В последние годы в области лечения и диагностики онкозаболеваний все более востребованным является метод позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), который позволяет получать комплексную анатомическую и функциональную визуализацию, отражающую метаболическую активность опухолевого процесса [1]. В методе ПЭТ в качестве радиофармацевтического лекарственного препарата (РФЛП) чаще всего используется флудезоксиглюкоза (18F) (18F-ФДГ) [2][3]. Причина эффективности 18F-ФДГ — высокий уровень ее накопления в патологических очагах, в первую очередь злокачественных опухолях и метастазах. Так, чувствительность ПЭТ с 18F-ФДГ у пациентов с подозрением на злокачественное образование составляет 83–89%, а специфичность — 74–80% [4]. Данное лекарственное средство также позволяет оценить эффект от проведенного лечения, так как при эффективном лечении степень накопления препарата в опухолях снижается, а при неэффективности — не изменяется или возрастает [2].

Одним из показателей качества 18F-ФДГ является уровень ее контаминации элементными примесями. В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) производители РФЛП обязаны в ходе разработки и валидации производственного процесса определять в своей продукции содержание примесей Pb, Fe, As, а также других элементов, присутствующих в конструкционных материалах мишеней и (или) радионуклидных генераторах, в исходных реагентах (нерадиоактивном сырье)1. Ранее нами было установлено, что для 18F-ФДГ отечественного производства такими элементами являются Al, Zn, Cu [5]. Уровень их содержания в отечественной продукции значительно выше, чем в импортных аналогах независимо от схемы технологического процесса [6–8]. В связи с этим актуальна разработка надежной методики определения содержания Al, As, Cu, Fe, Pb, Zn в готовой продукции, позволяющую производителям 18F-ФДГ провести валидацию технологического процесса.

Наиболее перспективным методом элементного анализа в лекарственных препаратах является метод масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС), который характеризуется максимальными экспрессностью, линейностью и чувствительностью среди спектральных методов2.

Цель работы — разработка и валидация методики определения содержания элементов Al, As, Cu, Fe, Pb, Zn в флудезоксиглюкозе (18F) методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Разработку методики проводили на модельной смеси, имитирующей состав 18F-ФДГ и содержащей воду для инъекций, 0,2 мг/мл D(+)-глюкозы (аналог действующего вещества), 9 мг/мл натрия хлорида (вспомогательное вещество), 0,2 мг/мл криптофикса 2.2.2 (является нормируемой примесью в 18F-ФДГ). К модельной смеси добавляли анализируемые элементы в количестве, соответствующем суточным предельно допустимым концентрациям при парентеральном введении препарата (PDC) (0,5 мг/л для Pb, 1,5 мг/л для As, 30 мг/л для Cu)3. Для элементов с неустановленными значениями PDC руководствовались составом эталонных растворов, рекомендованных ГФ СССР XI изд. для определения элементных примесей в РФЛП4, и результатами предварительного мониторинга элементного состава 18F-ФДГ отечественного производства [5] (3,5 мг/л для Fe, 4,0 мг/л для Al, 6,0 мг/л для Zn). Кроме того, такие же количества элементов добавляли к 3% HNO3, к раствору 0,2 мг/мл D(+)-глюкозы в деионизованной воде и к раствору 9 мг/мл натрия хлорида в деионизованной воде.

Валидацию методики проводили в соответствии с требованиями ГФ РФ XV изд.5 по следующим характеристикам: аналитическая область методики (диапазон применения), линейность, правильность, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность и специфичность. Пределы количественного определения (ПКО) для анализируемых элементов были определены ранее на стадии мониторинга содержания элементных примесей в РФЛП [5]. Для приготовления валидационных образцов использовали реальный образец 18F-ФДГ с минимальным содержанием анализируемых примесей (бланк), к которому добавляли варьируемые количества стандартных растворов определяемых элементов.

В ходе исследования были использованы следующие реактивы: одноэлементные стандартные образцы с аттестованным значением 1000 мг/дм3 (СО1000) алюминия (кат. № CGALCL1-125ML), меди (кат. № CGCU1-125ML), мышьяка (кат. № CGAS1-125ML) (все — Inorganic Ventures), железа (кат. № 850040), свинца (кат. № 859630) (оба — Central Drug House (p) Ltd.), цинка (кат. № 1.70369, Sigma-Aldrich), D(+)-глюкоза (pharma grade, 99,2%, кат. № V900392, Sigma-Aldridch), натрия хлорид (кат. № 7647-14-5, pharma grade, 100%, neoFroxx), криптофикс 2.2.2 (кат. № 8.10647, for synthesis, 99%, Merck) концентрированная азотная кислота (кат. № 6001091, tracemetal grade, 69%, Fisher Chemical), вода деионизованная, очищенная на установке Milli-Q–Integral 3 (Millipore), аргон высокой чистоты (марка «5,5», 99,9995%, ООО «НИИ КМ»).

