Разработка и валидация методики определения элементных примесей в флудезоксиглюкозе (¹⁸F) методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы в области лечения и диагностики онкозаболеваний все более востребованным является метод позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), который позволяет получать комплексную анатомическую и функциональную визуализацию, отражающую метаболическую активность опухолевого процесса [1]. В методе ПЭТ в качестве радиофармацевтического лекарственного препарата (РФЛП) чаще всего используется флудезоксиглюкоза (¹⁸F) (¹⁸F-ФДГ) [2][3]. Причина эффективности ¹⁸F-ФДГ — высокий уровень ее накопления в патологических очагах, в первую очередь злокачественных опухолях и метастазах. Так, чувствительность ПЭТ с ¹⁸F-ФДГ у пациентов с подозрением на злокачественное образование составляет 83–89%, а специфичность — 74–80% [4]. Данное лекарственное средство также позволяет оценить эффект от проведенного лечения, так как при эффективном лечении степень накопления препарата в опухолях снижается, а при неэффективности — не изменяется или возрастает [2].

Одним из показателей качества ¹⁸F-ФДГ является уровень ее контаминации элементными примесями. В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) производители РФЛП обязаны в ходе разработки и валидации производственного процесса определять в своей продукции содержание примесей Pb, Fe, As, а также других элементов, присутствующих в конструкционных материалах мишеней и (или) радионуклидных генераторах, в исходных реагентах (нерадиоактивном сырье)¹. Ранее нами было установлено, что для ¹⁸F-ФДГ отечественного производства такими элементами являются Al, Zn, Cu [5]. Уровень их содержания в отечественной продукции значительно выше, чем в импортных аналогах независимо от схемы технологического процесса [6–8]. В связи с этим актуальна разработка надежной методики определения содержания Al, As, Cu, Fe, Pb, Zn в готовой продукции, позволяющую производителям ¹⁸F-ФДГ провести валидацию технологического процесса.

Наиболее перспективным методом элементного анализа в лекарственных препаратах является метод масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС), который характеризуется максимальными экспрессностью, линейностью и чувствительностью среди спектральных методов².

Цель работы — разработка и валидация методики определения содержания элементов Al, As, Cu, Fe, Pb, Zn в флудезоксиглюкозе (¹⁸F) методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разработку методики проводили на модельной смеси, имитирующей состав ¹⁸F-ФДГ и содержащей воду для инъекций, 0,2 мг/мл D(+)-глюкозы (аналог действующего вещества), 9 мг/мл натрия хлорида (вспомогательное вещество), 0,2 мг/мл криптофикса 2.2.2 (является нормируемой примесью в ¹⁸F-ФДГ). К модельной смеси добавляли анализируемые элементы в количестве, соответствующем суточным предельно допустимым концентрациям при парентеральном введении препарата (PDC) (0,5 мг/л для Pb, 1,5 мг/л для As, 30 мг/л для Cu)³. Для элементов с неустановленными значениями PDC руководствовались составом эталонных растворов, рекомендованных ГФ СССР XI изд. для определения элементных примесей в РФЛП⁴, и результатами предварительного мониторинга элементного состава ¹⁸F-ФДГ отечественного производства [5] (3,5 мг/л для Fe, 4,0 мг/л для Al, 6,0 мг/л для Zn). Кроме того, такие же количества элементов добавляли к 3% HNO₃, к раствору 0,2 мг/мл D(+)-глюкозы в деионизованной воде и к раствору 9 мг/мл натрия хлорида в деионизованной воде.

Валидацию методики проводили в соответствии с требованиями ГФ РФ XV изд.⁵ по следующим характеристикам: аналитическая область методики (диапазон применения), линейность, правильность, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность и специфичность. Пределы количественного определения (ПКО) для анализируемых элементов были определены ранее на стадии мониторинга содержания элементных примесей в РФЛП [5]. Для приготовления валидационных образцов использовали реальный образец ¹⁸F-ФДГ с минимальным содержанием анализируемых примесей (бланк), к которому добавляли варьируемые количества стандартных растворов определяемых элементов.

В ходе исследования были использованы следующие реактивы: одноэлементные стандартные образцы с аттестованным значением 1000 мг/дм³ (СО1000) алюминия (кат. № CGALCL1-125ML), меди (кат. № CGCU1-125ML), мышьяка (кат. № CGAS1-125ML) (все — Inorganic Ventures), железа (кат. № 850040), свинца (кат. № 859630) (оба — Central Drug House (p) Ltd.), цинка (кат. № 1.70369, Sigma-Aldrich), D(+)-глюкоза (pharma grade, 99,2%, кат. № V900392, Sigma-Aldridch), натрия хлорид (кат. № 7647-14-5, pharma grade, 100%, neoFroxx), криптофикс 2.2.2 (кат. № 8.10647, for synthesis, 99%, Merck) концентрированная азотная кислота (кат. № 6001091, tracemetal grade, 69%, Fisher Chemical), вода деионизованная, очищенная на установке Milli-Q–Integral 3 (Millipore), аргон высокой чистоты (марка «5,5», 99,9995%, ООО «НИИ КМ»).

