Определение гербицида дикамба в лекарственном растительном сырье: разработка селективной хроматографической методики

ВВЕДЕНИЕ

Содержание пестицидов в лекарственном растительном сырье (ЛРС), согласно российскому законодательству, регламентируется ОФС.1.5.3.0011 «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» Государственной фармакопеи Российской Федерации XV изд. (ГФ РФ). Остаточные количества пестицидов — один из показателей безопасности лекарственного растительного сырья, в ГФ РФ даны нормы по содержанию 65 подобных соединений.

Рынок ядохимикатов активно расширяется, по статистическим данным, в 2024 г. российскими предприятиями было выпущено 135 247 тонн гербицидов, что более чем на 10% превышает показатели 2022 г.¹ Однако стандарты качества ЛРС обновляются с задержкой, и в ГФ РФ включены нормы содержания и методы исследования не на все ядохимикаты, которые используются в сельском хозяйстве.

Особый интерес представляют ядохимикаты, которые повсеместно применяют при выращивании растений, в частности, содержащие производное хлорбензойной кислоты дикамбу (3,6-дихлор-2-метоксибензойную кислоту, (I)). Дикамба входит в состав препаратов для борьбы с сорной растительностью «Линтур» и «Диален Супер».

Ряд исследователей указывают на потенциальную опасность дикамбы как вещества, повышающего риск возникновения онкологических заболеваний [1–3]. Нельзя не отметить, что возможность определения остаточных количеств дикамбы в сельскохозяйственных продуктах активно изучается за рубежом в последние годы (см., например, [4][5]).

Как было показано ранее, разработанная еще в 1971 г. спектрофотометрическая методика количественного определения дикамбы в лекарственном растительном сырье не удовлетворяет современным требованиям ГФ РФ по показателям специфичности (длина волны определения 280 нм не является селективной в силу того, что в этой области электромагнитного спектра поглощаются молекулы многих ароматических соединений а также соединения, содержащие карбонильную группу) и линейности (коэффициент корреляции, равный 0,83, меньше критерия приемлемости — от 0,99 до 1,00) [6].

Цель работы — разработка селективной методики определения гербицида дикамба в лекарственном растительном сырье для последующего введения в фармакопейные нормы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлась гербицидная смесь «Линтур», содержащая дикамбу — 659 г/кг, триасульфурон — 41 г/кг (ООО «Зеленая Аптека Садовода»). Для построения градуировочных графиков использовался стандартный образец дикамбы (Kit-54, pesticide 4-4600, PolуScience Corporation, lot № 53449).

Гербицидную смесь применяли при выращивании эхинацеи пурпурной сорта «Ливадия» из семян (ООО «Аэлита», срок годности до 06.2028) на двух участках в Выборгском районе Ленинградской области площадью по 10 м² каждый со слабощелочными почвами и достаточным освещением. На участке № 1 культивирование проводили с применением гербицида, на участке № 2, расположенном от первого на расстоянии 5 м, — без его применения. Для борьбы с сорняками на участке № 2 применяли регулярную ручную прополку.

Жидкостную хроматографию проводили с помощью прибора с автоматическим дозированием Agilent Technologies 1260 Infinity с тандемным масс-спектрометром Agilent Technologies 6420 Triple Quad LS/MS, предколонка — UHPLC Guard 3PK InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 2,1 мм 1.9 Micron, колонка — Desc: Kinetex® 2,6 мкм C18 100 Å, Size: LC Column 100×2,1 мм, температура колонки — 40 °С, подвижная фаза — A: 5% ацетонитрил, B: 95% H₂O с 0,1% муравьиной кислотой, объем пробы — 5 мкл.

Газохроматографический анализ проводили с помощью хроматографа с автоматическим дозированием, снабженного моноквадрупольным масс-спектрометром QP-2020 (Shimadzu), капиллярной колонкой неполярной длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной слоя неподвижной фазы ((5%-фенил)-метилполисилоксан) 0,25 мкм, газ-носитель — гелий, объем пробы — 1 мкл, скорость потока 0,8 мл/мин, постоянный поток; температура инжектора 70 °С. Силилирование образцов при проведении анализа ГХ-МС: в виалы с 1 мл анализируемых стандартных образцов добавляли избыток силилирующего агента — 0,2 мл смеси, состоящей из 99% N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и 1% триметилхлорсилана [5]. Масс-спектры, полученные методом ГХ-МС, анализировали по имеющимся библиотекам NIST MS Search Program 17.

