Исключение влияния экзогенного загрязнения на микроэлементный состав лекарственных растений

ВВЕДЕНИЕ

Макро- и микроэлементы, входящие в состав биологически активных веществ (ферментов, гормонов и витаминов), необходимы для нормального функционирования организма человека, участвуют в метаболизме белков, липидов, полисахаридов и тем самым регулируют анаболические процессы, теплообмен, кроветворение, иммунный ответ и др. [1]. Примером дисэлементоза является железодефицитная анемия, связанная с недостатком микроэлементов кроветворного комплекса (Fe, Mn, Cu, Cr)¹ [2]. Эссенциальные элементы для животного и растительного организма во многом одинаковы², поэтому растения можно рассматривать как источник получения препаратов, эффективных для лечения анемии³ и для профилактики латентного железодефицита. Микроэлементный состав каждого растения является видоспецифичным, что может быть использовано в задачах хемосистематики [3], а также для контроля примесей при анализе сырья на доброкачественность [4].

Наряду с эндогенными элементами, содержание которых определяется геномом растения, растительное сырье может быть загрязнено элементами, поступающими экзогенным путем. Как правило, растения имеют опушение из простых и железистых трихом, которые задерживают различные поллютанты, в том числе элементные примеси из окружающей среды, и способствуют их накоплению [5].

Для количественного определения элементов в растительном сырье используют один из трех методов: атомно-абсорбционную спектрометрию, атомно-эмиссионную спектрометрию, масс-спектрометрию с индуктивно-связанной плазмой⁴. Следует отметить, что любой из этих методов определения содержания элементов инвариантен по отношению к путям поступления элементов в растительный объект и не позволяет различить эндо- и экзогенные элементы.

Устранить экзогенное загрязнение наиболее эффективно можно на стадии пробоподготовки. В настоящий момент согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации⁵ пробоподготовка сырья для количественного определения микроэлементов ограничивается стадией измельчения сырья до частиц размером менее 1–3 мм. Используемая фармакопейная методика позволяет выявить недопустимое загрязнение сырья микроэлементами-токсикантами, что необходимо для оценки безопасности лекарственных растительных препаратов [4]. Но для корректного использования микроэлементного статуса растения в задачах определения его подлинности (видовой принадлежности) или доброкачественности растительного сырья необходимо минимизировать влияние присутствия экзогенных микроэлементов-поллютантов на результат анализа. Одним из способов минимизации экзогенного загрязнения является соблюдение правил сбора растительного сырья и исключение сбора сырья в экологически неблагополучных местах произрастания⁶ [5][6]. Однако даже соблюдение этих правил не гарантирует отсутствия экзогенного загрязнения элементами из почвы или осадков в экологически чистых местах произрастания.

Цель работы — модификация методики определения содержания макро- и микроэлементов в растительном сырье для исключения влияния экзогенного загрязнения на результаты анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были выбраны растения семейства бурачниковых, для которых характерно обильное опушение всех надземных органов, что существенно увеличивает возможность экзогенного загрязнения. Первый объект — генеративные побеги медуницы мягкой — Pulmonaria mollis Wulf. ex Hornem. (было установлено антианемическое действие извлечений из этого вида растительного сырья [7]), собранные в фазу цветения в сосновом бору в Колыванском районе Новосибирской области (55º12´ с.ш. и 82º42´ в.д.). Сырье, доведенное до воздушно-сухого состояния, измельчали в ротационной мельнице TSM6A (Bosch) и разделяли на фракции с помощью лабораторных сит («Экрос») с размерами ячеек 7,0; 5,0; 3,0; 2,0; 1,0 0,5; 0,2 мм (табл. 1).

Вторым объектом являлись листья бурачника лекарственного — Borago officinalis L., выращенного на садовом участке в Советском районе г. Новосибирска (54º91´ с.ш. и 83º08´ в.д.). После сбора листья в естественных условиях доводили до воздушно-сухого состояния. Высушенные листья бурачника лекарственного разделяли на две равные части. Одну часть листьев оставляли в качестве контрольной (сырье без добавки), вторую часть раскладывали на чистой поверхности и наносили на эти листья методом опрыскивания смесь растворимых солей, содержащую 5,0 мг магния, 1,3 мг железа, 0,25 мг алюминия, 0,132 мг цинка, 0,018 мг меди и 0,0017 мг свинца (сырье с добавками-поллютантами). Для внесения заданного количества загрязняющих элементов использовали реактивы: магния сульфат 7-водный (Acros Organics, кат. № 213115000); свинца(II) нитрат (Panreac, кат. № 131473.1210); железа(II) сульфат 7-водный (Panreac, кат. № 141362.1211); цинк сернокислый 7-водный (Panreac, кат. № 141787.1211); алюминий хлорид 6-водный (Merck, кат. № 1.01084.) и медь(II) сернокислая 5-водная («Ленреактив», кат. № 120194).

