Стандартизация лекарственных препаратов, содержащих сердечные гликозиды ландыша: оценка возможности отказа от биологического метода

ВВЕДЕНИЕ

Лекарственные препараты ландыша применяются в терапии сердечно-сосудистых заболеваний¹. Выделенные из данного растения сердечные гликозиды (СГ) в терапевтических дозах обладают значительной кардиотонической и биологической активностью, быстро проявляют свое действие и имеют слабовыраженные кумулятивные свойства. Так, например, основной действующий гликозид ландыша конваллятоксин по биологической активности превосходит все известные сердечные гликозиды: 1 г вещества имеет активность 63300–83000 лягушачьих единиц действия (ЛЕД) [1–6].

Для определения подлинности лекарственных растительных препаратов (ЛРП) на основе сердечных гликозидов ландыша используют качественные реакции общегруппового характера и метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) без применения стандартного образца (СО) [7][8]. Количественное определение действующих веществ таких ЛРП до настоящего времени выполняют с использованием биологического метода², основанного на реакции живых лягушек на введение гликозидов. Постепенный отказ от испытаний на животных, а также тот факт, что методики, основанные на биологическом методе, не характеризуются высокой точностью и воспроизводимостью, обусловливают необходимость разработки новых методик, основанных на физико-химических методах анализа.

Цель работы — замена in vivo методики количественного определения сердечных гликозидов в лекарственных препаратах ландыша на методику, основанную на физико-химическом методе анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования

В качестве объектов исследования были использованы образцы отечественных производителей: субстанция-жидкость «Ландыша настойка» — 4 серии, ЛРП «Зеленина капли» — 12 серий, «Стандартный образец экстракта ландыша» — 2 серии (ЗАО «Вифитех», ФС 42-2486-87), стандартный образец конваллятоксина (содержание основного вещества 93,0%, Sigma-Aldrich, кат. № С9140, Германия). В качестве тест-системы использовали озерных лягушек (Rana ridibunda)³.

Реактивы и материалы

Реактивы: ацетонитрил (для ВЭЖХ, Concord Technology, Китай), хлороформ (для ВЭЖХ, Merck, Германия), спирт этиловый (96%, сорт «Экстра», Гатчинский спиртовой завод, Россия), свинца(II) ацетат тригидрат (для анализа, Merck, Германия), фосфорная кислота концентрированная (85,9%, ч., Honeywell, США), натрия сульфат безводный (для анализа, Merck, Германия), натрия гидроксид (для анализа, Merck, Германия), натрия бромид (для ИК-спектроскопии, Merck, Германия), левоментол (Sigma-Aldrich, кат. № PHR1116, Германия), натрия хлорид 0,9% раствор для инъекций (ООО «Гротекс», Россия); вода для инъекций (ООО «Гротекс», Россия).

Материалы: хроматографическая колонка: Luna C18(2) 250 мм × 4,6 мм × 5 мкм (Phenomenex, США), бумажный складчатый фильтр «черная лента» (ООО «МЕЛИОР ХХI», Россия).

Оборудование

Жидкостный хроматограф 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Германия); электронные весы XPE205DR (Mettler Toledo AG, Швейцария); система очистки воды Milli-Q Integral 5 (Millipore®, США), шейкер орбитальный KS 501 digital (digital IKA® Werke GmbH & Co.KG, Германия); испаритель ротационный с баней Rotavapor R-200 / R200/205 (BUCHI lab AG, Швейцария); ванна ультразвуковая ГРАД-95-3 (ООО «НТК Солтек», Россия); холодильник LKv 3912 (Liebherr Hausgeraete Lienz GmbH, Австрия).

Испытание проводили биологическим методом⁴, физико-химическими методами (спектрофотометрия (СФМ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [9]).

Биологические испытания проводили на лягушках в соответствии с фармакопейными методиками⁵. Активность СГ определяли методом биологической стандартизации и выражали в ЛЕД⁶.

