Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве гречихи красностебельной (Fagopyrum rubricaulis) методом спектрофотометрии

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы внимание исследователей сосредоточено на поиске растений, произрастающих на территории Российской Федерации, которые могут быть источниками для получения биологически активных соединений, в том числе полифенольных соединений. Гречиха красностебельная (Fagopyrum rubricaulis) — однолетнее растение, культивируемое на территории Российской Федерации в промышленных масштабах [1][2], в цветках и листьях которого содержится большое количество флавоноидов [3]. Основным флавоноидом травы гречихи красностебельной является рутин (витамин Р), содержание которого в надземной части растения варьирует от 5,39 до 11,2%, что значительно больше, чем в гречихе посевной (до 4,01%) [4]. В траве гречихи красностебельной также присутствуют кверцетин, изокверцетин, ориентин, витексин и другие флавоноиды [5]. Помимо флавоноидов в надземной части обнаружены фенилпропаноиды (хлорогеновая и кофейная кислоты) и фенолкарбоновые кислоты (протокатеховая, галловая) [6]. Плоды гречихи красностебельной характеризуются высоким содержанием белков, углеводов, жирных и органических кислот [7], витаминами группы В и каротиноидами [8]. Минеральный состав представлен солями кальция, меди, железа, фосфора.

Несмотря на широкий спектр фармакологических эффектов (сырье гречихи красностебельной обладает антимикробными, противовоспалительными, противоаллергическими, антиканцерогенными и антигипертензивными свойствами [9–11], гречиха красностебельная не является фармакопейным растением. Для разработки нормативной документации на растительное сырье «Гречихи красностебельной трава» необходимо определить нормируемые показатели и разработать методы количественного определения биологически активных соединений.

Фармакологическая активность экстрактов гречихи зависит от комплекса флавоноидов: рутин, кверцетин, ориентин, витексин. По данным источников литературы, в настоящее время используют следующие методики количественного определения флавоноидов: спектрофотометрия [12–14], высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым и масс-спектрометрическим-детектированием [15–18], спектроскопия ядерного магнитного резонанса [19][20]. По данным [21], методики высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием используются для идентификации и количественного определения индивидуальных соединений в сырье и лекарственных растительных препаратах.

Для количественного определения суммы флавоноидов нами была выбрана методика дифференциальной спектрофотометрии как наиболее доступный, быстрый и недорогой метод количественного определения.

Цель работы — разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве гречихи красностебельной с использованием дифференциальной спектрофотометрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служила гречихи красностебельной трава, собранная в фазу массового цветения и начала плодоношения на территории Пензенской обл. в Камешкирском р‑не в период с 25 июля по 10 августа 2024 г. Свежесобранную траву гречихи красностебельной сушили в сушильных шкафах (ШС-80-02 СПУ) при температуре не выше 40 °C, измельчение сырья проводили в лабораторных мельницах (ML-08B). Образцы взвешивали на лабораторных аналитических весах (AND GR-120). Определение влажности сырья проводили согласно ОФС.1.5.3.0007 «Определение влажности лекарственного растительного сырья и лекарственных средств растительного происхождения» Государственной фармакопеи Российской Федерации XV изд. Извлечение из травы гречихи красностебельной производили методом мацерации с использованием в качестве экстрагента спирта этилового 40, 70 и 95% при температуре 90 °C. Подтверждение наличия флавоноидов в водно-спиртовых экстрактах осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках марки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А-УФ. В качестве стандартного образца (СО) использовали растворы рутина (98,5%, ООО «Геофарма»), кверцетина (98,5%, ООО «Геофарма»), витексина (98%, кат. № 49513, Sigma-Aldrich), изовитексина (98%, кат. № 17804, Sigma-Aldrich), ориентина (97%, кат. № O9765, Sigma-Aldrich), изоориентина (95%, кат. № I1536, Sigma-Aldrich). Элюирование проводили в системе н-бутанол (ч.д.а., 99,70%, ООО «НеваРеактив») — ледяная уксусная кислота (х.ч., 99,8%, ООО «Компонент-Реактив») — вода (4:1:2), после полного высушивания детекцию осуществляли в видимом свете; далее при облучении УФ-светом с длинами волн λ=254 и λ=365 нм в флуоресцентном аналитическом кабинете УФС-254/365 («Петролазер»). В последующем пластинки обрабатывали 3% спиртовым раствором алюминия хлорида (ч., 98,50%, ACROS).