Содержание анализируемых элементов определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе Agilent 7900, фиксируя интенсивность сигналов следующих изотопов (а.е.м.): ²⁷Al, ⁵⁷Fe, ⁶³Cu, ⁶⁶Zn, ⁷⁵As, ²⁰⁸Pb. Параметры эксперимента: мощность плазмы — 1500 Вт; поток плазменного газа (аргон) — 15,0 л/мин, поток газа-носителя (аргон) — 1,05 л/мин, поток вспомогательного газа (аргон) — 0,9 л/мин, температура распылительной камеры Скотта — 2 °С, скорость подачи образца — 0,1 об./с. Для расчета концентраций элементов применяли метод калибровочной кривой. При построении калибровочного графика использовали 6 калибровочных растворов с концентрациями 30, 50, 100, 120, 130, 150% от номинальных значений содержания элементных примесей, добавляемых в анализируемые смеси. В качестве растворителя использовали либо 3% HNO₃ (при элементном анализе модельной смеси на основе 3% HNO₃), либо деионизованную воду (при элементном анализе модельных смесей на основе отдельных компонентов матрицы препарата ¹⁸F-ФДГ). Для каждого из образцов за результат измерения брали усредненное значение, полученное от трех параллельных проб. Статистическая обработка результатов (включая приведение табличных значений критериев Фишера и Стьюдента) была произведена в программе Microsoft Office Excel 2007 с установленным пакетом «Анализ данных».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методики. При разработке методики руководствовались методическими указаниями по определению элементов в диаг- ностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом ИСП-МС⁶. Выбор изотопов проводили в соответствии с таблицей распространенных полиатомных наложений⁷. Основной акцент сделан на изучение влияния органических и неорганических компонентов матрицы ¹⁸F-ФДГ на точность определения элементных примесей в модельных смесях. Известно, что изотоп ¹²С органической матрицы способен образовывать различные полиатомные ионы и вызывать спектральные наложения с изотопами других элементов [9]. Присутствие в составе ¹⁸F-ФДГ NaCl также способно привести к полиатомным наложениям [10, 11]. Кроме того, NaCl в большом количестве изменяет ионизацию плазмы, что влияет на количественную оценку целевых аналитов [12], в частности меди [13].

Изучено влияние концентрации моносахарида и соли на открываемость анализируемых элементов (значения отношения «найдено : внесено» Z_i). Для этого испытуемые растворы 3% HNO₃ (A), D(+)-глюкозы (B), NaCl (C) и модельной смеси (D), содержащие номинальные количества определяемых элементов, разбавляли в 10 и 20 раз. Открываемость элементов в растворах A и B сопоставима (табл. 1 «Открываемость элементов в испытуемых растворах», опубликована на сайте журнала⁸), следовательно, органическая матрица в том количестве, в котором она присутствует в ¹⁸F-ФДГ, не оказывает существенного влияния на результат элементного анализа. В растворах C и D открываемость Al, Cu, Pb, Zn ниже 70%, что не соответствует фармакопейным требованиям к данному показателю для элементных примесей лекарственных средств, определяемых методом ИСП-МС (80–120%)⁹. При разбавлении испытуемых растворов в 10 раз раскрываемость всех анализируемых элементов становится удовлетворительной, при дальнейшем разбавлении определяемое содержание Fe становится ниже ПКО.

Полученные данные свидетельствуют о том, что NaCl из-за матричного эффекта значительно искажает результат элементного анализа ¹⁸F-ФДГ. Следовательно, определять содержание элементных примесей в данном препарате без его предварительного разбавления некорректно. Разбавления в 10 раз достаточно, чтобы достичь открываемости анализируемых элементов, превышающей 90%. Таким образом, пробоподготовка в рамках разработанной методики сводится к десятикратному разбавлению испытуемых образцов деионизованной водой.