Животные были предоставлены ИП Осьмаком Г.Ж.⁷ В экспериментах было использовано 600 лягушек с массой тела 30–75 г. Для экспериментальных исследований лягушки поступали 4 раза, с декабря 2024 г. по март 2025 г. Животных рандомизировали по массе тела на 120 групп по 5 особей в каждой группе с разницей в массе не более 5,0 г в группе. Лягушек содержали в емкости с проточной водой в полутемном помещении при температуре около 4 ºС⁸. Каждое испытание начинали с определения чувствительности очередной партии лягушек к стандартной дозе препарата. С этой целью нескольким группам лягушек, по 5 особей в каждой, вводили подкожно в бедренные лимфатические мешки дозу, близкую к 1 ЛЕД. Эта доза должна вызывать систолическую остановку сердца в течение 1 ч у большинства лягушек данной группы.

Результаты определений были обработаны с привлечением методов корреляционного анализа. Для оценки степени связи между методами был использован коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Качественную характеристику тесноты связи коэффициента ранговой корреляции оценивали по шкале Чеддока. Для оценки значимости коэффициента корреляции сравнивали его с критическим значением, величина которого зависит от объема выборки и уровня значимости [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки существующей стандартизации ЛРП ландыша была проанализирована нормативная документация российских производителей по показателям качества на лекарственные средства растительного происхождения «Ландыша настойка» и «Зеленина капли»⁹, данные ГРЛС, результаты экспертной работы (табл. 1, 2). Для установления подлинности СГ в препаратах «Ландыша настойка» и «Зеленина капли» используют общегрупповую качественную химическую реакцию Балье на пятичленное лактонное кольцо и применяют ТСХ. Метод ТСХ позволяет эффективно разделять сложные смеси веществ, но для обеспечения специфичности крайне важно использовать СО конваллятоксина. Однако только 2 производителя из 6 применяют СО при проведении испытания. Для определения СГ применяют 1% раствор ванилина в хлорной или серной кислоте, который также является неспецифичным, что может привести к обнаружению других органических соединений и получению ложноположительных результатов.

Количественную оценку действующих веществ препаратов ландыша выполняют путем спектрофотометрического определения суммы сердечных гликозидов в пересчете на конваллятоксин. Данный метод имеет ряд недостатков: низкую селективность (метод не позволяет идентифицировать индивидуальные гликозиды, а определяет их сумму) и недостаточную специфичность (поглощение в спектре может быть обусловлено не только СГ, но и другими сопутствующими веществами), недостаточную точность результатов исследования (за счет использования в расчетах удельного показателя поглощения).

Для оценки также используют метод биологической оценки активности СГ ландыша с использованием лягушек. Необходимо отметить, что начиная с 2011 г. отдельные производители начали исключать биологический метод из процессов контроля качества ЛРП. Это может быть связано со сложностями в обеспечении тест-системой — животными из дикой природы, часть из которых находится под охраной (например, занесены в Красную книгу Москвы¹⁰), а также с трудоемкостью выполнения экспериментов на живых особях, особенно при рутинном анализе.

В связи с вышеизложенным, а также постепенным сокращением использования животных в экспериментах в соответствии с внедряемой в практику концепцией 3R¹¹, необходимо изменение подходов к стандартизации ЛРП, содержащих СГ ландыша, по показателям «Идентификация» и «Количественное определение», а также отказ от in vivo метода определения биологической активности в пользу современного физико-химического метода.

Для выполнения биологических исследований необходимо наличие стандартного образца, в качестве которого был выбран экстракт ландыша. Результаты определения конваллятоксина в таком образце приведены в таблице 3. Основная часть исследования включала идентификацию и количественное определение конваллятоксина (доминирующего и наиболее биологически активного СГ, маркера, отвечающего за фармакологическое действие и характеризующего эффективность препаратов ландыша) с помощью разработанной ранее методики ВЭЖХ [9] (табл. 3).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой вариабельности и низкой чувствительности биологического метода определения: в пяти образцах биологическая активность не была установлена, в то время как методом ВЭЖХ был обнаружен конваллятоксин в концентрации от 0,004 (RSD=0,32%) до 0,011 мг/мл (RSD=2%). Была проведена статистическая проверка наличия корреляции между результатами определения содержания конваллятоксина методом ВЭЖХ и данных по биологической активности (в ЛЕД) в препаратах ландыша (табл. 4). Полученный коэффициент ранговой корреляции Спирмана (0,62) указывает на наличие средней и заметной связи между методами, однако, поскольку данный коэффициент ниже критического значения 0,68 (n=9; р=0,05)¹², статистическая значимость этой корреляции не достигается [10]. Неоднозначность корреляции между биологическими и физико-химическими методами может быть связана с тем, что биологический метод определения не может быть валидирован, отличается низкой чувствительностью, большой вариабельностью получаемых результатов [11][12].

