Определение активности ванкомицина микробиологическими методами

ВВЕДЕНИЕ

Ванкомицин — трициклический гликопептидный антибиотик, продуцируемый Amycolatopsis orientalis, выделен в 1953 г. Э. Корнфельдом, является первым антибиотиком класса гликопептидов [1]. Ванкомицин активен в отношении грамположительных аэробных и анаэробных микроорганизмов, включая метицил-резистентный золотистый стафилококк и метицил-резистентный эпидермальный стафилококк, механизм его действия основан на нарушении синтеза клеточной стенки бактерий¹.

В Российской Федерации зарегистрировано 10 препаратов ванкомицина различных производителей². Ванкомицин применяется в форме порошка или лиофилизата для приготовления раствора для инфузий и приема внутрь. Пероральные препараты ванкомицина назначают для лечения псевдомембранозного колита, вызванного Clostridium difficile³. Эффективность препаратов антибиотиков определяется антимикробной активностью действующего вещества.

Ванкомицин относится к антибиотикам, получаемым путем биосинтеза, которые не стандартизуются по активности химическими или физико-химическими методами. Для таких соединений предусмотрено два фармакопейных биологических испытания: метод диффузии в агар (МДА) и турбидиметрический метод (ТМ)⁴. МДА основан на диффузии антибиотика в чашке Петри через слой агаризованной питательной среды, которая предварительно засеяна тест-культурой микроорганизма, чувствительной к исследуемому антибиотику; ТМ — на угнетении роста тест-микроорганизма в растворе антибиотика, помещенного в жидкую питательную среду. Основой обоих методов является линейная зависимость степени угнетения роста тест-микроорганизма от логарифма концентрации антибиотика в установленном экспериментально диапазоне концентраций растворов антибиотиков. При определении активности антибиотика микробиологическими методами используется принцип сравнения со стандартным образцом (международные стандартные образцы (МСО) либо аттестованные по отношению к МСО), т.е. предполагается, что исследуемое количество испытуемого антибиотика вызывает такой же биологический эффект, как и определенное количество стандартного образца [2].

При анализе парентеральных препаратов, применяемых в виде растворов, ТМ имеет ряд преимуществ по сравнению с МДА как более чувствительный к низким концентрациям, более экономичный и не требующий длительного времени для получения результатов (результаты эксперимента по методу МДА могут быть получены не ранее 18 ч после постановки опыта). Методики с использованием ТМ как более эффективные и экономичные активно разрабатываются и внедряются в фармацевтическую практику не только для анализа природных антимикробных соединений, но и для полусинтетических и синтетических антибиотиков различной химической природы [3–9].

В Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ) XIV изд. для оценки антимикробной активности антибиотиков рекомендован один метод — МДА⁵. В ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России были отработаны условия определения (методика) активности ванкомицина с использованием ТМ, для подтверждения достоверности полученных результатов необходимо провести сравнительный анализ с результатами метода МДА.

Цель работы — оценка результатов определения активности ванкомицина, полученных турбидиметрическим методом, с целью использования его в качестве альтернативного методу диффузии в агар.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследований был выбран образец лекарственного препарата ванкомицина: порошок для приготовления раствора для инфузий и приема внутрь, дозировка 1000 мг. Данная лекарственная форма представляет собой рассыпку стерильной субстанции ванкомицина гидрохлорида. В качестве стандартного образца (СО) использовали СО ванкомицина гидрохлорида EP CRS banth 4 для микробиологических анализов с активностью 109620 ЕД на виалу.

