Получение и аттестация первичного стандартного образца 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[2,3-F]ксантина

ВВЕДЕНИЕ

Расширение арсенала средств, применяющихся для нормализации детоксицирующей функции печени, является одним из актуальных направлений разработки новых лекарственных средств в связи с напряженной эпидемиологической ситуацией и высокой смертностью от последствий гепатитов различной этиологии [1][2]. В ряду перспективных соединений с таким действием рассматриваются производные ксантина [3]. Соединения этой группы проявляют выраженные биологически активные свойства как ингибиторы триптофангидроксилазы, использующиеся для лечения заболеваний, связанных с избытком серотонина [4][5]; индукторы монооксигеназной системы гепатоцитов [7][8]; ингибиторы нуклеазы CAF1, подавляющие рост опухолей (гидроксипроизводные ксантинов) [6]; 7-замещенные производные обладают антиагрегационной активностью и антидепрессивными свойствами [9][10]. Еще одно производное ксантина, 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[  2,3-F]ксантин (ДПДТК) [11], избирательно и селективно воздействует на монооксигеназную систему гепатоцитов, вызывая индукцию цитохрома Р450 [12][13], что улучшает детоксицирующую функцию печени при токсическом повреждении и способствует защите клеток от окислительного стресса.

Разработка нового препарата предусматривает аналитическое сопровождение контроля качества этого препарата. Надлежащее функционирование системы контроля качества сырья, фармацевтической субстанции и лекарственных препаратов невозможно без применения в работе стандартных образцов (СО) [14]. В связи с отсутствием методик получения СО ДПДТК актуальной становится разработка способа получения первичного стандартного образца ДПДТК и последующая его аттестация.

Цель работы — разработка способа получения и проведение аттестации первичного стандартного образца 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина для последующего применения его в контроле качества лекарственных средств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Первичный СО получали однократной перекристаллизацией ДПДТК (получен в лаборатории поиска малых таргетных молекул ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России) из этанола 96%. ДПДТК массой 10 г вносили в круглодонную колбу, приливали к нему 374 г этанола 96% и перемешивали при кипении в течение 30 мин, затем перемешивание останавливали и охлаждали раствор до +10 °С. Надосадочный раствор декантировали, выпавший осадок помещали на воронку Бюхнера с фильтровальной бумагой типа «Белая лента» и промывали 50 г этанола 96% под вакуумом. После отмывки осадок помещали в колбу роторного испарителя Laborota HEI-VAP Advantage Heidolph (Heidolph, Германия) с химической вакуумной системой MZ 2C NT + AK + M + D (Heidolph, Германия) и высушивали в течение 6 ч. Режим высушивания: температура +40 °С, остаточное давление — 20–30 мбар, скорость вращения — 40 об./мин.

Методы

При определении основных параметров аттестации использовали взаимодополняющие методы анализа. Для подтверждения структуры СО ДПДТК, согласно ОФС.1.1.0007¹, использовали методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и инфракрасной спектроскопии (ИК) [15–17]. Определение значений химических сдвигов в спектрах ядерного магнитного резонанса проводили согласно ОФС.1.2.1.1.0007². ДПДТК практически не растворим в воде и в этаноле 96% при комнатной температуре, поэтому образец для анализа методом ЯМР готовили растворением навесок 10 и 150 мг (для анализа методами ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР соответственно) в 0,5 мл дейтерохлороформа (Carl Roth, кат. № 1004921). Спектры регистрировали на спектрометре Bruker AVANCE 400 III HD (Bruker Optik, Германия) с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно. Запись ИК-спектров проводили в диске KBr на инфракрасном Фурье-спектрометре ФСМ 2201 (ООО «Инфраспек», Россия) согласно ОФС.1.2.1.1.0002³; масса навески испытуемого образца составила 2 мг.

Дополнительно проводили элементный анализ (С, Н, N, O, S) с использованием CHNS(O) анализатора «EuroEA 3000» (Eurovector, Италия). Навеску образца высушивали до постоянной массы. Результаты анализа сопоставляли с теоретическим содержанием элементов, рассчитанным с помощью программного обеспечения ChemDraw Ultra 12.0.

Определение содержания 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина в СО проводили прямым (ацидиметрия в неводной среде) и непрямым (метод баланса масс согласно ОФС.1.1.0007⁴) методами. Определяли потерю в массе при высушивании и содержание неорганических примесей (сульфатной золы, тяжелых металлов) [18]. Для взвешивания использовали весы аналитические Acculab ALC-210d (Acculab, США, класс точности: I специальный).

