Расширение арсенала средств, применяющихся для нормализации детоксицирующей функции печени, является одним из актуальных направлений разработки новых лекарственных средств в связи с напряженной эпидемиологической ситуацией и высокой смертностью от последствий гепатитов различной этиологии [1][2]. В ряду перспективных соединений с таким действием рассматриваются производные ксантина [3]. Соединения этой группы проявляют выраженные биологически активные свойства как ингибиторы триптофангидроксилазы, использующиеся для лечения заболеваний, связанных с избытком серотонина [4][5]; индукторы монооксигеназной системы гепатоцитов [7][8]; ингибиторы нуклеазы CAF1, подавляющие рост опухолей (гидроксипроизводные ксантинов) [6]; 7-замещенные производные обладают антиагрегационной активностью и антидепрессивными свойствами [9][10]. Еще одно производное ксантина, 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[  2,3-F]ксантин (ДПДТК) [11], избирательно и селективно воздействует на монооксигеназную систему гепатоцитов, вызывая индукцию цитохрома Р450 [12][13], что улучшает детоксицирующую функцию печени при токсическом повреждении и способствует защите клеток от окислительного стресса.

Разработка нового препарата предусматривает аналитическое сопровождение контроля качества этого препарата. Надлежащее функционирование системы контроля качества сырья, фармацевтической субстанции и лекарственных препаратов невозможно без применения в работе стандартных образцов (СО) [14]. В связи с отсутствием методик получения СО ДПДТК актуальной становится разработка способа получения первичного стандартного образца ДПДТК и последующая его аттестация.

Цель работы — разработка способа получения и проведение аттестации первичного стандартного образца 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина для последующего применения его в контроле качества лекарственных средств.

Первичный СО получали однократной перекристаллизацией ДПДТК (получен в лаборатории поиска малых таргетных молекул ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России) из этанола 96%. ДПДТК массой 10 г вносили в круглодонную колбу, приливали к нему 374 г этанола 96% и перемешивали при кипении в течение 30 мин, затем перемешивание останавливали и охлаждали раствор до +10 °С. Надосадочный раствор декантировали, выпавший осадок помещали на воронку Бюхнера с фильтровальной бумагой типа «Белая лента» и промывали 50 г этанола 96% под вакуумом. После отмывки осадок помещали в колбу роторного испарителя Laborota HEI-VAP Advantage Heidolph (Heidolph, Германия) с химической вакуумной системой MZ 2C NT + AK + M + D (Heidolph, Германия) и высушивали в течение 6 ч. Режим высушивания: температура +40 °С, остаточное давление — 20–30 мбар, скорость вращения — 40 об./мин.

При определении основных параметров аттестации использовали взаимодополняющие методы анализа. Для подтверждения структуры СО ДПДТК, согласно ОФС.1.1.00071, использовали методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и инфракрасной спектроскопии (ИК) [15–17]. Определение значений химических сдвигов в спектрах ядерного магнитного резонанса проводили согласно ОФС.1.2.1.1.00072. ДПДТК практически не растворим в воде и в этаноле 96% при комнатной температуре, поэтому образец для анализа методом ЯМР готовили растворением навесок 10 и 150 мг (для анализа методами 1Н ЯМР и ¹³С ЯМР соответственно) в 0,5 мл дейтерохлороформа (Carl Roth, кат. № 1004921). Спектры регистрировали на спектрометре Bruker AVANCE 400 III HD (Bruker Optik, Германия) с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно. Запись ИК-спектров проводили в диске KBr на инфракрасном Фурье-спектрометре ФСМ 2201 (ООО «Инфраспек», Россия) согласно ОФС.1.2.1.1.00023; масса навески испытуемого образца составила 2 мг.

Дополнительно проводили элементный анализ (С, Н, N, O, S) с использованием CHNS(O) анализатора «EuroEA 3000» (Eurovector, Италия). Навеску образца высушивали до постоянной массы. Результаты анализа сопоставляли с теоретическим содержанием элементов, рассчитанным с помощью программного обеспечения ChemDraw Ultra 12.0.

Определение содержания 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина в СО проводили прямым (ацидиметрия в неводной среде) и непрямым (метод баланса масс согласно ОФС.1.1.00074) методами. Определяли потерю в массе при высушивании и содержание неорганических примесей (сульфатной золы, тяжелых металлов) [18]. Для взвешивания использовали весы аналитические Acculab ALC-210d (Acculab, США, класс точности: I специальный).