Условия проведения испытания с использованием метода диффузии в агар соответствовали ГФ РФ⁶: тест-микроорганизм, посевная доза: Васillus subtilis NCTC 10400/АТСС 6633 — Becton Dickinson France S.A.S., 20 млн спор на 1 мл среды; питательная среда для нижнего слоя в чашке Петри — 15 мл, питательная среда для верхнего слоя — 7 мл, тест-культура вносится только в верхний слой, растворитель для приготовления основных растворов — вода очищенная стерильная, полученная на установке Milli-Q (Merk, Германия), растворитель для рабочих растворов — стерильный буфер № 4. Основные растворы СО и испытуемого готовили с концентрацией 1000 ЕД/мл, рабочие растворы: S₁, U₁ — 50, S₂, U₂ — 100 и S₃, U₃ — 200 ЕД/мг. Рабочие растворы СО обозначены как S₁, S₂ и S_3, рабочие растворы испытуемого — U₁ U₂, U₃. На одну повторность использовали 6 чашек Петри с питательной средой, инкубированной тест-микроорганизмом. В сформированные с помощью стерильного стального сверла в толще агара 6 лунок дозатором Biohit вносили по 100 мкл рабочих растворов таким образом, чтобы растворы с максимальными концентрациями не соприкасались между собой: S₁, U₃, S₂, U₁, S₃, U₂. Подготовленные чашки Петри с антибиотиком помещали в термостат Инкубатор BD-400 (Binder GmbH, Германия) на 18 ч и инкубировали при температуре 36±1 °С. Через 18 ч замеряли диаметры зон угнетения на специальном приборе Readbiotic (PBI International S.p.A., Италия) c точностью до 0,1 мм. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ РФ⁷.

Для испытания по методике с использованием турбидиметрического метода перечень растворителей и тест-микроорганизм использовали в соответствии с рекомендациями Европейской фармакопеи⁸: тест-микроорганизм — Staphylococcus aureus NCTC 7447/АТСС 6538P (Becton Dickinson France S.A.S.), растворитель для приготовления — стерильная вода очищенная, растворитель для приготовления рабочих растворов — стерильный буферный раствор с рН 8,0. Основные растворы стандартного и испытуемого образцов готовили так же, как и при испытании методом диффузии в агар. Эмпирически были подобраны рабочие концентрации растворов антибиотика 4, 6, 9 ЕД/мл (условия подбора — минимизация времени инкубирования и линейная зависимость «доза–эффект»). Для анализа использовали жидкую питательную среду для турбидиметрии следующего состава: панкреатический гидролизат казеина 6,0 г; гидролизат мяса ферментативный 1,5 г; дрожжевой экстракт 1,5 г; хлорид натрия 3,5 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,68 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,32 г; вода очищенная до 1 л, рН после стерилизации 7,2. Дополнительно в состав питательной среды для турбидиметрии введена глюкоза (стерильный 40% раствор) в соотношении 1:400 [10].

В пробирки объемом 20 мл помещали 9 мл питательной среды, инокулированной тест-микроорганизмом, мутность микробной суспензии которого первоначально устанавливали по шкале МакФарланда (2,7) с помощью денситометра DEN-1 McFarland Densitometer (BioSan SIA, Латвия), затем разводили до концентрации микроорганизмов ~10⁶ КОЕ/мл стерильным буферным раствором с рН 8,0. В пробирки вносили по 1 мл растворов исследуемого образца и растворов СО каждой концентрации в трех повторностях (одна пробирка, одна концентрация). В качестве контрольных использовали растворы с питательной средой и буфером (рН 8,0). Образцы инкубировали при температуре 36±1 °С в течение 5 ч в условиях постоянной аэрации при перемешивании в термошейкере Excella E-24/24R (NEW Brunswick Scientific Co., США). Для прекращения роста микроорганизмов после завершения инкубации в каждую пробирку с исследуемым образцом вводили раствор формальдегида 12% (PanReac AppliChem, Испания) по 0,5 мл. Через 30 мин измеряли оптическую плотность всех исследуемых растворов на спектрофотометре Agilent 8453 при длине волны 530 нм.

