Валериана лекарственная (Valeriana officinalis L., сем. Valerianaceae) — лекарственное растение, востребованное в фармацевтическом производстве лекарственных средств и биологически активных добавок к пище [1]. Широко распространена на большей части территории Европы, в том числе по всей территории Республики Беларусь и европейской части России. В диком виде больших зарослей не образует, потребность в лекарственном сырье удовлетворяется главным образом за счет промышленных плантаций [2][3].

В составе валерианы лекарственной обнаружено более 150 химических соединений: флавоноиды, лигнаны, сесквитерпены (валереновая кислота и ее производные, валеранон, валераналь и кессиловые эфиры), валепотриаты (вальтрат, дидровальтрат, ацевальтрат и изовалероксигидроксивальтрат), дубильные вещества, алкалоиды [4][5]. В корнях валерианы лекарственной, собранной в Испании, обнаружен гормон фитомелатонин [6]. В листьях и стеблях Valeriana officinalis var. latifolia, заготовленных в Китае, обнаружены в том числе иридоиды (валерианнолы A-S), алкалоид (5’-изовалерилуридин) [7].

Исследование состава летучих веществ листьев валерианы выявило наличие более 70 компонентов, из них идентифицировано 63: изовалериановая кислота, терпеноиды (эвгенол, линалоол, α-терпинеол, терпинен-4-ол, β-(Е)-ионон, миртенол, борнеол, Е-β-фарнезен, гермакрен, валерианол, валенсен, валеранон, α- и β-мууролен) и др. Установлено, что на состав и содержание отдельных соединений оказывает влияние таксономическая принадлежность и места произрастания растений: так, в листьях валерианы, заготовленной в окрестностях г. Запорожья, основными компонентами являются изовалериановая кислота, валеранон, валеренал, валерена-4,7(11)-диен, а в листьях валерианы, заготовленной в окрестностях г. Ярославля, — валерена-4,7(11)-диен, неофитодиен, валеранон, валеренал, борнилацетат [8][9].

Препараты из корневищ с корнями валерианы лекарственной широко применяются в неврологии при психоэмоциональных и когнитивных расстройствах, для лечения дисфункций вегетативной нервной системы у детей, при климактерических расстройствах, что обусловлено их седативным, антиаритмическим, спазмолитическим и противосудорожным действием [2][10–13]. Биологически активные вещества (БАВ) корневищ с корнями валерианы лекарственной являются фармакологически активными в отношении коррекции стресса, проявляют анксиолитические свойства [13–15]. Секоиридоиды и 4’-дезоксииридоидный гликозид (валерианол P, стеноптерин A и патрискабиоин C), выделенные из подземных органов растения, проявили антипролиферативную активность в исследовании in vitro [7]. Фенольные соединения надземной части растения Valeriana dioscoridis обладают антиоксидантной активностью и ингибируют активность ферментов [16]. Для суммы оксикоричных кислот, полученных из травы валерианы лекарственной, была доказана желчегонная активность, а для настойки и гранул травы валерианы — седативное действие [17][18].

При заготовке корневищ с корнями валерианы лекарственной как дикорастущей, так и с промышленных плантаций трава и листья являются неиспользуемым отходом. Накопление общей биомассы валерианы лекарственной в течение всего вегетационного периода нарастает неравномерно: от фенофазы «3–4 настоящих листа» до фенофазы «прекращение вегетации». Накопление надземной (листовая масса) и подземной (корневища с корнями) биомасс также происходит различными темпами: максимальное значение листовой биомассы в пределах фенологических фаз развития надземной части получено в фенофазу «прикорневой розетки листья», что позволяет проводить сбор листьев валерианы лекарственной с максимальным выходом биомассы. Корневища с корнями валерианы лекарственной заготавливают в фенофазу «прекращение вегетации», что согласуется с биологическими процессами накопления биомассы растения [19].

