae Plasma (SLP) основано на механизме самозащиты гемолимфы шелкопряда вида Bombyx mori, где в присутствии БГ и ПГ запускается сигнальный каскад и активируется профенолоксидаза. Эта ферментативная система участвует в образовании меланина, который запускает защитные механизмы в организме насекомого. Реактив SLP позволяет обнаруживать компоненты клеточных стенок бактерий и грибов по увеличению концентрации пигмента меланина в реакционной смеси⁸.

Методы 2 и 3 основаны на схожих принципах действия, но для их реализации используются разные реактивы⁹ (табл. 1). Все три вышеуказанных метода на практике используются применительно к лекарственным препаратам с потенциальным загрязнением БГ и (или) ПГ.

Цель работы — оценка практической значимости существующих методов обнаружения бета-глюканов и пептидогликанов в лекарственных препаратах. Задачи работы — оценка эффективности и воспроизводимости методик с использованием лизата амебоцитов и реактива из плазмы личинок шелкопряда.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполняли с применением суховоздушного нагревательного прибора (термоблока), фотоколориметра BioТek EL×800 и программы для обработки результатов — программная среда R (4.4.2 (2024-10-31 ucrt) “Pile of Leaves”)¹⁰.

В качестве тест-объектов были выбраны лекарственные препараты, в которых случайным образом были обнаружены или могли бы содержаться БГ и ПГ в качестве технологической или родственной примеси. Препарат «Бупивакаин» был выбран в качестве исследуемого объекта в связи с получением положительного результата в ранее выполненных испытаниях гель-тромб теста в разведении, равном ½ максимально допустимого разведения. Препарат «Икодекстрин» может содержать родственные примеси ПГ, поэтому имеется нормативное требование с указанием предельного значения ПГ, которое следует контролировать. Для исследования применяли методики, охарактеризованные в таблице 2.

Для исследования методом 1 использовали реактив лизата амебоцитов, восстановленный эндотоксин-специфичным буфером (реактив с фактором С); полученные данные сравнивали с данными испытаний, выполненных без использования блокирующего буфера (реактив с факторами С и G).

Испытание по методу 2 выполняли аналогично испытанию по хромогенному кинетическому методу определения БЭ. Для построения стандартной калибровочной кривой готовили разведения контрольного стандарта бета-глюкана с концентрациями 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 пг/мл (КСБ₁–КСБ₆ ). В лунки микропланшета помещали по 25 мкл испытуемых проб, к которым добавляли 100 мкл восстановленного реактива лизата с фактором G (Glucatell-реактив). Оптическую плотность растворов измеряли на фотоколориметре.

По методу 3 выполняли качественную и количественную оценку содержания ПГ в лекарственном препарате «Икодекстрин». Для этого использовали реакционные пробирки с лиофилизированным SLP-реактивом, в которые перед испытанием добавляли по 100 мкл растворителя и перемешивали в течение нескольких секунд. Для качественного анализа в эти же пробирки добавляли исследуемые растворы и инкубировали в течение 60 мин при температуре 30 °С. Исследуемыми растворами являлись (табл. 3):

• икодекстрин в испытуемом разведении для определения наличия ПГ — (П–);
• икодекстрин в испытуемом разведении с ПГ в количестве, равном норме предельного содержания — (П+);
• растворы стандарта ПГ в разных концентрациях для получения эталонной шкалы цвета (качественный анализ) и построению стандартной калибровочной кривой (количественный анализ) — (КСП₁ — КСП₅ );
• вода для теста, определяющего БЭ (вода для БЭТ) в качестве отрицательного контроля — (К–).

По окончании инкубации визуально оценивали результаты. Бесцветные растворы принимали за отрицательный результат (отсутствуют ПГ и БГ), окрашенные — за положительный результат. Сравнивали интенсивность окрашенных растворов: чем более насыщенный фиолетовый цвет раствора, тем выше концентрация ПГ и БГ.

Для количественного анализа использовали такие же испытуемые растворы, как и для качественного (табл. 3), с тем различием, что конечная концентрация ПГ в растворе с маркировкой (П+) составляла 1000 пг/мл и соответствовала среднему значению концентраций растворов КСП₁–КСП₅, использованных для построения стандартной калибровочной кривой. Из пробирок в лунки микропланшета переносили по 50 мкл каждого раствора, затем восстановленный реактив извлекали из пробирок, объединяли содержимое в апирогенном флаконе и добавляли к испытуемым пробам. Выполняли измерение оптической плотности относительно времени реакции. Содержание ПГ определяли по стандартной калибровочной кривой растворов КСП₁–КСП₅.