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с ГФ РФ⁹. Способ статистической обработки данных, полученных по методикам МДА и ТМ, основан на модели параллельных линий, требующей соблюдения ряда условий¹⁰: постоянное отношение двух последовательных доз, линейная зависимость отклика (диаметр зоны угнетения в случае МДА и оптическая плотность в случае ТМ) и логарифма концентрации антибиотика (доза). При этом линии откликов для испытуемых растворов и растворов СО должны быть параллельны. В обоих экспериментах анализы растворов СО и рабочих растворов ванкомицина выполняли одновременно и при идентичных условиях. Для испытания (МДА и ТМ) отбирали по 5 навесок с точностью до 0,0001 г испытуемого образца, каждую навеску анализировали в трех повторностях. Каждый полученный результат проверяли на пригодность методом дисперсионного анализа на платформе программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методами ДМА и ТМ получено по пять результатов активности ванкомицина. Подтверждение модели параллельных линий проведено путем оценки показателей «непараллельность» и «регрессия». На основании полученных данных рассчитаны дисперсии с использованием суммы квадратов источников вариации (постановка опыта, непараллельность, дозозависимость). Значимость различий дисперсии оценивалась по критерию Фишера. Для оценки непараллельности должна быть подтверждена незначимость (значение критерия Фишера должно быть меньше критического) при уровне значимости р=0,05, для оценки регрессии подтверждается значимость (значение критерия Фишера должно быть больше критического) при р=0,01. Результаты дисперсионного анализа для параметров «непараллельность» и «регрессия» приведены в таблице 1.

Расчет основных показателей дисперсионного анализа «непараллельность» и «регрессия» результатов, полученных для испытуемых и стандартных растворов, подтвердил равноценность полученных данных («логарифм дозы» — «эффект» — линейная зависимость, линии регрессии, полученной для испытуемых рабочих растворов и стандартных рабочих растворов, параллельны). Незначимость различий средних значений оценивали по критерию Стьюдента в соответствии с ГФ РФ¹¹. Предварительно проверяли наличие статистически значимого различия между дисперсиями обеих выборок (табл. 2).

Расхождение между средними значениями статистически незначимо, полученные результаты можно рассматривать как принадлежащие к одной генеральной совокупности. Дополнительно по критерию Бартлетта было подтверждено, что дисперсии двух выборок принадлежат к одной генеральной совокупности (рассчитанное значение χ² 1,17<3,84 (табличное значение) при Р=95%, степень свободы f=1). Следовательно, результаты испытаний могут использоваться равнозначно. Относительная неопределенность средних результатов ε_(ТМ) в случае результатов, полученных по методу ТМ, составляет 1,5%, что больше, чем ε_(МДА) 0,77%. Систематическая погрешность методик, рассчитанная на основе опорного значения 1000 ЕД/мг, в случае ТМ δ=4,7%, в случае МДА δ=0,97%. Результаты статистической оценки двух методик представлены в таблице 3.

Согласно статистическим расчетам прецизионность методики МДА значительно выше, чем методики ТМ. Такие результаты свидетельствуют о более высокой вариабельности методики ТМ, что может быть связано с недостаточной отработкой стандартных операций выполнения испытания, например разброс количества пробы при внесении инокулята в питательную среду. Незначительные отклонения могут существенным образом повлиять на конечные результаты эксперимента. Минимизация отклонений может быть достигнута путем разработки стандартных операционных процедур и контроля их выполнения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Турбидиметрический метод может рассматриваться в качестве альтернативного метода определения активности ванкомицина. Однако для минимизации влияния человеческого фактора и внешних условий испытания необходимо предварительно разработать стандартные операционные процедуры выполнения работ по методике ТМ и контролировать их соблюдение.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.И. Кулешова — концепция, анализ данных, написание текста рукописи, подбор литературы; Г.Ю. Романюк — выполнение испытаний, анализ данных; Д.А. Шахова — выполнение испытаний, работа с питательной средой, анализ данных; С.А. Лисунова — работа с тест-микроорганизмами, выполнение испытаний; С.А. Процак — анализ данных, сбор литературы.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Svetlana I. Kuleshova conceptualized the study, analyzed the data, drafted the manuscript and selected the references. Galina Yu. Romanyuk performed the tests and analyzed the data. Daria A. Shakhova performed the tests, processed culture medium and analyzed the data. Svetlana A. Lisunova worked with test microorganisms and performed the tests. Svetlana A. Protsak analyzed the data and collected the references.