Содержание анализируемых элементов определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе Agilent 7900, фиксируя интенсивность сигналов следующих изотопов (а.е.м.): 27Al, 57Fe, 63Cu, 66Zn, 75As, 208Pb. Параметры эксперимента: мощность плазмы — 1500 Вт; поток плазменного газа (аргон) — 15,0 л/мин, поток газа-носителя (аргон) — 1,05 л/мин, поток вспомогательного газа (аргон) — 0,9 л/мин, температура распылительной камеры Скотта — 2 °С, скорость подачи образца — 0,1 об./с. Для расчета концентраций элементов применяли метод калибровочной кривой. При построении калибровочного графика использовали 6 калибровочных растворов с концентрациями 30, 50, 100, 120, 130, 150% от номинальных значений содержания элементных примесей, добавляемых в анализируемые смеси. В качестве растворителя использовали либо 3% HNO3 (при элементном анализе модельной смеси на основе 3% HNO3), либо деионизованную воду (при элементном анализе модельных смесей на основе отдельных компонентов матрицы препарата 18F-ФДГ). Для каждого из образцов за результат измерения брали усредненное значение, полученное от трех параллельных проб. Статистическая обработка результатов (включая приведение табличных значений критериев Фишера и Стьюдента) была произведена в программе Microsoft Office Excel 2007 с установленным пакетом «Анализ данных».

Разработка методики. При разработке методики руководствовались методическими указаниями по определению элементов в диаг- ностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом ИСП-МС6. Выбор изотопов проводили в соответствии с таблицей распространенных полиатомных наложений7. Основной акцент сделан на изучение влияния органических и неорганических компонентов матрицы 18F-ФДГ на точность определения элементных примесей в модельных смесях. Известно, что изотоп 12С органической матрицы способен образовывать различные полиатомные ионы и вызывать спектральные наложения с изотопами других элементов [9]. Присутствие в составе 18F-ФДГ NaCl также способно привести к полиатомным наложениям [10, 11]. Кроме того, NaCl в большом количестве изменяет ионизацию плазмы, что влияет на количественную оценку целевых аналитов [12], в частности меди [13].

Изучено влияние концентрации моносахарида и соли на открываемость анализируемых элементов (значения отношения «найдено : внесено» Zi). Для этого испытуемые растворы 3% HNO3 (A), D(+)-глюкозы (B), NaCl (C) и модельной смеси (D), содержащие номинальные количества определяемых элементов, разбавляли в 10 и 20 раз. Открываемость элементов в растворах A и B сопоставима (табл. 1 «Открываемость элементов в испытуемых растворах», опубликована на сайте журнала8), следовательно, органическая матрица в том количестве, в котором она присутствует в 18F-ФДГ, не оказывает существенного влияния на результат элементного анализа. В растворах C и D открываемость Al, Cu, Pb, Zn ниже 70%, что не соответствует фармакопейным требованиям к данному показателю для элементных примесей лекарственных средств, определяемых методом ИСП-МС (80–120%)9. При разбавлении испытуемых растворов в 10 раз раскрываемость всех анализируемых элементов становится удовлетворительной, при дальнейшем разбавлении определяемое содержание Fe становится ниже ПКО.

Полученные данные свидетельствуют о том, что NaCl из-за матричного эффекта значительно искажает результат элементного анализа 18F-ФДГ. Следовательно, определять содержание элементных примесей в данном препарате без его предварительного разбавления некорректно. Разбавления в 10 раз достаточно, чтобы достичь открываемости анализируемых элементов, превышающей 90%. Таким образом, пробоподготовка в рамках разработанной методики сводится к десятикратному разбавлению испытуемых образцов деионизованной водой.

Валидация методики. Аналитическую область (диапазон применения) методики количественного определения, как правило, устанавливают исходя из нормируемых значений измеряемых показателей10 (50–150% от значения рабочей концентрации)11. Так как нормы содержания элементных примесей в 18F-ФДГ отсутствуют, мы руководствовались рекомендациями ГФ СССР XI изд. по определению элементных примесей в РФЛП и выбрали в качестве аналитической области диапазоны содержания анализируемых элементов в эталонных растворах: 1–20 мг/л для Al, As, Zn; 0,05–1 мг/л для Cu; 0,25–5,0 мг/л для Pb. Исключение сделано для Fe, так как его минимальная концентрация в эталонном растворе с учетом 10-кратного разбавления (25 мкг/л) ниже установленного значения ПКО для данного элемента (227,9 мкг/л). Для Fe аналитическая область методики установлена в диапазоне 2,5–5,0 мг/л. Следует отметить, что средние значения содержания элементных примесей, дающих максимальный вклад в контаминацию 18F-ФДГ (4,5 мг/л для Al; 9,12 мг/л для Zn; 0,46 мг/л для Cu), хорошо согласуются с выбранными диапазонами применения валидируемой методики.

