Спектрофотометрическое определение карвона в плодах и эфирном масле тмина обыкновенного: разработка и валидация методики

ВВЕДЕНИЕ

Тмин обыкновенный (Carum carvi L.) — эфиромасличное растение семейства сельдерейные (Apiaceae). Плоды тмина обыкновенного широко применяются в медицине для лечения синдрома раздраженного кишечника и диспептических расстройств благодаря их выраженным спазмолитическим, противомикробным и ветрогонным свойствам [1–3]. Спазмолитические свойства главным образом определяет эфирное масло плодов тмина, которое непосредственно влияет на клетки гладкой мускулатуры кишечника, расслабляя и уменьшая частоту их сокращений [4][5]. Эти свойства обусловлены моноциклическими монотерпенами — карвоном (I) [6] и лимоненом (II) [7], суммарное содержание которых в эфирном масле тмина может превышать 90% [8][9]. Спазмолитическая активность карвона выше, чем у лимонена [7]. Карвон действует подобно классическим блокаторам кальциевых каналов, вызывая расслабление мышц путем уменьшения поступления кальция внутрь клеток [7][10].

Содержание карвона в эфирном масле регламентируется Европейской фармакопеей (Ph. Eur.) на уровне 50–65%, а лимонена — 30–45%¹. При этом в ряде публикаций было показано, что соотношение карвона и лимонена в эфирном масле плодов тмина может варьировать в широком диапазоне [11]. По мере созревания плодов содержание карвона возрастает на ~12%, а лимонена — снижается [11][12]. Сортовая принадлежность также влияет на компонентный состав эфирного масла тмина. Так, сорт Kepron содержит на ~9% больше карвона и на ~9% меньше лимонена, чем сорт Prochan [13]. Также большое влияние на накопление эфирного масла и его компонентный состав имеет географический фактор. Содержание карвона в эфирном масле плодов тмина, заготовленных в разных странах, варьирует от 32,6 до 95,9%, а лимонена — от 1,5 до 51,3%, при этом только 5 образцов из 20 изученных по этим параметрам соответствовали требованиям Ph. Eur. [14]. Аналогичные результаты были получены и в других работах [14–16]: состав эфирного масла плодов тмина обыкновенного часто не соответствовал требованиям Ph. Eur.

Отметим, что продолжительность хранения плодов тмина не влияла на состав эфирного масла. Однако при хранении самого эфирного масла в ненадлежащих условиях наблюдалось окисление лимонена, а также полимеризация карвона, приводящая к пожелтению эфирного масла. Данные изменения в эфирном масле можно предотвратить путем хранения плодов и эфирного масла тмина в прохладном, защищенном от солнца и кислорода месте [9].

В Ph. Eur. включены как плоды тмина обыкновенного², так и его эфирное масло³. Плоды стандартизуют по содержанию эфирного масла (не менее 3%) с детектированием карвона методом тонкослойной хроматографии. Стандартизацию эфирного масла тмина проводят методом газовой хроматографии, количественно определяя его основные компоненты (карвон, лимонен, β-мирцен, транс-дигидрокарвон, транс-карвеол)⁴.

Идентификация плодов тмина, согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) XIV изд., проводится путем детектирования карвона и лимонена методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с масс-спектрометрическим детектором, количественную стандартизацию проводят только по содержанию эфирного масла (не менее 2%)⁵. Таким образом, карвон выступает в роли маркерного соединения в качественном анализе плодов и эфирного масла тмина [17][18]. На сайте Института фармакопеи и стандартизации в сфере обращения лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России размещен проект фармакопейной статьи «Тмина обыкновенного плодов масло эфирное», согласно которому определение хроматографического профиля проводится методом ГЖХ с количественным определением основных компонентов эфирного масла, в том числе карвона.

С учетом изложенных обстоятельств представляется актуальным дополнить стандартизацию плодов тмина обыкновенного по содержанию карвона. За счет сопряженной структуры карвон способен поглощать ультрафиолетовый свет в диапазоне длин волн от 230 до 240 нм, максимум поглощения приходится на 236 нм. При этом лимонен, не имеющий в своей структуре сопряженных двойных связей, не поглощает электромагнитное излучение при данных длинах волн [19]. Это дает возможность использовать спектрофотометрический метод для селективного определения карвона в эфирном масле тмина обыкновенного. Определение карвона в плодах тмина обыкновенного методом прямой спектрофотометрии перспективно для включения в фармакопейную статью «Тмина обыкновенного плоды», а также может использоваться как альтернативный метод стандартизации эфирного масла плодов тмина обыкновенного.

