Качественный анализ листьев валерианы лекарственной методом тонкослойной хроматографии

ВВЕДЕНИЕ

Валериана лекарственная (Valeriana officinalis L., сем. Valerianaceae) — лекарственное растение, востребованное в фармацевтическом производстве лекарственных средств и биологически активных добавок к пище [1]. Широко распространена на большей части территории Европы, в том числе по всей территории Республики Беларусь и европейской части России. В диком виде больших зарослей не образует, потребность в лекарственном сырье удовлетворяется главным образом за счет промышленных плантаций [2][3].

В составе валерианы лекарственной обнаружено более 150 химических соединений: флавоноиды, лигнаны, сесквитерпены (валереновая кислота и ее производные, валеранон, валераналь и кессиловые эфиры), валепотриаты (вальтрат, дидровальтрат, ацевальтрат и изовалероксигидроксивальтрат), дубильные вещества, алкалоиды [4][5]. В корнях валерианы лекарственной, собранной в Испании, обнаружен гормон фитомелатонин [6]. В листьях и стеблях Valeriana officinalis var. latifolia, заготовленных в Китае, обнаружены в том числе иридоиды (валерианнолы A-S), алкалоид (5’-изовалерилуридин) [7].

Исследование состава летучих веществ листьев валерианы выявило наличие более 70 компонентов, из них идентифицировано 63: изовалериановая кислота, терпеноиды (эвгенол, линалоол, α-терпинеол, терпинен-4-ол, β-(Е)-ионон, миртенол, борнеол, Е-β-фарнезен, гермакрен, валерианол, валенсен, валеранон, α- и β-мууролен) и др. Установлено, что на состав и содержание отдельных соединений оказывает влияние таксономическая принадлежность и места произрастания растений: так, в листьях валерианы, заготовленной в окрестностях г. Запорожья, основными компонентами являются изовалериановая кислота, валеранон, валеренал, валерена-4,7(11)-диен, а в листьях валерианы, заготовленной в окрестностях г. Ярославля, — валерена-4,7(11)-диен, неофитодиен, валеранон, валеренал, борнилацетат [8][9].

Препараты из корневищ с корнями валерианы лекарственной широко применяются в неврологии при психоэмоциональных и когнитивных расстройствах, для лечения дисфункций вегетативной нервной системы у детей, при климактерических расстройствах, что обусловлено их седативным, антиаритмическим, спазмолитическим и противосудорожным действием [2][10–13]. Биологически активные вещества (БАВ) корневищ с корнями валерианы лекарственной являются фармакологически активными в отношении коррекции стресса, проявляют анксиолитические свойства [13–15]. Секоиридоиды и 4’-дезоксииридоидный гликозид (валерианол P, стеноптерин A и патрискабиоин C), выделенные из подземных органов растения, проявили антипролиферативную активность в исследовании in vitro [7]. Фенольные соединения надземной части растения Valeriana dioscoridis обладают антиоксидантной активностью и ингибируют активность ферментов [16]. Для суммы оксикоричных кислот, полученных из травы валерианы лекарственной, была доказана желчегонная активность, а для настойки и гранул травы валерианы — седативное действие [17][18].

При заготовке корневищ с корнями валерианы лекарственной как дикорастущей, так и с промышленных плантаций трава и листья являются неиспользуемым отходом. Накопление общей биомассы валерианы лекарственной в течение всего вегетационного периода нарастает неравномерно: от фенофазы «3–4 настоящих листа» до фенофазы «прекращение вегетации». Накопление надземной (листовая масса) и подземной (корневища с корнями) биомасс также происходит различными темпами: максимальное значение листовой биомассы в пределах фенологических фаз развития надземной части получено в фенофазу «прикорневой розетки листья», что позволяет проводить сбор листьев валерианы лекарственной с максимальным выходом биомассы. Корневища с корнями валерианы лекарственной заготавливают в фенофазу «прекращение вегетации», что согласуется с биологическими процессами накопления биомассы растения [19].