При анализе содержания суммы флавоноидов разных серий валерианы лекарственной в различных вегетативных органах выявлено, что содержание флавоноидов в листьях довольно высокое (1,22–3,25%) в сравнении с подземными органами валерианы лекарственной (0,008%). Стебли по содержанию флавоноидов значительно уступают листьям и содержат лишь следовое количество соединений этой группы (значения 0,32–1%), что делает нецелесообразным их присутствие в лекарственном растительном сырье (ЛРС)1.

Таким образом, листья валерианы лекарственной являются перспективным лекарственным сырьем, содержание флавоноидов в которых превышает таковое в подземных органах растения, а сырьевые запасы достаточны для дополнительного источника данной группы БАВ. Поэтому изучение химического состава листьев валерианы лекарственной с целью стандартизации, возможности использования в медицине и разработки на их основе новых фитопрепаратов является целесообразным.

Корневища с корнями валерианы лекарственной являются фармакопейным сырьем, а препараты на их основе широко применяются в медицине. Сравнение химического состава и фармакологической активности БАВ корневищ с корнями и листьев растения позволит оценить возможность и выявить перспективную область применения препаратов из листьев.

В соответствии с фармакопейным анализом стандартизацию подземных органов валерианы лекарственной проводят методом тонкослойной хроматографии по сесквитерпеновым кислотам (валереновая и ацетоксивалереновая). В надземной части также обнаружены флавоноиды, что делает целесообразным проведение стандартизации листьев валерианы лекарственной методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) по сесквитерпеновым кислотам или фенольным соединениям (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты).

Цель работы — сравнительный фитохимический анализ биологически активных веществ листьев и корневищ с корнями валерианы лекарственной методом тонкослойной хроматографии.

Объекты исследования: 3 партии листьев и корневищ с корнями валерианы лекарственной (сорт Превосходная), культивируемые в различных районах Минской области Республики Беларусь, заготовленные в августе 2023 г., высушенные методом воздушно-теневой сушки.

Предварительно проводился скрининг биологически активных веществ общепринятыми химическими реакциями на различные классы соединений (дубильные вещества, флавоноиды, сапонины, кумарины, антраценпроизводные, алкалоиды)2.

Качественный анализ проводили методом ТСХ, для чего подбирали оптимальные условия экстракции и хроматографирования, позволяющие идентифицировать флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и сесквитерпеновые кислоты. Извлечения из подземных органов и листьев валерианы лекарственной проводили с использованием различных экстрагентов: для идентификации флавоноидов и фенолкарбоновых кислот применяли воду, спирт этиловый в различных концентрациях, что в соответствии с литературными данными должно обеспечивать извлечение данных групп БАВ [18]. Извлечение сесквитерпеновых кислот проводили в условиях, приведенных в Государственной фармакопее Республики Беларусь (табл. 1).

Для получения извлечений № 1–8 ЛРС, измельченное до грубого порошка с частицами размером 1400 мкм3, помещали в круглодонную колбу со шлифом, прибавляли в соотношении 1 (г) : 20 (мл) различные по природе экстрагенты (табл. 1) и нагревали с обратным холодильником на водяной бане (WB-12, ОДО «Белаквион») при температуре 70 °С в течение 30 мин, затем охлаждали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр.

Извлечения № 9–12 получали при обработке 1 г ЛРС, дополнительно измельченного до размера частиц 355 мкм4 и суспендированного в 10 мл экстрагента ультразвуком (ультразвуковая баня Nordberg) при частоте 40 кГц в течение 10 мин. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Для обнаружения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в извлечениях № 1–3, 5–7 в качестве неподвижной фазы использовали пластинки со слоем силикагеля (Sorbfil ПТСХ-АФ-А). Хроматографирование проводили в следующих подвижных фазах: этилацетат (х.ч., ООО «Мосреактив») — муравьиная кислота безводная (GR for analysis, Carlo Erba reagents) — вода (8:1:1), этилацетат — муравьиная кислота безводная — вода (10:2:3), уксусная кислота 2% (х.ч., ООО «Мосреактив»), уксусная кислота 15%.