Цель работы — разработка и валидация спектрофотометрической методики определения карвона в эфирном масле плодов тмина обыкновенного; проверка результатов спектрофотометрического определения методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Эфирное масло из плодов тмина обыкновенного получали методом гидродистилляции с использованием прибора Гинзберга, навеска сырья — 10,0 г, время перегонки — 2 ч. Плоды тмина обыкновенного (Carum carvi L.) (ООО «Фирма Здоровье», серия 031224, срок годности до 11.2027). Стандартный образец карвона с содержанием основного вещества 98,5% (Fluka) использовали для приготовления стандартных растворов и в методе добавок.

Оборудование

Спектрофотометр UNICO 2802 (United Products & Instruments, Inc.), весы аналитические АДВ-200М (ГОСМЕТР), газовый хроматограф GC-MS QP2010 Ultra (Shimadzu).

Методики пробоподготовки и анализа

Методика приготовления раствора эфирного масла: 0,025 г (точная навеска) эфирного масла плодов тмина обыкновенного помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 95% этиловом спирте и доводили до метки тем же растворителем (раствор А). Переносили 0,25 мл раствора А в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор B).

Методика приготовления раствора карвона: 0,02 г (точная навеска) карвона помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 95% этиловом спирте и доводили до метки тем же растворителем (раствор C). Переносили 0,2 мл раствора C в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор D).

Методика приготовления 7 растворов карвона для оценки линейности: 0,02 г (точная навеска) карвона помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в 95% этиловом спирте и доводили до метки тем же растворителем (раствор C). В 7 мерных колб вместимостью 25 мл вносили аликвоты по 0,16, 0,18, 0,20, 0,22, 0,24, 0,26 и 0,28 мл раствора C и доводили объемы растворов до метки тем же растворителем (раствор D).

Оптическую плотность растворов B и D измеряли при длине волны 236 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 96% этиловый спирт.

Содержание карвона в эфирном масле (мг/г) рассчитывали по формуле (1). Открываемость (%) рассчитывали из отношения «найдено : введено» по формуле (2).

(1)

(2)

где A_x и A_ст — оптическая плотность исследуемого и стандартного растворов соответственно; a_ст — навеска карвона для приготовления стандартного раствора, г; a_x — навеска эфирного масла для приготовления раствора, г; b_x — разведение эфирного масла; b_ст — разведение карвона, где

b = ,

R — чистота карвона, где m_BB — содержание карвона в эфирном масле плодов тмина обыкновенного, мкг.

Методика приготовления растворов карвона для построения калибровочной зависимости с использованием метода газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС): 0,25 г (точная навеска) карвона помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в хлороформе и доводили до метки тем же растворителем (раствор E). В 7 мерных колб вместимостью 5 мл вносили аликвоты по 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75 и 2,00 мл раствора E, 0,50 мл стандартного раствора нонана в хлороформе (С=15 мг/мл) и доводили объемы растворов до метки тем же растворителем (раствор F).

Методика приготовления образцов масла тмина для метода ГХ–МС: в мерные колбы объемом 5 мл вносили по 0,0175 г (точная навеска) масла тмина, 0,5 мл стандартного раствора нонана в хлороформе (С=15 мг/мл) и доводили до метки хлороформом (раствор G).

ГХ–МС проводили с помощью газового хроматографа GC-MS QP2010 Ultra (Shimadzu), совмещенного с масс-селективным (МС) детектором, при следующих условиях: капиллярная колонка BP-1 (длина 60 м, диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,5 мкм) с запрограммированной температурой термостата от 70 °С в течение 2 мин, затем повышена до 200 °С со скоростью 10 °С/мин, выдерживалась при конечной температуре 15 мин. Общее время работы — 30 мин; давление — 355,7 кПа; температура инжектора — 200 °С; режим введения — 0,2 с делением потока 1:50; объем образца — 1 мкл; температура детектора — 220 °С; газ-носитель — гелий. Условия МС детектирования: температура ионного источника — 210 °С; ионизация электронами — 70 эВ; режим сбора данных — сканирование (m/z 45–500). Пики на хроматограммах идентифицировали с использованием программы GC-MS Solution real time analysis, а также путем сравнения экспериментальных значений индексов Ковача с указанными в литературе [20–24]. Индексы Ковача рассчитывали относительно времени удерживания стандартной серии алканов С8–С17 в экспериментальных условиях хроматографического разделения компонентов эфирного масла тмина.