Определение остаточных органических растворителей проводили неспецифическим испытанием «Потеря в массе при высушивании», допускаемым ОФС.1.1.00085, так как при получении ДПДТК и его СО применяли растворитель с низкой токсичностью, этанол, относящийся к 3 классу опасности. Дополнительно проводили определение содержания этанола методом газовой хроматографии (ГХ) на газовом хроматографе PANNA 1949, оснащенном системой парофазного ввода HP 25, колонка DB-624 (30 м × 0,320 мм × 1,80 мкм). Показатель сульфатной золы определяли согласно ОФС.1.2.2.2.00146, с массой навески 1,0 г; тяжелые металлы определяли согласно ОФС.1.2.2.2.00127, метод 3Б. Потерю в массе при высушивании проводили согласно ОФС.1.2.1.0010.15, способ 1, с массой навески 0,2 г. Кислотно-основное титрование проводили в среде ледяной уксусной кислоты (х.ч., Scharlab, Испания) с потенциометрическим определением точки эквивалентности по методу Грана8. В качестве титранта применяли 0,1 М раствор хлорной кислоты (Acros Organics, Бельгия).

Родственные примеси определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью системы Ultimate 3000 (Thermo, Германия), включающей насос LPG-3400SD, автосемплер WPS-3000SL, термостат TCC-3000SD, диодно-матричный детектор DAD-3000 (длина волны 200–500 нм), колонку для обращенно-фазовой хроматографии Hypersil ODS (C18, 5 мкм, 120 Å, 4,6×250 мм) (Agilent Technologies, США). В качестве подвижной фазы использовали воду для хроматографии (Type I), трифторуксусную кислоту (≥99,5%, Fisher Chemical, lot. 1865834) и ацетонитрил (HLPC grade, Panreac, кат. № 221881.1612) в объемном соотношении 908:12:80. Для приготовления испытуемого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 50 мг СО ДПДТК и растворяли в 20 мл подвижной фазы, после чего объем колбы доводили до метки тем же растворителем. Хроматографические условия: скорость потока элюента — 1 мл/мин, объем вводимой пробы — 20 мкл, температура колонки — 30 °С, детектор диодно-матричный, время анализа — двукратное от времени удерживания основного вещества, так как в указанных условиях времена удерживания менее липофильных родственных примесей ДПДТК 8-бром-1,3-диметилксантина и 1-(тиран-2-илметил)пиперидина меньше времени удерживания пика основного вещества (СО).

Установление неопределенности аттестованного значения СО ДПДТК проводили согласно Р 50.2.058-2007 «Оценивание неопределенностей аттестованных значений стандартных образцов». Для определения аттестованного значения количественного содержания ДПДТК прямым методом (неводная ацидиметрия) проводили пять параллельных измерений материала СО. Суммарную стандартную неопределенность аттестованного значения (Uc(Â)) количественного содержания ДПДТК в СО методом неводного титрования рассчитывали по формуле (1)9.

(1)

где Uchar — стандартная неопределенность от способа установления аттестованного значения СО; Uh — стандартная неопределенность от неоднородности материала СО; Ustab — стандартная неопределенность от нестабильности СО.

Результат неопределенности от нестабильности СО по показателю количественного содержания рассчитывали на основании изучения стабильности СО при температуре 25 °С в течение 6 мес. (к моменту расчета).

Расширенную неопределенность аттестованного значения (Up(Â)) для прямого метода (титриметрии) рассчитывали согласно формуле (2).

(2)

где tp(νc,eff) — квантиль распределения Стьюдента; Uс(Â) — суммарная стандартная неопределенность аттестованного значения.

Для определения аттестованного значения количественного содержания ДПДТК непрямым методом (баланс масс) проводили пять параллельных измерений материала СО по показателям потери в массе при высушивании, сульфатная зола. Расширенную неопределенность аттестованного значения (UAtt) количественного содержания ДПДТК в СО методом баланса масс рассчитывали по формуле (3) [18].

(3)

где Uh и Ustab — стандартные неопределенности от неоднородности и от нестабильности материала СО соответственно; UX — комбинированная неопределенность результатов измерений потери в массе при высушивании сульфатной золы; k — коэффициент охвата 2 (вероятность охвата 0,95).

Источниками комбинированной неопределенности показателей сульфатной золы и потери в массе при высушивании являлись неопределенности, связанные со стандартным отклонением результатов измерений, с количеством взвешиваний и с погрешностью взвешивания весов (4).

(4)

где Udry — стандартное отклонение результата измерения потери в массе при высушивании; Usulf — стандартное отклонение результата измерения сульфатной золы; Usc — неопределенность измерения, вносимая погрешностью весов при каждом взвешивании.

Результаты спектрального анализа СО ДПДТК методами ИК и ЯМР (¹Н, ¹³С) представлены на рисунках 1, 2. Спектр ¹Н образца ДПДТК содержит следующие сигналы (DCl3, δ, м.д., J/Гц): 4,62 (1Н, м, SCH); 4,39 (1Н, дд, J = 7,7 Гц, N-CH2); 4,16 (1Н, дд, J = 7,3 Гц, N-CH2); 3,40 (3Н, с, N-СН3); 3,24 (3Н, с, N-СН3); 2,40 (4Н, N(CН2)2); 1,50 (4Н, м, 2ССН2), 1,37 (2Н, м, ССН2). Спектр ¹³C образца ДПДТК содержит следующие сигналы (DCl3, δ, м.д.): 156,77 (C⁵); 153,49 (C⁷); 152,27 (C³’); 106,89 (C²’); 62,02 (C⁷”); 54,76 (C²”); 51,98 (C³); 49,67 (C²); 29,86 (6-CH3); 27,85 (8-CH3), 25,81 (C³”); 24,09 (C⁴”). ЯМР ¹³C и ¹Н спектры исследуемого СО соответствуют структуре ДПДТК [19].