После нанесения поллютантов сырье снова доводили до воздушно-сухого состояния при комнатных условиях. Оба вида сырья бурачника лекарственного (с добавкой и без добавки) измельчали в ротационной мельнице и формировали из них группу объектов 1–4 (табл. 2).

Количественное определение элементов проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе ELAN DRC-II (Perkin Elmer Inc.). 0,1–0,2 г измельченного сырья (точная навеска) помещали во фторопластовый вкладыш автоклава и добавляли 5 мл концентрированной азотной кислоты («Ленреактив», кат. № 011584), а для определения кремния использовали смесь 5 мл концентрированной азотной кислоты с 0,5 мл кислоты фтористоводородной («Ленреактив», кат. № 200629). Автоклав герметично закрывали и помещали в микроволновую печь. Разложение пробы проводили при ступенчатом подъеме температуры до 160, 180 и 200 ºС с выдерживанием автоклава на каждой температурной ступени в течение 1 ч. После охлаждения автоклавы открывали в вытяжном шкафу и полученные растворы количественно переносили в предварительно взвешенные полиэтиленовые бюксы. В каждый бюкс добавляли по 0,1 мл раствора соли индия с концентрацией 1,0 мг/л (внутренний стандарт) и воды очищенной до общего объема раствора 7–8 мл. Затем доводили массу растворов в бюксах до 10 г. Для контрольного опыта в реакционных емкостях проводили описанные выше процедуры без анализируемого образца. Для контроля правильности определения использовали метод добавок.

Для построения калибровочных графиков использовали многоэлементные стандартные растворы ICP-MS-68-A и ICP-MS-68-В 0,01 г/л, а также одноэлементный стандартный раствор Hg 1 г/л (все — High-Purity Standards). Стабильность градуировочных характеристик контролировали путем сравнения результатов определения содержания введенного внутреннего стандарта индия (¹¹⁵In) в каждом анализируемом образце.

Параметры работы масс-спектрометра: мощность генератора 1500 Вт; распылитель — поперечно-потоковый, материал РЕЕК, сапфировые наконечники; распылительная камера — неохлаждаемая двухходовая, тип Скотта, материал — ритон. Расход плазмообразующего потока аргона (аргон газообразный высшего сорта по ГОСТ 10157-2016) — 15 л/мин; расход анализируемого образца — 1,5 мл/мин. Для обеспечения стабильного режима работы масс-спектрометра все измерения проводили в термостатированных условиях при температуре 22,0±1,5 ºС.

Проводили пять параллельных определений для каждого анализируемого образца, за результат принимали среднее значение. Статистическую обработку полученных результатов проводили согласно методическим рекомендациям⁷. Для проверки нормальности выборки использовали критерий Граббса (G), рассчитываемый как отношение максимальной разницы между средним и экстремальным значением к величине среднеквадратичного отклонения. Если рассчитанные значения превышали табличное критическое значение критерия Граббса (G_t), то результат считали принадлежащим другой совокупности данных. При анализе принимали в расчет критерии, соответствующие уровню доверительной вероятности P=95%. Расчет выполняли средствами программы Microsoft ExceL. Кластерный анализ выполняли с помощью программы Statistica 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты определения содержания макро- и микроэлементов в зависимости от фракционного состава сырья медуницы мягкой приведены в таблице 3 «Содержание макро- и микроэлементов в побегах медуницы мягкой (Pulmonaria mollis)», опубликована на сайте журнала⁸. Следует обратить внимание на существенно меньшее содержание калия во фракции с размером частиц менее 0,2 мм и значительно более высокое содержание в ней кальция и кремния. Поскольку калий преобладает в живых клетках мезофилла⁹ и регулирует транспирацию, вполне логично, что на покровных тканях его меньше; в свою очередь, кремний и кальций формируют трихомы защитного опушения, весьма обильного у растений семейства Boraginaceae, которые измельчаются более эффективно и проходят через нижнее сито с размером ячеек менее 0,2 мм. Следует отметить, что экспериментальные данные о селективном содержании анализируемых элементов в P. mollis могут быть в дальнейшем использованы при изучении видовой специфичности данного растения.

Для выявления закономерностей в многофакторных данных (в таблице 3¹⁰ представлено 9 столбцов по 30 результатов в каждом) наиболее эффективно использование методов кластерного анализа [8]. В этом случае вводится понятие виртуального многомерного пространства, базисными ортами которого являются нормированные концентрации микроэлементов. Критерием объединения точек в кластер является условие, что евклидово расстояние между точками меньше некой задаваемой величины ε. За величину ε можно принять значение индивидуальной изменчивости содержания микроэлементов, определенное в размере 15% от среднего значения¹¹ [8]. Построенное иерархическое дерево кластеров по результатам, приведенным в таблице 3¹², представлено на рисунке 1. Анализ иерархического дерева показал, что фракция сырья медуницы мягкой, проходящая сквозь сита с диаметром отверстий 0,2 мм (фракция 1), образует отдельный кластер, равно как и нефракционированное сырье (фракция 8).