Для определения количественного содержания суммы флавоноидов в траве гречихи красностебельной использовали метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на батохромном сдвиге спектра поглощения в присутствии раствора алюминия хлорида. К 0,5 мл водно-спиртовых извлечений прибавляли 2 мл раствора алюминия хлорида 3% и несколько капель 30% уксусной кислоты. В качестве раствора сравнения использовали раствор, приготовленный при тех же условиях, но в отсутствие алюминия хлорида. Определение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-102 (ЗАО «НПКФ Аквилон»). Для расчета суммы флавоноидов в пересчете на рутин в сырье гречихи красностебельной использовали раствор СО рутина.

Статистическая обработка результатов исследования и валидация методики проведены в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации¹ с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2019.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для качественной идентификации флавоноидов в извлечениях гречихи красностебельной использовали метод тонкослойной хроматографии. В результате проведенного исследования выделены шесть зон (рис. 1), которые имели окраску от светло-желтого до желто-коричневого цвета. Обработка пластины раствором алюминия хлорида 3% повышает селективность проявления флавоноидов при рассмотрении в УФ свете с λ=365 нм (желтая флуоресценция). Сравнение факторов замедления (R_f) зон флавоноидов на хроматограммах исследуемого и стандартных образцов позволило сделать вывод о наличии в траве гречихи красностебельной рутина, кверцетина, витексина, изовитексина, ориентина и изоориентина.

Спектры поглощения извлечений исследуемого растения имеют максимумы при 352 нм, характерные для веществ флавоноидной природы [22]. Следует отметить, что природа экстрагента не влияла на величину длины волны максимума поглощения. В присутствии алюминия хлорида наблюдался батохромный сдвиг электронного спектра поглощения экстрактов травы гречихи красностебельной с максимумом поглощения, аналогичным раствору СО рутина (410 нм) (рис. 2), поэтому при проведении количественного определения суммы флавоноидов в экстрактах из травы гречихи красностебельной в качестве стандартного образца нами был выбран рутин.

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в сырье гречихи красностебельной были определены оптимальные условия проведения экстракции (табл. 1). Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

По результатам проведенных экспериментов разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье гречихи красностебельной. Точную навеску сырья гречихи с влажностью 8%, проходящего через сито с диаметром отверстий 2 мм, массой 1 г помещали в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл и заливали 25 мл спирта этилового 40%. Колбу закрывали пробкой, взвешивали на лабораторных весах с точностью ±0,01 г, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане 30 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы колбы. Извлечения фильтровали через бумажный беззольный фильтр (красный) (раствор А).

0,5 мл извлечения (раствора А) количественно переносили в мерную колбу на 50 мл, прибавляли 2 мл раствора алюминия хлорида 3% в спирте этиловом 95% и через 10 мин — 2 капли уксусной кислоты 30%. Объем раствора доводили до метки экстрагентом и оставляли на 30 мин (раствор Б).

0,5 мл извлечения (раствора А) количественно переносили в мерную колбу на 50 мл, прибавляли через 10 мин — 2 капли уксусной кислоты 30%. Объем раствора доводили до метки экстрагентом и оставляли на 30 мин (раствор сравнения).

Измерение оптической плотности раствора Б проводили через 30 мин на спектрофотометре СФ-102 при 410 нм относительно раствора сравнения.

Приготовление раствора СО рутина: 20 мг СО с содержанием основного вещества 98,5% помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и растворяли при нагревании на водяной бане в 10 мл спирта этилового 40%, охлаждали, недостающий объем раствора восполняли спиртом этиловым 40% и перемешивали (раствор А СО рутина).

1 мл раствора А СО рутина количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл раствора алюминия хлорида 3% в спирте этиловом 95% и через 10 мин — 2 капли уксусной кислоты 30%. Объем раствора доводили до метки экстрагентом и оставляли на 30 мин (раствор Б).

1 мл раствора А СО рутина количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, прибавляли через 10 мин 2 капли уксусной кислоты 30%. Объем раствора доводили до метки экстрагентом и оставляли на 30 мин (раствор сравнения).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и сухое сырье (X, %) вычисляли по формуле (1):

(1)

где A — оптическая плотность испытуемого раствора; А0 — оптическая плотность раствора СО рутина; m0 — масса СО рутина, г; m — масса сырья, г; W — потеря в массе при высушивании, %; Р — содержание основного вещества в СО рутина, %.

