Комплексная оценка противовоспалительного действия водных извлечений и гелей на основе листьев ольхи черной и ольхи серой in vivo

ВВЕДЕНИЕ

Воспаление представляет собой физиологическую защитную реакцию соединительной ткани и неспецифичный ответ на повреждение различными факторами (бактериальные инфекции, вирусы, паразиты, токсины, высокие температуры, травмы и т.д.), является патогенетическим компонентом многих как острых, так и хронических заболеваний и проявляется рядом местных и системных клинических, биохимических и клеточных изменений, в совокупности называемых «реакция острой фазы». Острофазный ответ сопровождается нарастанием в плазме крови концентрации белков острой фазы, из которых самым чувствительным и диагностически значимым маркером воспаления является С-реактивный белок (СРБ). Синтез печеночного СРБ регулируется провоспалительными цитокинами, включая интерлейкины (IL) IL-6, IL-1 и фактор некроза опухоли α (TNF-α), поэтому практически любое неспецифическое повреждение ткани, инфекционный процесс, воспаление или стресс сопровождаются повышением уровня циркулирующего в крови СРБ¹ [1].

Флавоноиды — биологически активные вещества растительного происхождения — проявляют противовоспалительное действие, ингибируя индукцию цитокинов и метаболитов арахидоновой кислоты, которые являются тканевыми медиаторами воспаления. Таким образом, лекарственные растения, содержащие флавоноиды, могут быть потенциальными субстанциями для получения фитопрепаратов с противовоспалительным действием [2–5].

Листья ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) (ОЧ) и ольхи серой (Alnus incana (L.) Moench.) (ОС) — два новых вида лекарственного растительного сырья, включенных в Государственную фармакопею Республики Беларусь. Для расширения ассортимента лекарственных препаратов природного происхождения белорусского производства начато формирование фармакологической доказательной базы для этих видов лекарственного растительного сырья. Установлено наличие в их составе флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ и тритерпеновых сапонинов, что послужило основанием для изучения противовоспалительной активности² [7–11]. Ранее было доказано и описано противовоспалительное действие водных извлечений листьев ОЧ и ОС при генерализованном воспалении [9].

Цель работы — оценка противовоспалительного действия отваров и гелей, содержащих извлечения из листьев ольхи черной и ольхи серой, на лабораторных животных с использованием различных моделей воспаления. Задачами исследования являются: моделирование локального и генерализованного воспалений у лабораторных животных, оценка действия препаратов для внутреннего и наружного применения на основе листьев ольхи черной и серой при различных моделях воспаления.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явились листья ОЧ и ОС, заготовленные в фазу завершения роста и вызревания листьев в различные годы на территории Витебской и Минской областей Республики Беларусь, высушенные в естественных условиях. Противовоспалительную активность листьев ОЧ и ОС изучали на моделях генерализованного и локального воспаления, индуцированных введением крысам 1% раствора λ-каррагенана (Sigma, кат. № 22049).

В экспериментах были использованы крысы обоих полов линии Wistar, массой 300 г ± 5%, в возрасте 4–4,5 мес. (питомник «Рапполово», Ленинградская обл.). При проведении исследований соблюдали принципы биоэтики в соответствии со следующими регламентирующими документами: Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Работа была рассмотрена на биоэтической комиссии (БЭК) УО «Белорусский государственный медицинский университет» и одобрена для проведения (протокол БЭК от 22.04.2015 № 21, БЭК от № 7 от 20.04.2021). Все исследования с лабораторными животными проводили в соответствии с общепринятыми этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей, а также Надлежащей лабораторной практикой: ТКП 125-2008 (02040).

Генерализованное воспаление индуцировали внутрибрюшинным введением крысам 1 мл раствора λ-каррагенана 1% на изотоническом растворе хлорида натрия (ОАО «Несвижский завод медицинских препаратов») [12][13]. Все животные, использующиеся в этом эксперименте, были разделены на 5 групп по 16 самок и 16 самцов в каждой: группа И — интактные животные, группа В — контроль (воспаление без лечения), группы ОЧ и ОС — группы животных, которым через 2 ч после инъекции раствора λ-каррагенана и затем ежедневно в течение 7 сут внутрижелудочно вводили исследуемые препараты: соответственно, водные извлечения листьев ОЧ и листьев ОС в дозах 200 мг/кг, которые готовили путем нагревания на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин в соотношении сырье (г) : экстрагент (мл) 1:10, группа Д — животные, которым внутрижелудочно вводили препарат сравнения диклофенак натрия 8 мг/кг.

Для оценки противовоспалительной активности по 8 животных каждой группы выводили из эксперимента методом декапитации без предварительной наркотизации на 4 и 7 сутки эксперимента и определяли ряд показателей крови: С-реактивный белок (СРБ) спектрофотометрическим методом и активность индикаторных ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), γ-глутаматтрансферазы (ГГТ) с помощью диагностических наборов фирмы «Cormay» на автоматизированном фотометре РА 2600 [9].