В качестве растворов сравнения использовали 0,020% растворы СО рутина (MedChemExpress, кат. № HY-N0148), кверцетина (MedChemExpress, кат. № HY-18085), хлорогеновой кислоты (ThermoFisher Scientific, кат. № 10924), кофейной кислоты (MedChemExpress, кат. № HY-N0172) в 96% этаноле.

На стартовую линию хроматографической пластинки наносили по 20 мкл полученных извлечений из корневищ с корнями и из листьев, а также по 5 мкл растворов стандартных образцов (СО). Хроматографировали восходящим способом на высоту 8–10 см в вышеуказанных системах растворителей. Хроматограмму высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей, затем пластинку последовательно обрабатывали раствором аминоэтилового эфира дифенилборной кислоты в этаноле и макрогола 400 в этаноле, нагревали при температуре 105 °С в течение 5 мин и просматривали при дневном свете.

Для обнаружения сесквитерпеновых кислот хроматографирование полученных извлечений № 9–12 осуществляли на пластинках со слоем силикагеля (Merck TLC Silica gel 60 F254) в следующих подвижных фазах: уксусная кислота ледяная — этилацетат — циклогексан (GR for analysis, Carlo Erba reagents) (2:38:60), этилацетат — гексан (х.ч., ООО «Мосреактив») (10:90)5, ацетон (ч.д.а., АО «Новокуйбышевская нефтехимическая компания») — гексан (1:2)6, гексан — этилацетат — уксусная кислота ледяная (65:35:0,5) [21]. В качестве растворов сравнения использовали 0,025% растворы СО валереновой кислоты (ВК) (Carl Roth, кат. № 4488), ацетоксивалереновой кислоты (АВК) (Carl Roth, кат. № 4446) в 96% этаноле.

На стартовую линию хроматографической пластинки наносили по 20 мкл извлечений из корневищ с корнями и листьев, а также по 5 мкл растворов ВК и АВК и хроматографировали восходящим способом на высоту 8–10 см в вышеуказанных системах растворителей. Хроматограмму высушивали на воздухе до удаления запаха растворителей, затем пластинку обрабатывали раствором анисового альдегида7, нагревали при температуре 105 °С в течение 5 мин и просматривали при дневном свете.

Для определения валидационной характеристики «специфичность» проводили хроматографирование исследуемых экстрактов и стандартных образцов с использованием метода добавок. К 1 мл полученных извлечений добавляли 0,1 мл раствора стандартного образца, по 20 мкл полученных растворов наносили на линию старта и хроматографировали в условиях, описанных выше.

При проведении качественного анализа извлечений (табл. 2) установлено, что листья валерианы лекарственной содержат флавоноиды, дубильные вещества, сапонины. Кумарины, антраценпроизводные и алкалоиды в исследуемых извлечениях обнаружены не были.

При подборе оптимальной подвижной фазы для обнаружения флавоноидов и фенолкарбоновых кислот методом ТСХ было установлено, что наилучшее разделение (наибольшее число зон адсорбции) достигнуто при использовании в качестве подвижной фазы системы, состоящей из этилацетата — муравьиной кислоты безводной — воды (8:1:1) (рис. 1). Использование в качестве подвижных фаз растворов уксусной кислоты и смеси этилацетат — муравьиная кислота безводная — вода (10:2:3) не позволило разделить БАВ в исследуемых экстрактах.

На хроматограммах извлечений из листьев обнаружено 7 зон адсорбции различной окраски, а извлечений из корневищ с корнями — 6. Зоны 2–5 присутствовали в извлечениях как из листьев, так и из корневищ с корнями. Зоны 1 и 8 (соответствует хлорофиллу) обнаруживались только в извлечениях из листьев, а зона 7 — из корневищ с корнями. Интенсивность окраски зон увеличивалась с ростом концентрации экстрагента (этилового спирта). Зона 3 по значению коэффициента удерживания (Rf) и окраске соответствовала зоне СО рутина, а зона 4 — хлорогеновой кислоте. Зоны, соответствующие стандартным образцам кверцетина (зона оранжевого цвета) и кофейной кислоты (зона голубого цвета), имели значение Rf, близкое к 1, и не обнаруживались в исследуемых извлечениях. Следовательно, можно сделать вывод, что в листьях валерианы лекарственной содержатся рутин и хлорогеновая кислота, а кверцетин и кофейная кислота не найдены.