Градуировочные графики для количественного определения дикамбы методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС строили с использованием растворов стандартного образца, полученных путем растворения точной навески в 100 мл этилового спирта 96%. Для исследования методом ВЭЖХ-МС/МС были получены растворы с концентрациями: 0,15; 0,10; 0,08; 0,05; 0,04; 0,02 мг/мл; для исследований ГХ-МС использовались растворы: 0,040; 0,020; 0,010; 0,008; 0,005; 0,004 мг/мл.

Подготовку образцов ЛРС эхинацеи пурпурной, выращенной с применением дикамбы, проводили по следующей методике: около 5 г (точная навеска) ЛРС помещали в стакан емкостью 200 мл, добавляли 50 мл воды очищенной, подщелачивали раствором натрия гидроксида 30% до рН=8 (рН определяли по универсальной индикаторной бумаге). Дважды настаивали по 1 ч при периодическом перемешивании. Объединенную водную вытяжку подкисляли раствором хлористоводородной кислоты 10% до рН=6 и экстрагировали трижды порциями хлороформа по 25 мл. Объединенные хлороформные извлечения высушивали, сухой остаток растворяли в 10 мл 96% этилового спирта. Основным критерием качества пробоподготовки являлся максимальный выход целевой молекулы гербицида.

Расчет пределов допустимого содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье (ПДСОП_ЛРС) эхинацеи пурпурной проводили по формуле (1):

(1)

где ПДСОП_ЛРС — предел допустимого содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье; ДСП — допустимое суточное потребление вещества, мг/кг; М — масса тела человека, кг (60 кг); МСД — суточная доза лекарственного растительного сырья, кг; 100 — фактор потребления.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На хроматограммах растворов стандартного образца дикамбы, полученных методом ГХ-МС, пик, соответствующий нативной молекуле, не идентифицирован (рис. 1). Согласно библиотеке масс-спектров пик со временем удерживания 4,6 мин соответствует 2,5-дихлорфенолу, 5,2 мин — 2,5-дихлорметоксибензолу, 7,0 мин — метиловому эфиру дикамбы. Все эти соединения образуются в результате термической деградации дикамбы в инжекторе хроматографа. Определение гербицида по нативной молекуле в данном случае невозможно из-за отсутствия стандартных образцов продуктов деградации.

ОФС.1.5.3.0011 «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» рекомендует для оценки содержания ядохимикатов использовать методику газовой хроматографии, при которой начальная температура колонки составляет 70 °С. В процессе выполнения данного исследования установлено, что при этой температуре происходит термическая деструкция молекулы дикамбы, что не позволяет определить 3,6-дихлор-2-метоксибензойную кислоту, являющуюся компонентом гербицидной смеси «Линтур», по исходной молекуле, а следовательно, выполнить количественное определение его остаточных количеств в ЛРС.

По полученным хроматографическим данным установлено, что происходит декарбоксилирование нативной молекулы, поэтому была использована методика дериватизации (силилирования) [7][8]. Образование эфиров с тетраметилсиланом стабилизирует молекулы дикамбы в температурном диапазоне 70–300 °C, реализуемом при хроматографировании², на хроматограмме регистрируется пик со временем удерживания 8,3 мин, соответствующий силилированному производному дикамбы (рис. 2). Однако зависимость площади пика от концентрации раствора дикамба (рис. 2С) нелинейна (R (коэффициент корреляции) <0,99), что может быть объяснено нестехиометричностью протекания реакции дериватизации за счет возможного присоединения силилирующего агента как по карбоксильной группе, так и по свободному гидроксилу, образующемуся в процессе термической деструкции молекулы, и не позволяет использовать данный метод для проведения количественного анализа.

