Кулешова Светлана Ивановна, канд. биол. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Svetlana I. Kuleshova, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Романюк Галина Юрьевна
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Galina Yu. Romanyuk
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Шахова Дарья Алексеевна
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Daria A. Shakhova
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Лисунова Светлана Анатольевна
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Svetlana A. Lisunova
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Процак Светлана Александровна
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Svetlana A. Protsak
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
ВВЕДЕНИЕ. Ванкомицин — трициклический гликопептидный антибиотик, продуцируемый Amycolatopsis orientalis. Для определения активности антибиотиков, получаемых путем биосинтеза, в частности ванкомицина, для которых не предусмотрены химические или физико-химические методы определения активного соединения, применяют два фармакопейных метода: метод диффузии в агар (МДА) и турбидиметрический метод (ТМ). Оба метода основаны на угнетении роста тест-микроорганизма в соответствующих условиях эксперимента. Для оценки активности парентеральных препаратов, применяемых в виде растворов, турбидиметрический метод имеет ряд преимуществ по сравнению с методом диффузии в агар как более чувствительный к низким концентрациям, более экономичный и не требующий длительного периода времени для получения результатов. Государственной фармакопеей Российской Федерации предусмотрен один метод определения активности антибиотиков — метод диффузии в агар. Ранее была разработана методика определения активности ванкомицина турбидиметрическим методом.
ЦЕЛЬ. Оценка результатов определения активности ванкомицина, полученных турбидиметрическим методом, с целью использования его в качестве альтернативного методу диффузии в агар.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Условия проведения испытания методики с использованием МДА соответствовали условиям, приведенным в Государственной фармакопее Российской Федерации: тест-микроорганизм, посевная доза: Васillus subtilis NCTC 10400/АТСС 6633 — Becton Dickinson France S.A.S., 20 млн спор на 1 мл среды, для приготовления основных растворов — стерильная вода очищенная, растворитель для рабочих растворов — стерильный буфер № 4. Методика ТМ теста — микроорганизм Staphylococcus aureus NCTC 7447/АТСС 6538P — Becton Dickinson France S.A.S., растворитель для приготовления — стерильная вода очищенная, растворитель для приготовления рабочих растворов — стерильный буферный раствор с рН 8,0 (заимствовано из Европейской фармакопеи). Использовали питательную среду, разработанную в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России для определения активности аминогликозидов. Определение активности проводили сравнением со стандартным образцом ванкомицина гидрохлорида EP CRS banth 4 для микробиологических анализов. Для испытания по каждому методу (МДА и ТМ) отбирали по 5 навесок с точностью до 0,0001 г испытуемого образца, каждую навеску анализировали в трех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Расчет основных параметров дисперсионного анализа «непараллельность» и «регрессия» результатов испытуемых и стандартных растворов подтвердил равноценность данных, полученных обоими методами. Сравнение выборочных дисперсий анализа двух методик (ТМ и МДА) по критерию Фишера и по критерию Бартлетта, значению χ2 при уровне вероятности Р=95% и f=1 и сравнение средних результатов по t-критерию Стьюдента подтвердили принадлежность обеих выборок к одной генеральной совокупности. Систематическая ошибка (ε) и неопределенность (δ) методики ТМ существенно выше, чем при применении методики МДА: ε=1,5 и 0,77%; δ=4,7 и 0,97% соответственно.
ВЫВОДЫ. Турбидиметрический метод может рассматриваться в качестве альтернативного метода определения активности ванкомицина. Однако для минимизации влияния человеческого фактора и внешних условий испытания необходимо предварительно разработать стандартные операционные процедуры выполнения работ по методике ТМ и контролировать их соблюдение.
INTRODUCTION. Vancomycin is a tricyclic glycopeptide antibiotic produced by Amycolatopsis orientalis. To determine the activity of antibiotics obtained by biosynthesis, in particular vancomycin, chemical or physicochemical identification of the active compound is not available; instead, two pharmacopeial methods are used: the agar diffusion and the turbidimetric method. Both methods are based on inhibiting the growth of the test microorganism under the appropriate experimental conditions. Turbidimetric method has several advantages over the agar diffusion method for parenteral preparations used in the form of solutions, as it is more sensitive to low concentrations, more cost-effective and takes less time to obtain the results. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation (SP RF) provides one method for determining the activity of antibiotics — the agar diffusion method. Previously, turbidimetric method was developed to determine vancomycin activity.
AIM. This study aimed to evaluate the determination results of vancomycin activity obtained using turbidimetric method in order to use it as an alternative to the agar diffusion method.
MATERIALS AND METHODS. The test conditions for the method using agar diffusion corresponded to SP RF: test-microorganism, seed dose: Bacillus subtilis NCTC 10400/ ATCC 6633 (Becton Dickinson France S.A.S.), 20×107 spores per ml medium; purified sterile water for the preparation of basic solutions, sterile buffer No. 4 for process solutions. The turbidimetric method included Staphylococcus aureus NCTC 7447/ ATCC 6538P (Becton Dickinson France S.A.S), purified sterile water, and solvent for process solutions — sterile buffer solution, pH 8.0 (adapted from the European Pharmacopoeia). A culture medium developed at the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products was used to determine the activity of aminoglycosides. The activity was determined by comparing with a reference standard of vancomycin hydrochloride EP CRS banth 4 for microbiological analyses. For each test (agar diffusion and turbidimetry), five accurately weighed samples were taken with an accuracy of 0.0001 g of the test sample; each sample was analyzed in three replicates.
RESULTS. The calculated main parameters of the analysis of variance, Non-parallelism and Regression of the results of the test and reference solutions, confirmed the adequacy of the data obtained using both methods. Comparison of the sample variances of the two methods (turbidimetry and agar diffusion) according to Fisher’s test and Bartlett’s test, the calculated value χ2 (P=95%, f=1), and comparison of the mean values according to the Student’s t-test confirmed that both samples belonged to the same general sample. The systematic error and uncertainty for the turbidimetric method was significantly higher than the agar diffusion: ε 1.5% and ε 0.77%, δ=4.7% and δ=0.97%, respectively.
CONCLUSIONS. The turbidimetric method can be deemed as an alternative for determining vancomycin activity. However, in order to minimize the influence of the human factor and the external study conditions, a preliminary standardization of conditions, with a subsequent implementation control is warranted for the turbidimetric method.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.