При анализе содержания суммы флавоноидов разных серий валерианы лекарственной в различных вегетативных органах выявлено, что содержание флавоноидов в листьях довольно высокое (1,22–3,25%) в сравнении с подземными органами валерианы лекарственной (0,008%). Стебли по содержанию флавоноидов значительно уступают листьям и содержат лишь следовое количество соединений этой группы (значения 0,32–1%), что делает нецелесообразным их присутствие в лекарственном растительном сырье (ЛРС)¹.

Таким образом, листья валерианы лекарственной являются перспективным лекарственным сырьем, содержание флавоноидов в которых превышает таковое в подземных органах растения, а сырьевые запасы достаточны для дополнительного источника данной группы БАВ. Поэтому изучение химического состава листьев валерианы лекарственной с целью стандартизации, возможности использования в медицине и разработки на их основе новых фитопрепаратов является целесообразным.

Корневища с корнями валерианы лекарственной являются фармакопейным сырьем, а препараты на их основе широко применяются в медицине. Сравнение химического состава и фармакологической активности БАВ корневищ с корнями и листьев растения позволит оценить возможность и выявить перспективную область применения препаратов из листьев.

В соответствии с фармакопейным анализом стандартизацию подземных органов валерианы лекарственной проводят методом тонкослойной хроматографии по сесквитерпеновым кислотам (валереновая и ацетоксивалереновая). В надземной части также обнаружены флавоноиды, что делает целесообразным проведение стандартизации листьев валерианы лекарственной методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) по сесквитерпеновым кислотам или фенольным соединениям (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты).

Цель работы — сравнительный фитохимический анализ биологически активных веществ листьев и корневищ с корнями валерианы лекарственной методом тонкослойной хроматографии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования: 3 партии листьев и корневищ с корнями валерианы лекарственной (сорт Превосходная), культивируемые в различных районах Минской области Республики Беларусь, заготовленные в августе 2023 г., высушенные методом воздушно-теневой сушки.

Предварительно проводился скрининг биологически активных веществ общепринятыми химическими реакциями на различные классы соединений (дубильные вещества, флавоноиды, сапонины, кумарины, антраценпроизводные, алкалоиды)².

Качественный анализ проводили методом ТСХ, для чего подбирали оптимальные условия экстракции и хроматографирования, позволяющие идентифицировать флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и сесквитерпеновые кислоты. Извлечения из подземных органов и листьев валерианы лекарственной проводили с использованием различных экстрагентов: для идентификации флавоноидов и фенолкарбоновых кислот применяли воду, спирт этиловый в различных концентрациях, что в соответствии с литературными данными должно обеспечивать извлечение данных групп БАВ [18]. Извлечение сесквитерпеновых кислот проводили в условиях, приведенных в Государственной фармакопее Республики Беларусь (табл. 1).

Для получения извлечений № 1–8 ЛРС, измельченное до грубого порошка с частицами размером 1400 мкм³, помещали в круглодонную колбу со шлифом, прибавляли в соотношении 1 (г) : 20 (мл) различные по природе экстрагенты (табл. 1) и нагревали с обратным холодильником на водяной бане (WB-12, ОДО «Белаквион») при температуре 70 °С в течение 30 мин, затем охлаждали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр.

Извлечения № 9–12 получали при обработке 1 г ЛРС, дополнительно измельченного до размера частиц 355 мкм⁴ и суспендированного в 10 мл экстрагента ультразвуком (ультразвуковая баня Nordberg) при частоте 40 кГц в течение 10 мин. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Для обнаружения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в извлечениях № 1–3, 5–7 в качестве неподвижной фазы использовали пластинки со слоем силикагеля (Sorbfil ПТСХ-АФ-А). Хроматографирование проводили в следующих подвижных фазах: этилацетат (х.ч., ООО «Мосреактив») — муравьиная кислота безводная (GR for analysis, Carlo Erba reagents) — вода (8:1:1), этилацетат — муравьиная кислота безводная — вода (10:2:3), уксусная кислота 2% (х.ч., ООО «Мосреактив»), уксусная кислота 15%.