Определение остаточных органических растворителей проводили неспецифическим испытанием «Потеря в массе при высушивании», допускаемым ОФС.1.1.0008⁵, так как при получении ДПДТК и его СО применяли растворитель с низкой токсичностью, этанол, относящийся к 3 классу опасности. Дополнительно проводили определение содержания этанола методом газовой хроматографии (ГХ) на газовом хроматографе PANNA 1949, оснащенном системой парофазного ввода HP 25, колонка DB-624 (30 м × 0,320 мм × 1,80 мкм). Показатель сульфатной золы определяли согласно ОФС.1.2.2.2.0014⁶, с массой навески 1,0 г; тяжелые металлы определяли согласно ОФС.1.2.2.2.0012⁷, метод 3Б. Потерю в массе при высушивании проводили согласно ОФС.1.2.1.0010.15, способ 1, с массой навески 0,2 г. Кислотно-основное титрование проводили в среде ледяной уксусной кислоты (х.ч., Scharlab, Испания) с потенциометрическим определением точки эквивалентности по методу Грана⁸. В качестве титранта применяли 0,1 М раствор хлорной кислоты (Acros Organics, Бельгия).

Родственные примеси определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью системы Ultimate 3000 (Thermo, Германия), включающей насос LPG-3400SD, автосемплер WPS-3000SL, термостат TCC-3000SD, диодно-матричный детектор DAD-3000 (длина волны 200–500 нм), колонку для обращенно-фазовой хроматографии Hypersil ODS (C18, 5 мкм, 120 Å, 4,6×250 мм) (Agilent Technologies, США). В качестве подвижной фазы использовали воду для хроматографии (Type I), трифторуксусную кислоту (≥99,5%, Fisher Chemical, lot. 1865834) и ацетонитрил (HLPC grade, Panreac, кат. № 221881.1612) в объемном соотношении 908:12:80. Для приготовления испытуемого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 50 мг СО ДПДТК и растворяли в 20 мл подвижной фазы, после чего объем колбы доводили до метки тем же растворителем. Хроматографические условия: скорость потока элюента — 1 мл/мин, объем вводимой пробы — 20 мкл, температура колонки — 30 °С, детектор диодно-матричный, время анализа — двукратное от времени удерживания основного вещества, так как в указанных условиях времена удерживания менее липофильных родственных примесей ДПДТК 8-бром-1,3-диметилксантина и 1-(тиран-2-илметил)пиперидина меньше времени удерживания пика основного вещества (СО).

Установление неопределенности аттестованного значения СО ДПДТК проводили согласно Р 50.2.058-2007 «Оценивание неопределенностей аттестованных значений стандартных образцов». Для определения аттестованного значения количественного содержания ДПДТК прямым методом (неводная ацидиметрия) проводили пять параллельных измерений материала СО. Суммарную стандартную неопределенность аттестованного значения (U_c(Â)) количественного содержания ДПДТК в СО методом неводного титрования рассчитывали по формуле (1)⁹.

(1)

где U_char — стандартная неопределенность от способа установления аттестованного значения СО; U_h — стандартная неопределенность от неоднородности материала СО; U_stab — стандартная неопределенность от нестабильности СО.

Результат неопределенности от нестабильности СО по показателю количественного содержания рассчитывали на основании изучения стабильности СО при температуре 25 °С в течение 6 мес. (к моменту расчета).

Расширенную неопределенность аттестованного значения (U_p(Â)) для прямого метода (титриметрии) рассчитывали согласно формуле (2).

(2)

где t_p(ν_c,eff) — квантиль распределения Стьюдента; U_с(Â) — суммарная стандартная неопределенность аттестованного значения.

Для определения аттестованного значения количественного содержания ДПДТК непрямым методом (баланс масс) проводили пять параллельных измерений материала СО по показателям потери в массе при высушивании, сульфатная зола. Расширенную неопределенность аттестованного значения (U_Att) количественного содержания ДПДТК в СО методом баланса масс рассчитывали по формуле (3) [18].

(3)

где U_h и U_stab — стандартные неопределенности от неоднородности и от нестабильности материала СО соответственно; U_X — комбинированная неопределенность результатов измерений потери в массе при высушивании сульфатной золы; k — коэффициент охвата 2 (вероятность охвата 0,95).

Источниками комбинированной неопределенности показателей сульфатной золы и потери в массе при высушивании являлись неопределенности, связанные со стандартным отклонением результатов измерений, с количеством взвешиваний и с погрешностью взвешивания весов (4).