Одним из возможных фармакопейных методов обнаружения целевых аналитов, характеризующимся высокой специфичностью, селективностью, чувствительностью и воспроизводимостью, является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС)³. На хроматограммах, полученных при анализе растворов стандартного образца дикамбы методом ВЭЖХ-МС/МС (рис. 3), отмечается один пик нативной молекулы дикамбы со временем удерживания ~6,2 мин, которому соответствует спектрограмма с ионным распределением (обусловлено 2 атомами хлора) с 221–219–218 m/z и реперный ион с 174,9 m/z. Ион-продукт (174,9 m/z) является фрагментом 3,6-дихлор-2-метоксибензойной кислоты, так как при фрагментации других производных 2-метоксибензойной кислоты также выявляется ион-продукт с таким же значением m/z. Данные соответствуют имеющимся в базах данных Agilent MassHunter Quantitative Analysis B.06.00. Зависимость площади пика от концентрации раствора линейна (рис. 3С).

Высокая специфичность масс-спектрометрического анализа заключается в селективном обнаружении целевых соединений в сложных матрицах. Это достигается за счет нацеленного мониторинга переходов между ионами-предшественниками и ионами-продуктами (MRM-переходы). В данном случае удалось избежать воздействия изначальной матрицы извлечения на результаты определения.

Результаты валидации методики ВЭЖХ-МС/МС определения дикамбы представлены в таблице 1. Исследовали по 6 независимых образцов. Показана сходимость результатов, получаемых одним химиком на одном и том же оборудовании в течение одного дня, а также разными химиками в разные дни на разном оборудовании в пределах одной лаборатории. Установлено, что по показателям пригодности хроматографической системы, специфичности, линейности, правильности, прецизионности разработанная методика удовлетворяет критериям приемлемости в соответствии с фармакопейными требованиями⁴.

На хроматограммах извлечений из ЛРС эхинацеи пурпурной, выращенной с использованием дикамбы (рис. 4), наблюдается один пик со временем удерживания около 6,16 мин и масс-спектром, соответствующим дикамбе. Содержание гербицида в образце эхинацеи пурпурной составило 0,24±0,06 мг/г.

Расчет пределов допустимого содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье (ПДСОП_ЛРС) для сырья эхинацеи пурпурной проводили по формуле (1). Допустимое суточное потребление (ДСП) для дикамбы составляет 0,3 мг/кг⁵. Массу человека (М), согласно фармакопейной статье, принимают за 60  кг⁶. Максимальную суточную дозу (МСД) лекарственного растительного сырья высчитывали исходя из максимальной суточной дозы приема препарата экстракта эхинацеи (1200 мг)⁷ и данных по извлечению этого экстракта из ЛРС (2,4 г экстракта из 100 г ЛРС) [9]. Значение ПДСОП_ЛРС, рассчитанное указанным способом, составляет 0,036 мг/г. Таким образом, количество гербицида, содержащегося в ЛРС, превышает ПДСОП_ЛРС, что говорит о потенциальной возможности перехода соединения в изготовленные из сырья ЛП и БАДы. Следует ужесточить контроль за применением гербицида дикамба на землях, используемых для выращивания ЛРС, внести соединение в перечень контролируемых в фармакопейной статье.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определение дикамбы методом ГХ-МС в условиях, регламентируемых ОФС.1.5.3.0011, не позволяет получить точный результат, поскольку не является специфичным (происходит термодеструкция исходной молекулы в инжекторе хроматографа). Стабилизация молекулы путем дериватизации методом силилирования позволяет качественно определять дикамбу, однако количественный анализ не рекомендуется в связи с нелинейностью концентрационной зависимости отклика.

Методика, основанная на определении ВЭЖХ-МС/МС, позволяет проводить селективное определение дикамбы в ЛРС. Методика валидирована в соответствии с требованиями ГФ РФ. Следовательно, разработанная методика может быть предложена в качестве основной для определения дикамбы в лекарственном растительном сырье «трава» для включения в фармакопейные требования.

В дальнейшем планируется апробировать разработанную методику на нескольких растительных объектах, включая другие морфологические части растений.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: О.Ю. Стрелова — разработка методики эксперимента по установлению количественного содержания и извлечению соединения из лекарственного растительного сырья; М.А. Александров — выращивание эхинацеи пурпурной с применением гербицидной смеси, изучение полученных образцов методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС, проведение статистической обработки данных.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Olga Yu. Strelova developed experimental methods in order to establish the quantitative content and extraction of compounds from medicinal plant raw materials. Mark A. Aleksandrov cultivated Echinacea purpurea using a herbicide mixture, studied the obtained samples using GC-MS and HPLC-MS/MS methods, and processed statistical data.