В качестве растворов сравнения использовали 0,020% растворы СО рутина (MedChemExpress, кат. № HY-N0148), кверцетина (MedChemExpress, кат. № HY-18085), хлорогеновой кислоты (ThermoFisher Scientific, кат. № 10924), кофейной кислоты (MedChemExpress, кат. № HY-N0172) в 96% этаноле.

На стартовую линию хроматографической пластинки наносили по 20 мкл полученных извлечений из корневищ с корнями и из листьев, а также по 5 мкл растворов стандартных образцов (СО). Хроматографировали восходящим способом на высоту 8–10 см в вышеуказанных системах растворителей. Хроматограмму высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей, затем пластинку последовательно обрабатывали раствором аминоэтилового эфира дифенилборной кислоты в этаноле и макрогола 400 в этаноле, нагревали при температуре 105 °С в течение 5 мин и просматривали при дневном свете.

Для обнаружения сесквитерпеновых кислот хроматографирование полученных извлечений № 9–12 осуществляли на пластинках со слоем силикагеля (Merck TLC Silica gel 60 F₂₅₄) в следующих подвижных фазах: уксусная кислота ледяная — этилацетат — циклогексан (GR for analysis, Carlo Erba reagents) (2:38:60), этилацетат — гексан (х.ч., ООО «Мосреактив») (10:90)⁵, ацетон (ч.д.а., АО «Новокуйбышевская нефтехимическая компания») — гексан (1:2)⁶, гексан — этилацетат — уксусная кислота ледяная (65:35:0,5) [21]. В качестве растворов сравнения использовали 0,025% растворы СО валереновой кислоты (ВК) (Carl Roth, кат. № 4488), ацетоксивалереновой кислоты (АВК) (Carl Roth, кат. № 4446) в 96% этаноле.

На стартовую линию хроматографической пластинки наносили по 20 мкл извлечений из корневищ с корнями и листьев, а также по 5 мкл растворов ВК и АВК и хроматографировали восходящим способом на высоту 8–10 см в вышеуказанных системах растворителей. Хроматограмму высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей, затем пластинку обрабатывали раствором анисового альдегида⁷, нагревали при температуре 105 °С в течение 5 мин и просматривали при дневном свете.

Для определения валидационной характеристики «специфичность» проводили хроматографирование исследуемых экстрактов и стандартных образцов с использованием метода добавок. К 1 мл полученных извлечений добавляли 0,1 мл раствора стандартного образца, по 20 мкл полученных растворов наносили на линию старта и хроматографировали в условиях, описанных выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении качественного анализа извлечений (табл. 2) установлено, что листья валерианы лекарственной содержат флавоноиды, дубильные вещества, сапонины. Кумарины, антраценпроизводные и алкалоиды в исследуемых извлечениях обнаружены не были.

При подборе оптимальной подвижной фазы для обнаружения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот методом ТСХ было установлено, что наилучшее разделение (наибольшее число зон адсорбции) достигнуто при использовании в качестве подвижной фазы системы, состоящей из этилацетата — муравьиной кислоты безводной — воды (8:1:1) (рис. 1). Использование в качестве подвижных фаз растворов уксусной кислоты и смеси этилацетат — муравьиная кислота безводная — вода (10:2:3) не позволило разделить БАВ в исследуемых экстрактах.