(4)

где U_dry — стандартное отклонение результата измерения потери в массе при высушивании; U_sulf — стандартное отклонение результата измерения сульфатной золы; U_sc — неопределенность измерения, вносимая погрешностью весов при каждом взвешивании.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты спектрального анализа СО ДПДТК методами ИК и ЯМР (¹Н, ¹³С) представлены на рисунках 1, 2. Спектр ¹Н образца ДПДТК содержит следующие сигналы (DCl₃, δ, м.д., J/Гц): 4,62 (1Н, м, SCH); 4,39 (1Н, дд, J = 7,7 Гц, N-CH₂); 4,16 (1Н, дд, J = 7,3 Гц, N-CH₂); 3,40 (3Н, с, N-СН₃); 3,24 (3Н, с, N-СН₃); 2,40 (4Н, N(CН₂)₂); 1,50 (4Н, м, 2ССН₂), 1,37 (2Н, м, ССН₂). Спектр ¹³C образца ДПДТК содержит следующие сигналы (DCl₃, δ, м.д.): 156,77 (C⁵); 153,49 (C⁷); 152,27 (C³^’); 106,89 (C²^’); 62,02 (C⁷^”); 54,76 (C²^”); 51,98 (C³); 49,67 (C²); 29,86 (6-CH₃); 27,85 (8-CH₃), 25,81 (C³^”); 24,09 (C⁴^”). ЯМР ¹³C и ¹Н спектры исследуемого СО соответствуют структуре ДПДТК [19].

Для определения подлинности наиболее применим метод ИК-спектроскопии, поскольку в сочетании с хроматографическими методами обеспечивается надежность контроля подлинности при достаточно простых процедурах подготовки проб и собственно анализа. В ИК-спектре СО ДПДТК регистрируются полосы переменной интенсивности при 2940–2930 и 2795–2780 см⁻¹, характерные для С_sp3–Н и С_sp2–Н связей. Присутствуют характерные для ксантинов полосы высокой интенсивности, относящиеся к валентным колебаниям связей С=О ксантинового бицикла при 1715–1700 см⁻¹, перекрывающиеся с полосами поглощения С=С связей при 1670–1660 см⁻¹, а также полоса средней интенсивности при 1605–1580 см⁻¹, указывающая на С=N-связь в ксантиновом цикле [20]. Другие полосы поглощения (KBr) (ν, см⁻¹): 1475 (δ C_sp3–H), 1390–1380 (δ C_sp3–H₃), 1210–1190, (ν С_sp3–C_sp3), 750–740 (δ С–Н), 655 (δ С–Н), 667 (ν С–S)¹⁰. Также в спектре регистрируются полосы поглощения переменной интенсивности, относящиеся к валентным колебаниям С–N связей при 1390–1456 см⁻¹.

Результаты теоретического расчета элементного состава (C, H, N, O, S) СО ДПДТК соответствуют полученным экспериментальными данным. Потеря в массе при высушивании СО ДПДТК — 0,073±0,015%, содержание сульфатной золы — 0,080%±0,009%.

Методом ВЭЖХ оценивали содержание родственных примесей в диапазоне длин волн 200–500 нм, время удерживания пика основного вещества (ДПДТК) в описанных условиях составляло 7 мин. На хроматограмме в области детектирования не наблюдались другие пики, спектральная чистота пика ДПДТК составляла 0,9965, что свидетельствовало об отсутствии родственных примесей в СО. На рисунке 3 представлена репрезентативная хроматограмма СО ДПДТК при длине волны 295 нм (при данной длине волны наблюдается максимум поглощения).

Количественное содержание ДПДТК в СО, рассчитанное по методу баланса масс, составило 99,85±0,01%. При определении содержания 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина в СО методом неводного титрования (титр титранта по определяемому веществу, T_{HClO4/ДПДТК} = 33,54 мг/мл) рассчитанное значение составило 99,74±0,12%. Значения содержания ДПДТК в СО, полученные методами материального баланса и титриметрии, не имеют статистически значимых различий, поэтому в качестве аттестованного значения количественного содержания ДПДТК в СО предложено использовать значение, рассчитанное по методу баланса масс: 99,85±0,01% (U_Att = 0,035%) [18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования разработан способ получения первичного стандартного образца 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина и установлены основные параметры его аттестации. Реализован комплексный подход к характеристике разработанного стандартного образца — химическая структура подтверждена методами ИК- и ЯМР-спектроскопии, определены значения показателей потери в массе при высушивании, сульфатной золы, количественного содержания методом неводного титрования.

Разработанный стандартный образец может быть использован в качестве эталонного материала при проведении анализа по показателю «подлинность» и количественного определения 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина в лекарственных средствах с приписанным значением: 99,85±0,01% (U_Att = 0,035%).