Линейность методики оценивали по результатам анализа пяти валидационных образцов. Изучали зависимость интенсивности сигналов от концентрации элемента, внесенного в валидационный образец (табл. 2, «Результаты оценки линейности валидируемой методики», опубликована на сайте журнала12; рис. 1).

В соответствии с фармакопейными требованиями13 критериями приемлемости линейной зависимости является коэффициент корреляции r≥0,99 и отношение относительных стандартных отклонений для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня 0,5–2,0 (в нашем случае 1,2 для Al; 1,8 для As; 1,9 для Cu и Pb, 0,6 для Zn). Из приведенных в таблице 2 и на рисунке 1 данных следует, что валидируемая методика характеризуется приемлемой линейностью.

Правильность оценивали, проверяя открываемость на валидационных образцах, при этом использовали данные, полученные в ходе установления линейности (табл. 3 «Результаты оценки правильности валидируемой методики», опубликована на сайте журнала14). Валидируемая методика соответствует фармакопейным требованиям, предъявляемым к открываемости примесных соединений (80–120%)15, следовательно, характеризуется приемлемой правильностью.

Прецизионность оценивали на уровнях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности (табл. 4 «Результаты оценки правильности валидируемой методики», табл. 5 «Статистические характеристики повторяемости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики», опубликованы на сайте журнала16) по результатам определений содержания элементов для минимальных, средних и максимальных концентраций.

В ГФ РФ XV изд. критерии приемлемости повторяемости при измерениях содержания элементных примесей методом ИСП-МС касаются только лекарственных растительных средств (значение относительного стандартного отклонения (RSD) измерения не должно превышать 10% (при диапазоне концентрации примесного элемента более 1 мг/кг) и 20% (при диапазоне концентрации элемента 0,01–1 мг/кг), а критерии приемлемости внутрилабораторной прецизионности вообще отсутствуют. Поэтому мы руководствовались критериями приемлемости прецизионности, применимыми ко всем элементным примесям: RSD≤20% для повторяемости и RSD≤25% для внутрилабораторной прецизионности. Кроме того, для оценки внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики сравнили фактические значения статистических критериев Фишера и Стьюдента с их табличными значениями (Fтабл и tтабл)17. Критерий Фишера использовали для оценки значимости различий между дисперсиями двух выборок значений Zi, которые предварительно были проверены на нормальность. Критерий Стьюдента применили для сравнения средних значений между двумя выборками. Табличные значения критериев Фишера и Стьюдента представляют собой максимальные значения критериев под влиянием случайных факторов при текущих степенях свободы и при заданном уровне значимости (95%).

Как следует из таблицы 518, фактические значения критериев Фишера и Стьюдента существенно ниже табличных значений. Следовательно, различия результатов измерения двух операторов статистически незначимы. Значения RSD на уровнях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности ниже 10%. Следовательно, валидируемая методика характеризуется приемлемой прецизионностью.

Методика позволяет однозначно оценивать каждый определяемый элемент в присутствии других элементных примесей и компонентов. Специфичность подтверждена соответствием требованию для правильности определения элементов.

Разработана методика определения содержания Al, As, Cu, Fe, Pb, Zn в РФЛП «Флудезоксиглюкоза (18F)» методом ИСП-МС, учитывающая на стадии пробоподготовки влияние компонентов матрицы на количественную оценку целевых элементов. Аналитические данные валидации методики показали удовлетворительные результаты по основным валидационным параметрам (специфичность, линейность, правильность, прецизионность на уровнях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности). Следовательно, методика может быть использована производителями данного РФЛП при валидации технологического процесса и, при необходимости, при проведении внутреннего контроля качества продукции.

1 ОФС.1.11.0001 Радиофармацевтические лекарственные препараты. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 2 ОФС.1.1.0040 Элементные примеси. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 3 Там же. 4 Определение примесей элементов в радиофармацевтических препаратах. Государственная фармакопея СССР. XI изд. Вып. 1. М.: Медицина, 1987. 5 ОФС.1.1.0012 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 6 МУК 4.1.1483-03. Определение химических элементов в биологических средах и препаратах методами атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. 7 Там же. 8 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-4-444-450-annex 9 ОФС.1.2.1.1.0015 Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 10 Решение Коллегии ЕЭК от 04.10.2022 № 138 «Об утверждении Требований к проведению исследований (испытаний) лекарственных средств в части оценки и контроля содержания примесей». 11 ОФС.1.1.0040 Элементные примеси. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 12 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-4-444-450-annex 13 ОФС.1.2.1.1.0015 Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 14 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-4-444-450-annex 15 ОФС.1.1.0012 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 16 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-4-444-450-annex 17 Отмахов ВИ, Бабенков ДЕ. Метрология количественного химического анализа (статистика малых выборок). Часть 1. Учебно-методическое пособие. Томск: Издательский дом Томского государственного университета; 2018. 18 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-4-444-450-annex