Результаты испытаний количественного определения методов 2 и 3 считали достоверными при соблюдении следующих условий¹¹:

1) коэффициент корреляции стандартной калибровочной кривой, построенной на основании данных растворов КСБ₁–КСБ₆, КСП₁–КСП₅, ≥ 0,980;

2) концентрация КСП в растворе (П+) (положительный контроль) составляет 50–200% от номинальной величины;

3) результат, полученный для воды БЭТ (К–), не превышает значения наименьшей концентрации КСБ или КСП на стандартной калибровочной кривой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для того чтобы установить причину положительной реакции лизата амебоцитов с препаратом «Бупивакаин», было выполнено испытание по методу 1. В испытании с лизатом амебоцитов, содержащим факторы С и G и, соответственно, реагирующим на БГ и БЭ, подтверждено наличие плотного геля во всех пробах с препаратом, что свидетельствовало о наличии пирогенных примесей. В повторных испытаниях с использованием лизата, содержащего только фактор С и, соответственно, дающего реакцию только в присутствии БЭ, получены отрицательные результаты для растворов (П–). Сравнив данные двух испытаний, авторы сделали однозначное заключение об отсутствии БЭ и наличии БГ в лекарственном препарате «Бупивакаин».

На основании полученных данных следующее испытание, выполненное по методу 2, позволило подтвердить наличие БГ и определить их количество в препарате «Бупивакаин». Параметр, характеризующий искомое количество БГ в растворе лекарственного препарата, разведенного в 20 раз, составил более 100 пг/мл, что выходит за пределы стандартной калибровочной кривой (рис. 2). Таким образом, содержание БГ в препарате «Бупивакаин» составляет более 2000 пг/мл (100 пг/мл×кратность разведения 1:20).

При использовании растворов контрольного стандарта ПГ различной концентрации методом № 3 получена эталонная цветовая шкала (рис. 3). Подтверждена чувствительность SLP-реактива, о чем свидетельствуют заметные изменения интенсивности фиолетового окрашивания растворов с увеличением концентрации ПГ. При визуальной фиксации результатов эксперимента установлено, что содержание ПГ в растворах испытуемого препарата икодекстрина (П–) меньше наименьшего значения концентрации стандарта КСП₅ (<10 пг/мл). Соответственно, в исходном растворе препарата содержание примесей не превышает 200 пг/мл (10 пг/мл×кратность разведения 1:20). Цвет раствора в пробирке (П+) соответствовал градации цвета, представленной на шкале, что означает, что в составе раствора препарата, к которому добавлен контрольный стандарт ПГ, отсутствовали компоненты, препятствующие взаимодействию с реактивом (рис. 4). Таким образом, вероятность возникновения ложных результатов в данном испытании была исключена.

В растворе икодекстрина, согласно результатам количественного анализа, ПГ не обнаружены в количестве, превышающем нормируемое значение — «не более 200 пг/мл» (рис. 5). Для раствора положительного контроля (П+) содержание добавленного стандарта ПГ составило 59% от установленного значения, что соответствует критериям приемлемости (50–200%).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выбор метода определения БГ и (или) ПГ зависит от целей их определения и состава лекарственного препарата.

Используемые методы и реактивы позволили провести мониторинг наличия БГ и ПГ в исследуемых лекарственных препаратах. Несмотря на то что для препарата «Бупивакаин» не предусмотрено требование к содержанию БГ, данную примесь обнаружили в процессе определения БЭ в препарате с помощью реактива лизата амебоцитов. Выявленное количество БГ (более 2000 пг/мл) выше нормируемого значения, что нежелательно из-за возможных иммунных реакций.

Примесь ПГ эффективно определяли с помощью реактива из плазмы личинок шелкопряда. Последовательные качественные и количественные исследования подтвердили отсутствие ПГ как потенциального источника загрязнений в препарате «Икодекстрин».

При расширении области применения методов определения БГ и ПГ надежность контроля качества лекарственных препаратов может быть существенно повышена, что позволит избежать нежелательных иммунных реакций.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад авторов распределен следующим образом: О.В. Шаповалова — планирование исследования, получение первичных экспериментальных результатов, сбор литературы, написание, оформление и редактирование текста рукописи; Н.П. Неугодова — обоснование концепции исследования, анализ и систематизация экспериментальных данных, критический пересмотр текста рукописи и утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

Благодарности. Авторы выражают особую благодарность и признательность компаниям ООО «Альгимед» и ООО «ЛАЛ-Консалтинг ЛТД» за предоставленную информационную поддержку и техническую помощь.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Olga V. Shapovalova planned the research, obtained primary experimental results, collected literature, drafted, formatted, and edited the manuscript. Natalia P. Neugodova substantiated the research concept, analysed and systematised experimental data, critically revised the manuscript text and approved the final version for publication.

Acknowledgements. The authors would like to thank OOO Algimed and OOO LAL Consulting Ltd. for their informational assistance and technical support.