На хроматограммах извлечений из листьев обнаружено 7 зон адсорбции различной окраски, а извлечений из корневищ с корнями — 6. Зоны 2–5 присутствовали в извлечениях как из листьев, так и из корневищ с корнями. Зоны 1 и 8 (соответствует хлорофиллу) обнаруживались только в извлечениях из листьев, а зона 7 — из корневищ с корнями. Интенсивность окраски зон увеличивалась с ростом концентрации экстрагента (этилового спирта). Зона 3 по значению коэффициента удерживания (Rf) и окраске соответствовала зоне СО рутина, а зона 4 — хлорогеновой кислоте. Зоны, соответствующие стандартным образцам кверцетина (зона оранжевого цвета) и кофейной кислоты (зона голубого цвета), имели значение Rf, близкое к 1, и не обнаруживались в исследуемых извлечениях. Следовательно, можно сделать вывод, что в листьях валерианы лекарственной содержатся рутин и хлорогеновая кислота, а кверцетин и кофейная кислота не найдены.

При сравнительном анализе водного и водно-спиртовых извлечений из листьев и корневищ с корнями валерианы выявлено одинаковое количество зон адсорбции.

При подборе оптимальной подвижной фазы для обнаружения сесквитерпеновых кислот было установлено, что наилучшее разделение (число и окраска зон адсорбции) достигнуто при использовании в качестве подвижной фазы системы, состоящей из уксусной кислоты ледяной — этилацетата — циклогексана (2:38:60) (рис. 2). Использование в качестве подвижной фазы смеси ацетон — гексан (1:2) позволило обнаружить до 10 зон адсорбции. Другие подвижные системы позволили обнаружить не более 5 зон адсорбции без их четкого разделения и при отсутствии границ между зонами адсорбции, в связи с чем использование таких подвижных фаз нецелесообразно.

При сравнении хроматограмм метанольных и этанольных извлечений не было обнаружено отличий, в связи с чем для извлечения сесквитерпеновых кислот рекомендуется использовать менее токсичный экстрагент — 96% этанол. В этанольных извлечениях из листьев и корневищ с корнями валерианы лекарственной идентифицированы ВК и АВК.

На хроматограмме листьев обнаруживаются 13 пятен различной окраски (от зеленой до темно-сине-фиолетовой), на хроматограмме корневищ с корнями обнаруживаются 12 зон адсорбции. 7 зон адсорбции со значениями Rf 0,85; 0,77; 0,72; 0,60; 0,56; 0,49; 0,46 обнаруживаются на хроматограмме как листьев, так и корневищ с корнями. При этом зоны со значениями Rf 0,72 и 0,60 соответствуют СО валереновой и ацетоксивалереновой кислот соответственно.

ТСХ-анализ флавоноидов, фенолкарбоновых и сесквитерпеновых кислот в предложенных условиях может использоваться для стандартизации и оценки качества нового ЛРС — листьев валерианы, содержащих флавоноиды (рутин), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая кислота), сесквитерпеновые кислоты (ВК и АВК).

ВЫВОДЫ

1. С помощью качественных реакций выявлено, что водные, водно-спиртовые и спиртовые извлечения валерианы лекарственной содержат флавоноиды, дубильные вещества и сапонины.
2. Методом тонкослойной хроматографии показано наличие валереновой, ацетоксивалереновой и хлорогеновой кислот, рутина как в листьях, так и в корневищах с корнями.
3. Листья валерианы лекарственной содержат флавоноиды (рутин), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая кислота), сесквитерпеновые кислоты (валереновая и ацетоксивалереновая кислоты). Необходимо проведение дальнейших исследований для определения количественного содержания этих БАВ и оценки целесообразности использования листьев валерианы в качестве источника для получения лекарственных растительных препаратов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.Ю. Фисюк — работа с источниками литературы, проведение эксперимента, формулировка выводов, написание текста рукописи; О.В. Мушкина — концепция работы, постановка задачи; О.А. Ёршик — участие в формулировании выводов, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; Н.С. Голяк — концепция исследования.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Alexander Yu. Fisiuk — work with literature sources, conducting an experiment, formulating conclusions, writing the text of the manuscript. Olga V. Mushkina — concept of work, statement of the problem. Olga A. Yorshyk — participation in the formulation of conclusions, approval of the final version of the manuscript for publication. Natalya S. Golyak — concept of research.