При сравнительном анализе водного и водно-спиртовых извлечений из листьев и корневищ с корнями валерианы выявлено одинаковое количество зон адсорбции.

При подборе оптимальной подвижной фазы для обнаружения сесквитерпеновых кислот было установлено, что наилучшее разделение (число и окраска зон адсорбции) достигнуто при использовании в качестве подвижной фазы системы, состоящей из уксусной кислоты ледяной — этилацетата — циклогексана (2:38:60) (рис. 2). Использование в качестве подвижной фазы смеси ацетон — гексан (1:2) позволило обнаружить до 10 зон адсорбции. Другие подвижные системы позволили обнаружить не более 5 зон адсорбции без их четкого разделения и при отсутствии границ между зонами адсорбции, в связи с чем использование таких подвижных фаз нецелесообразно.

При сравнении хроматограмм метанольных и этанольных извлечений не было обнаружено отличий, в связи с чем для извлечения сесквитерпеновых кислот рекомендуется использовать менее токсичный экстрагент — 96% этанол. В этанольных извлечениях из листьев и корневищ с корнями валерианы лекарственной идентифицированы ВК и АВК.

На хроматограмме листьев обнаруживаются 13 пятен различной окраски (от зеленой до темно-сине-фиолетовой), на хроматограмме корневищ с корнями обнаруживаются 12 зон адсорбции. 7 зон адсорбции со значениями Rf 0,85; 0,77; 0,72; 0,60; 0,56; 0,49; 0,46 обнаруживаются на хроматограмме как листьев, так и корневищ с корнями. При этом зоны со значениями Rf 0,72 и 0,60 соответствуют СО валереновой и ацетоксивалереновой кислот соответственно.

ТСХ-анализ флавоноидов, фенолкарбоновых и сесквитерпеновых кислот в предложенных условиях может использоваться для стандартизации и оценки качества нового ЛРС — листьев валерианы, содержащих флавоноиды (рутин), фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая кислота), сесквитерпеновые кислоты (ВК и АВК).

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.Ю. Фисюк — работа с источниками литературы, проведение эксперимента, формулировка выводов, написание текста рукописи; О.В. Мушкина — концепция работы, постановка задачи; О.А. Ёршик — участие в формулировании выводов, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; Н.С. Голяк — концепция исследования.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Alexander Yu. Fisiuk — work with literature sources, conducting an experiment, formulating conclusions, writing the text of the manuscript. Olga V. Mushkina — concept of work, statement of the problem. Olga A. Yorshyk — participation in the formulation of conclusions, approval of the final version of the manuscript for publication. Natalya S. Golyak — concept of research.

1. Талашова СВ. Фармакогностическое изучение, стандартизация и комплексная переработка валерианы лекарственной: автореф. … дис. канд. фарм. наук. М.; 1996. 2. Самылина ИА, Яковлев ГП. Фармакогнозия: учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2016. 3. В соответствии с ФС.01/2013:20912 Ситовой анализ (Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2 изд. Молодечно; 2012) не менее 97% порошка должно проходить через сито с размером отверстий 1400 мкм. 4. ФС.01/2013:20912. Ситовой анализ. Государственная фармакопея Республики Беларусь. II изд. Т. 1. Молодечно; 2012. 5. Государственная фармакопея Республики Беларусь. II изд. Т. 2. Молодечно; 2016. 6. ФС.2.5.0009.15 Валерианы лекарственной корневища с корнями. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 7. ОФС.01/2013:40101 Реактивы. Государственная фармакопея Республики Беларусь. II изд. Т. 1. Молодечно; 2012.