Поскольку для количественного определения суммы СГ используют также спектрофотометрический метод, был проведен корреляционный анализ между результатами, полученными физико-химическими методами, включенными в ряд нормативных документов: ВЭЖХ (результаты получены в текущей работе) и спектрофотометрии (результаты опубликованы ранее в работе [9]) (табл. 5). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена составил 0,89, что указывает на наличие высокой степени корреляции между рассматриваемыми методами. Значение вышеуказанного коэффициента превышает критическое значение 0,78 (n=7; р=0,05), что свидетельствует о статистической значимости выявленной корреляции и возможности использования разработанной ВЭЖХ-методики в качестве адекватного метода количественного определения сердечных гликозидов в препаратах ландыша по маркеру, отвечающему за фармакологическое действие препаратов.

На основании данных, полученных в настоящем исследовании и в работе [9], были рассчитаны средние значения содержания конваллятоксина, определенные методом ВЭЖХ, в препаратах ландыша: стандартный образец экстракта ландыша 0,14578 мг/мл (0,14408–0,14736 мг/мл); ландыша настойка, субстанция-жидкость: 0,01397 мг/мл (0,01083–0,01824 мг/мл); Зеленина капли 0,00630 мг/мл (0,00368–0,01280 мг/мл).

Накопленная информация позволяет рекомендовать нормы содержания конваллятоксина в исследуемых объектах: ландыша настойка, субстанция-жидкость 0,01–0,02 мг/мл; Зеленина капли — 0,004–0,008 мг/мл. Рекомендуемые нормы были предложены на основании данных, полученных на образцах препаратов, которые были изготовлены по утвержденным промышленным регламентам и находятся на фармацевтическом рынке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Доказана высокая степень корреляции данных, полученных методами ВЭЖХ и спектрофотометрии для качественной и количественной оценки препаратов, содержащих сердечные гликозиды ландыша. Статистически достоверную корреляцию между методом ВЭЖХ и биологическим методом установить не удалось из-за высокой вариабельности результатов биологического метода.

В рамках реализации концепции 3R предложено включить метод ВЭЖХ для идентификации и количественного определения конваллятоксина в фармакопейную статью «Ландыша настойка» и в нормативную документацию на лекарственный препарат «Зеленина капли» с рекомендуемыми нормами содержания конваллятоксина: 0,01–0,02 и 0,004–0,008 мг/мл соответственно взамен биологического метода с использованием лягушек.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Т.А. Голомазова — выполнение экспериментальной части исследований, написание исходного текста рукописи; Н.П. Антонова — консультация по вопросам проведения отдельных этапов экспериментальных работ, редактирование и переработка текста рукописи, утверждение окончательного варианта статьи для публикации; Н.Е. Семенова — обобщение результатов исследования и их интерпретация; Е.П. Шефер — критический пересмотр содержания текста рукописи; С.С. Прохватилова — сбор, анализ и обобщение данных литературы; В.Л. Багирова — планирование эксперимента и постановка задач исследования, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Tatyana A. Golomazova performed the experiments and drafted the manuscript. Natalia P. Antonova advised the researchers at certain experimental stages, edited and restructured the manuscript and approved the final version for publication. Natalia E. Semenova generalized and interpreted the study results. Elena P. Shefer critically revised the manuscript. Svetlana S. Prokhvatilova collected, analyzed and generalized literature data. Valeria L. Bagirova planned the experiment, formulated study objectives and approved the final version for publication.