Для определения подлинности наиболее применим метод ИК-спектроскопии, поскольку в сочетании с хроматографическими методами обеспечивается надежность контроля подлинности при достаточно простых процедурах подготовки проб и собственно анализа. В ИК-спектре СО ДПДТК регистрируются полосы переменной интенсивности при 2940–2930 и 2795–2780 см⁻¹, характерные для Сsp3–Н и Сsp2–Н связей. Присутствуют характерные для ксантинов полосы высокой интенсивности, относящиеся к валентным колебаниям связей С=О ксантинового бицикла при 1715–1700 см⁻¹, перекрывающиеся с полосами поглощения С=С связей при 1670–1660 см⁻¹, а также полоса средней интенсивности при 1605–1580 см⁻¹, указывающая на С=N-связь в ксантиновом цикле [20]. Другие полосы поглощения (KBr) (ν, см⁻¹): 1475 (δ Csp3–H), 1390–1380 (δ Csp3–H3), 1210–1190, (ν Сsp3–Csp3), 750–740 (δ С–Н), 655 (δ С–Н), 667 (ν С–S)10. Также в спектре регистрируются полосы поглощения переменной интенсивности, относящиеся к валентным колебаниям С–N связей при 1390–1456 см⁻¹.

Результаты теоретического расчета элементного состава (C, H, N, O, S) СО ДПДТК соответствуют полученным экспериментальными данным. Потеря в массе при высушивании СО ДПДТК — 0,073±0,015%, содержание сульфатной золы — 0,080%±0,009%.

Методом ВЭЖХ оценивали содержание родственных примесей в диапазоне длин волн 200–500 нм, время удерживания пика основного вещества (ДПДТК) в описанных условиях составляло 7 мин. На хроматограмме в области детектирования не наблюдались другие пики, спектральная чистота пика ДПДТК составляла 0,9965, что свидетельствовало об отсутствии родственных примесей в СО. На рисунке 3 представлена репрезентативная хроматограмма СО ДПДТК при длине волны 295 нм (при данной длине волны наблюдается максимум поглощения).

Количественное содержание ДПДТК в СО, рассчитанное по методу баланса масс, составило 99,85±0,01%. При определении содержания 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина в СО методом неводного титрования (титр титранта по определяемому веществу, THClO4/ДПДТК = 33,54 мг/мл) рассчитанное значение составило 99,74±0,12%. Значения содержания ДПДТК в СО, полученные методами материального баланса и титриметрии, не имеют статистически значимых различий, поэтому в качестве аттестованного значения количественного содержания ДПДТК в СО предложено использовать значение, рассчитанное по методу баланса масс: 99,85±0,01% (UAtt = 0,035%) [18].

В результате проведенного исследования разработан способ получения первичного стандартного образца 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина и установлены основные параметры его аттестации. Реализован комплексный подход к характеристике разработанного стандартного образца — химическая структура подтверждена методами ИК- и ЯМР-спектроскопии, определены значения показателей потери в массе при высушивании, сульфатной золы, количественного содержания методом неводного титрования.

Разработанный стандартный образец может быть использован в качестве эталонного материала при проведении анализа по показателю «подлинность» и количественного определения 6,8-диметил-2-пиперидинометил-2,3-дигидротиазоло[ 2,3-F]ксантина в лекарственных средствах с приписанным значением: 99,85±0,01% (UAtt = 0,035%).

1. ОФС.1.1.0007 Стандартные образцы. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 2. ОФС.1.2.1.1.0007 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 3. ОФС.1.2.1.1.0002 Спектрометрия в средней инфракрасной области. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 4. ОФС.1.1.0007 Стандартные образцы. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 5. ОФС.1.1.0008 Остаточные органические растворители. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 6. ОФС.1.2.2.2.0014 Сульфатная зола. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 7. ОФС.1.2.2.2.0012 Тяжелые металлы. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 8. Лысова СС, Скрипникова ТА, Зевацкий ЮЭ. Потенциометрия. Потенциометрическое титрование. СПб.: СПбГУПТД; 2017. 9. Р 50.2.058-2007. Оценивание неопределенностей аттестованных значений стандартных образцов. Рекомендации по метрологии. М.; 2008. 10. Преч Э, Бюльманн Ф, Аффольтер К. Определение строения органических соединений. Таблицы спектральных данных. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2006.