Калибровочную зависимость для определения количественного содержания карвона в эфирном масле тмина обыкновенного методом ГХ–МС строили в координатах отношения интегральной интенсивности сигнала (площади под сигналом) карвона к интегральной интенсивности сигнала нонана от концентрации карвона: (А_карвон/А_нонан)=f(C_нонан). В выбранном диапазоне концентраций карвона (1–4 мг/мл) калибровочная зависимость носила линейный характер (R²=0,998).

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили в соответствии с ГФ РФ⁶, используя программу Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Валидационную оценку методики количественного определения содержания карвона в эфирном масле тмина проводили по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, прецизионность и правильность в соответствии с требованиями ГФ РФ⁷.

Специфичность методики определяли, регистрируя спектры поглощения электромагнитного излучения спиртовых растворов карвона в концентрации 6,4 мкг/мл и спиртового раствора эфирного масла, полученного из плодов тмина обыкновенного с содержанием карвона 7,6 мкг/мл (рис. 1). Максимум поглощения карвона и эфирного масла наблюдается при длине волны 236 нм. Таким образом, предлагаемая методика количественного определения карвона в эфирном масле плодов тмина обыкновенного валидна по показателю «специфичность».

Линейность и аналитическую область методики устанавливали путем статистической обработки выборки, полученной в результате количественного определения 7 модельных проб (растворы D) на 7 уровнях концентрации в диапазоне 70–130% от количества карвона, принятого за 100% (7,24 мкг в 1 мл раствора). Определение проводили в трех повторностях. Зависимость «оптическая плотность : концентрация карвона, мкг/мл» имеет линейный характер и описывается уравнением: y=a_x+b, где а=0,0607, b=0,0058. Рассчитанное значение коэффициента линейной корреляции r составляет 0,9995, что отвечает условию r≥0,99 и позволяет сделать заключение о валидности по показателям линейность и аналитическая область методики в диапазоне концентраций карвона от 5,26 до 9,21 мкг/мл.

Прецизионность предложенной методики оценивали по повторяемости (сходимости) на 9 пробах на трех уровнях концентраций, входящих в диапазон построенной линейности. Однородность выборки проверяли с помощью Q-критерия⁸. Содержание карвона в образцах находилось на уровне 757,4±8,5%. Рассчитанные значения Q_i меньше табличного Q_табл=0,46 (n=9, P=95%), стандартное относительное отклонение составило 1,5%, относительная ошибка среднего — 1,1%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.

Правильность предложенной методики проверяли методом добавок. Для этого к аликвоте раствора эфирного масла c содержанием карвона 4,84 мкг/мл, принятого за 100%, добавляли точно известное количество карвона в количестве 25, 50 и 75% от найденного значения карвона в эфирном масле тмина обыкновенного. Определение проводили в трех повторностях для каждой концентрации. Рассчитанные и найденные значения карвона в эфирном масле с добавками карвона близки, открываемость составила 99,82±0,38%, стандартное относительное отклонение — 0,5%, относительная ошибка среднего — 0,4%, что позволяет считать предлагаемую методику валидной по показателю «правильность».

В ходе ГЖХ-анализа в образцах эфирного масла плодов тмина обыкновенного было обнаружено 5 компонентов (табл. 1, рис. 2). Основными компонентами эфирного масла являются карвон (75,2±0,8%) и лимонен (около 23,6±0,8%). Результаты спектрофотометрического определения карвона (75,7±0,9%) коррелируют с результатами ГЖХ-анализа.

ВЫВОДЫ

1. Разработана спектрофотометрическая методика определения карвона в эфирном масле плодов тмина обыкновенного.
2. Проведена валидационная оценка методики спектрофотометрического определения карвона в эфирном масле плодов тмина обыкновенного. Систематическая ошибка отсутствует, предложенная методика валидна по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, прецизионность и правильность.
3. Результаты спектрофотометрического определения карвона (75,7±0,9%) коррелируют с результатами ГЖХ-анализа (75,2±0,8%).
4. Определение карвона в плодах тмина обыкновенного методом прямой спектрофотометрии в дальнейшем можно включить в фармакопейную статью «Тмина обыкновенного плоды», а также использовать как альтернативный метод стандартизации эфирного масла плодов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.Д. Рюмин — проведение эксперимента, анализ и интерпретация результатов, анализ литературы, написание текста рукописи; Р.Ш. Хазиев — идея и концепция исследования, интерпретация результатов; А.В. Немтарев — проведение эксперимента (газохроматографический анализ), анализ и интерпретация результатов.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Sergey D. Ryumin conducted the experiment, analyzed and interpreted the data, analyzed the literature, drafted the manuscript. Ramil’ Sh. Khaziev conceived the idea, conceptualized the study, interpreted the results. Andrey V. Nemtarev conducted an experiment (gas chromatographic analysis), analyzed and interpretation the data.