Специфичность методики оценивали по соответствию максимумов поглощения комплексов флавоноидов из травы гречихи красностебельной и раствора стандартного образца рутина с раствором алюминия хлорида 3% (рис. 2). Линейность методики определяли для серии растворов рутина (с концентрацией от 0,002 до 0,012 мг/мл). По полученным данным строили график зависимости значений оптической плотности раствора рутина от концентрации рутина и рассчитывали параметры уравнения линейной регрессии. Коэффициент корреляции составил 0,9967.

Прецизионность методики оценивали путем анализа исследуемого образца гречихи красностебельной в 5-кратной повторности при одинаковых условиях. Согласно полученным результатам среднее значение (X) составило 10,08%, стандартное отклонение S=0,19, относительное стандартное отклонение среднего результата RSD=1,88%, полуширина доверительного интервала ΔX=0,23). Погрешность среднего результата (ε, %) суммы флавоноидов с доверительной вероятностью (Р, %) 95% в сырье гречихи красностебельной составила ±2,28%.

Для оценки внутрилабораторной прецизионности количественный анализ спиртового экстракта проводился другим аналитиком в другие дни с использованием того же оборудования пятикратно. Выявлено, что ошибка среднего результата с доверительной вероятностью 95% составляет не более 3,12% при определении суммы флавоноидов методом спектрофотометрии в пересчете на рутин. Расчетное значение t-критерия Стьюдента 0,01<2,306 (95%; 8); F-критерия Фишера 1,5<5,05. Следовательно, дисперсии результатов анализа обоих химиков статистически эквивалентны и различия между полученными значениями не значимы.

Правильность методики определяли путем рассмотрения результатов изучения линейности валидируемой методики по формуле (2):

Δb=t(0,05, n–1)×S_b , (2)

где Δb — доверительный интервал свободного члена; t(0,05; n–1) — коэффициент Стьюдента, где 0,05 — уровень значимости; S_b — стандартное отклонение свободного члена.

В результате расчета выявили, что свободный член уравнения (2) меньше доверительного интервала (0,0227<0,25). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки разработанной нами методики и позволяют рекомендовать ее для количественного определения суммарного содержания флавоноидов в траве гречихи красностебельной в пересчете на рутин.

С помощью разработанной методики были проанализированы четыре образца травы гречихи красностебельной производства ООО «Парафарм». Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин варьировало от 9,15±0,20 до 9,55±0,11%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наличие флавоноидов в спиртовом экстракте травы гречихи красностебельной было подтверждено методом тонкослойной хроматографии. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сырье исследуемого растения методом дифференциальной спектрофотомерии с использованием стандартного образца рутина при аналитической длине волны 410 нм. Установлены оптимальные параметры экстракции флавоноидов из травы гречихи красностебельной: экстрагент — спирт этиловый 40%, соотношение сырье : экстрагент 1:25 и продолжительность экстракции 30 мин при температуре 90 °С.

На основе результатов валидационной оценки эксперимента можно сделать вывод о возможности использования данной методики для количественного определения содержания флавоноидов в пересчете на рутин в сырье гречихи красностебельной. Полученные результаты имеют большое значение для дальнейших исследований гречихи красностебельной в качестве перспективного источника биологически активных соединений.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.В. Митишев — написание текста рукописи, валидация методики, формулировка выводов, статистическая обработка результатов; Е.Е. Курдюков — разработка методики, написание текста рукописи; М.Г. Макарцева — разработка методики; Я.М. Немова — работа с источниками литературы; Д.Г. Елистратов — концепция работы, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; А.С. Паксяев — участие в формулировании выводов, концепция работы.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Alexander V. Mitishev drafted the manuscript, validated the analytical procedure, formulated the conclusions, and performed statistical analysis of the results. Evgeny E. Kurdyukov developed the analytical procedure and drafted the manuscript. Marina G. Makartseva developed the analytical procedure. Yana M. Nemova worked with literature sources. Dmitry G. Elistratov conceptualised the study and approved the final version of the manuscript for publication. Alexey S. Paksyaev formulated the conclusions and conceptualised the study.