Для подтверждения полученных результатов была выдвинута статистическая гипотеза о том, что микроэлементный состав во всех фракциях подчиняется одному закону распределения и может быть объединен в одну репрезентативную выборку. В противном случае выпадающие фракции подчиняются иному закону распределения и их нужно рассматривать отдельно. Для проверки данной гипотезы были сформированы новые выборки (табл. 4), в которых экспериментальными точками выступали суммы элементов X_i. В таблице 5 приведены результаты расчетов статистических параметров выборок, указанных в таблице 4.

Проверка выборки на принадлежность одному распределению по критерию Граббса показала, что значение суммарного содержания микроэлементов во фракции 1 (X₁) значимо отличается от остальных и данная величина должна быть исключена. Оставшиеся суммы элементов (X₂–X₉ — суммарные содержания микроэлементов во фракциях 2–9) были объединены в выборку № 2, и снова был рассчитан критерий Граббса, уже по выборке № 2. В результате было установлено, что в данной выборке должна быть исключена фракция 8 — нефракционированное сырье и сформирована выборка № 3 из семи фракций (сумма микроэлементов в 6-ти фракциях — фракции 2–7 и 9). Новая проверка по критерию Граббса показала, что в выборке № 3 нет значимо выделяющихся значений и объединенные в выборку данные подчиняются нормальному закону распределения.

Таким образом, содержание микроэлементов во всех фракциях с размером частиц более 0,2 мм и во фракционированном сырье (в котором удалена фракция менее 0,2 мм) воспроизводимо и значимо не отличается друг от друга. В то же время результаты измерения, полученные для нефракционированного сырья, следует считать ошибочными за счет погрешности, вносимой присутствием частей растения, загрязненных неорганическими примесями, которые при измельчении и фракционировании сырья попадают во фракцию с размером частиц менее 0,2 мм. Следует также заметить, что эта погрешность является невоспроизводимой и учесть ее в расчетах не представляется возможным.

Вероятнее всего, растительное сырье с неорганическим загрязнением характеризуется более высокой хрупкостью, чем чистое растительное сырье, и измельчается эффективнее. Поэтому в просеве (частицы менее 0,2 мм) концентрация экзогенно загрязненных частей растения и соответственно микроэлементов во много раз больше.

Для подтверждения данной гипотезы рассмотрим результаты определения элементного состава в эксперименте с образцами листьев бурачника лекарственного, в которые вводились точные количества элементов-поллютантов экзогенным способом (табл. 6).

Для удобства можно ввести несколько расчетных коэффициентов, показывающих влияние введенного количества микроэлементов на результаты их определения в нефракционированном сырье (β₁) и в просеве (β₂) соответственно.

β₁ = С_2b / С_2a и β₂ = С_1b / С_1a , (1)

где С_1a и С_1b — содержание микроэлементов в просеве сырья без добавки и сырья с добавкой соответственно, мкг/г; С_2a и С_2b — содержание микроэлементов в суммарной фракции после удаления просева для сырья без добавки и сырья с добавкой соответственно, мкг/г.

Максимальное содержание введенных микроэлементов наблюдается в просеве (табл. 6). Можно рассчитать долю перешедшей в просев добавки (γ), зная массу добавленного элемента (m_доб) и массу просева (m_c):

(2)

Содержание элементов-поллютантов максимально во фракции с размером частиц менее 0,2 мм — более 90% от введенного количества. Это подтверждает гипотезу, что экзогенные элементы-поллютанты при фракционировании сырья переходят в подавляющем количестве во фракцию, содержащую частицы размером менее 0,2 мм. При этом максимальный размер частиц лимитируется особенностями используемых методик определения содержания микроэлементов и составляет 0,5–1,0 мм в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации¹³.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, по результатам сравнительного анализа содержания макро- и микроэлементов в побегах медуницы мягкой и листьях бурачника лекарственного, предварительно разделенных на 9 фракций по размеру частиц, установлено, что использование нефракционированного сырья при определении микроэлементного статуса растений может существенно затруднить его использование для контроля подлинности сырья и видовой принадлежности растений. Для получения достоверных результатов определения содержания микроэлементов в растительном сырье методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой наряду с рекомендованными Государственной фармакопеей Российской Федерации этапами методики необходимо включить в пробоподготовку стадию предварительного фракционирования сырья и использовать для анализа фракцию с максимальным размером частиц 1,0 мм и минимальным 0,2 мм.

Дополнительная информация. Таблица 3 размещена на сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств».

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-617-table3

Вклад автора. Автор подтверждает соответствие своего авторства критериям ICMJE.

Благодарности. Автор выражает благодарность коллективу Химико-аналитического центра «Плазма» (Томск) и его директору Н.В. Федюниной за помощь в проведении настоящей работы.

Additional information. Table 3 is published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-617-table3

Author’ contributions. The author confirms that he meets the ICMJE criteria for authorship.

Acknowledgements. The author expresses gratitude to the staff of the Chemical Analytical Center «Plasma» (Tomsk) and its director N.V. Fedyunina for assistance in carrying out the present work.