Валидация методики. Аналитическую область (диапазон применения) методики количественного определения, как правило, устанавливают исходя из нормируемых значений измеряемых показателей¹⁰ (50–150% от значения рабочей концентрации)¹¹. Так как нормы содержания элементных примесей в ¹⁸F-ФДГ отсутствуют, мы руководствовались рекомендациями ГФ СССР XI изд. по определению элементных примесей в РФЛП и выбрали в качестве аналитической области диапазоны содержания анализируемых элементов в эталонных растворах: 1–20 мг/л для Al, As, Zn; 0,05–1 мг/л для Cu; 0,25–5,0 мг/л для Pb. Исключение сделано для Fe, так как его минимальная концентрация в эталонном растворе с учетом 10-кратного разбавления (25 мкг/л) ниже установленного значения ПКО для данного элемента (227,9 мкг/л). Для Fe аналитическая область методики установлена в диапазоне 2,5–5,0 мг/л. Следует отметить, что средние значения содержания элементных примесей, дающих максимальный вклад в контаминацию ¹⁸F-ФДГ (4,5 мг/л для Al; 9,12 мг/л для Zn; 0,46 мг/л для Cu), хорошо согласуются с выбранными диапазонами применения валидируемой методики.

Линейность методики оценивали по результатам анализа пяти валидационных образцов. Изучали зависимость интенсивности сигналов от концентрации элемента, внесенного в валидационный образец (табл. 2, «Результаты оценки линейности валидируемой методики», опубликована на сайте журнала¹²; рис. 1).

В соответствии с фармакопейными требованиями¹³ критериями приемлемости линейной зависимости является коэффициент корреляции r≥0,99 и отношение относительных стандартных отклонений для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня 0,5–2,0 (в нашем случае 1,2 для Al; 1,8 для As; 1,9 для Cu и Pb, 0,6 для Zn). Из приведенных в таблице 2 и на рисунке 1 данных следует, что валидируемая методика характеризуется приемлемой линейностью.

Правильность оценивали, проверяя открываемость на валидационных образцах, при этом использовали данные, полученные в ходе установления линейности (табл. 3 «Результаты оценки правильности валидируемой методики», опубликована на сайте журнала¹⁴). Валидируемая методика соответствует фармакопейным требованиям, предъявляемым к открываемости примесных соединений (80–120%)¹⁵, следовательно, характеризуется приемлемой правильностью.

Прецизионность оценивали на уровнях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности (табл. 4 «Результаты оценки правильности валидируемой методики», табл. 5 «Статистические характеристики повторяемости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики», опубликованы на сайте журнала¹⁶) по результатам определений содержания элементов для минимальных, средних и максимальных концентраций.

В ГФ РФ XV изд. критерии приемлемости повторяемости при измерениях содержания элементных примесей методом ИСП-МС касаются только лекарственных растительных средств (значение относительного стандартного отклонения (RSD) измерения не должно превышать 10% (при диапазоне концентрации примесного элемента более 1 мг/кг) и 20% (при диапазоне концентрации элемента 0,01–1 мг/кг), а критерии приемлемости внутрилабораторной прецизионности вообще отсутствуют. Поэтому мы руководствовались критериями приемлемости прецизионности, применимыми ко всем элементным примесям: RSD≤20% для повторяемости и RSD≤25% для внутрилабораторной прецизионности. Кроме того, для оценки внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики сравнили фактические значения статистических критериев Фишера и Стьюдента с их табличными значениями (F_табл и t_табл)¹⁷. Критерий Фишера использовали для оценки значимости различий между дисперсиями двух выборок значений Z_i, которые предварительно были проверены на нормальность. Критерий Стьюдента применили для сравнения средних значений между двумя выборками. Табличные значения критериев Фишера и Стьюдента представляют собой максимальные значения критериев под влиянием случайных факторов при текущих степенях свободы и при заданном уровне значимости (95%).

Как следует из таблицы 5¹⁸, фактические значения критериев Фишера и Стьюдента существенно ниже табличных значений. Следовательно, различия результатов измерения двух операторов статистически незначимы. Значения RSD на уровнях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности ниже 10%. Следовательно, валидируемая методика характеризуется приемлемой прецизионностью.

Методика позволяет однозначно оценивать каждый определяемый элемент в присутствии других элементных примесей и компонентов. Специфичность подтверждена соответствием требованию для правильности определения элементов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана методика определения содержания Al, As, Cu, Fe, Pb, Zn в РФЛП «Флудезоксиглюкоза (¹⁸F)» методом ИСП-МС, учитывающая на стадии пробоподготовки влияние компонентов матрицы на количественную оценку целевых элементов. Аналитические данные валидации методики показали удовлетворительные результаты по основным валидационным параметрам (специфичность, линейность, правильность, прецизионность на уровнях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности). Следовательно, методика может быть использована производителями данного РФЛП при валидации технологического процесса и, при необходимости, при проведении внутреннего контроля качества продукции.