Локальное каррагенановое воспаление индуцировали введением под плантарный (подошвенный) апоневроз правой задней лапы крысы 0,1 мл раствора λ-каррагенана 1%, приготовленного на изотоническом растворе³ [14]. В эксперимент было взято 24 самца и 24 самки, которых разделили на 4 группы, в каждой по 6 самок и 6 самцов. Животным контрольной группы в течение 5 суток вводили воду очищенную, экспериментальные группы получали водные извлечения листьев ОЧ и ОС, полученные вышеописанным методом, внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг в течение 5 сут. В качестве препарата сравнения использовали диклофенак натрия, который вводили в течение 5 сут внутрижелудочно в дозе 8 мг/кг (дозировка выбрана на основании работ [15–17] по исследованию противовоспалительной активности). Острое экссудативное воспаление животным всех групп вызывали на 5 сут эксперимента через 3 ч после последнего введения исследуемых препаратов. Через 3 ч после инъекции каррагенана животных умерщвляли в камере эвтаназии CL-1000 New с помощью углекислотного наркоза. Лапы ампутировали на уровне голеностопных суставов. Величину отека определяли по разности масс и диаметра воспаленной и невоспаленной лап.

Об интенсивности воспаления судили по приросту массы или диаметра лап на пике воспаления по формуле (1) и индексу ингибирования отека, характеризующего степени уменьшения отека, который рассчитывали по формуле (2) [9][10]:

(1)

(2)

где Mi — прирост массы (диаметра), %; Аi — масса (диаметр) воспаленной лапы, г; Вi — масса (диаметр) здоровой лапы, г; I — индекс ингибирования отека на пике воспаления, %; Mi₀ — прирост массы (диаметра) лапы в группе контроля, %.

На модели локального каррагенанового воспаления изучали противовоспалительную активность 4 мягких лекарственных форм (гелей), содержащих настойки на основе 30% спирта этилового из листьев ольхи черной (гель № 1-30ч), листьев ольхи серой (гель № 2-30с), а также настойку листьев ольхи черной на 60% спирте этиловом (гель № 3-60ч) и настойку листьев ольхи серой на 70% спирте этиловом (гель № 4-70с). В данном эксперименте животные были разделены на 8 групп в зависимости от препарата, которым обрабатывали суставы задних правых лап крыс, по 6 самок и 6 самцов в каждой (1 — контрольная, 2 — гель № 1-30ч, 3 — гель № 2-30с, 4 — гель № 3-60ч, 5 — гель № 4-70с, 6 — диклофенак, 7 — гель П30, 8 — гель П70). В контрольной группе обработку суставов не осуществляли. Исследуемые гели трижды наносили на заднюю правую лапу крыс: за 1 ч до индукции воспаления, через 1 и 2 ч после индукции воспаления. Через 3 ч после инъекции λ-каррагинана крыс выводили из эксперимента в камере эвтаназии CL-1000 New с помощью углекислотного наркоза. Величину отека определяли по аналогии с предыдущим экспериментом⁴.

Для изготовления гелей, содержащих настойки на 30% спирте этиловом, в качестве гелеобразователя использовали гидроксипропилметилцеллюлозу (Tylopur). В состав гелей с настойками на 60 и 70% спирте этиловом входят вода, этилендиаминтетраацетат, карбомер, макрогол 400, пропиленгликоль, диэтаноламин [10][15]. В качестве препарата сравнения использовали гель диклофенак 50 мг/г «Диклофенак форте», ООО «Фармтехнология»), а также 2 геля-плацебо: гель П30 (содержит вспомогательные компоненты, аналогичные гелям № 1-30ч и 2-30с, и спирт этиловый 30%); гель П70 (содержит вспомогательные компоненты, аналогичные гелям № 3-60ч и 4-70с, и спирт этиловый 70%).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета «Statistica 10,0» с соблюдением общих рекомендаций для биологических исследований и пакета анализа Microsoft Excel 2016. При анализе использовали непараметрические методы, которые соответствовали критериям проводимого эксперимента: небольшая выборка животных в группах n≤8(6), вид распределения неизвестен, медиана и мода значений не совпадали или не являлись близкими. Сравнение 3 и более групп между собой по количественным признакам выполняли с использованием критерия Краскела–Уоллиса (выполняли расчет параметра — тест статистика Н), попарное сравнение двух независимых групп — с использованием непараметрического рангового U-критерия Манна–Уитни (выполняли расчет уровня значимости — p), для коррекции уровня значимости при попарном сравнении использовали поправку Бонферрони.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень СРБ у животных всех экспериментальных групп достоверно различался при измерении на 4 сут (Н♀=23,43812, р=0,00001; Н♂=26,52140, р=0,00001) и на 7 сут с начала эксперимента (Н♀=26,10837, р=0,00001; Н♂=25,01778, р=0,00001). На модели генерализованного каррагенанового воспаления установлено, что статистически значимо происходит снижение специфического показателя воспаления СРБ по сравнению с контрольной группой воспаления на 4 и 7 сутки (В4 и В7) у животных, получающих настой листьев ОЧ на 4 сутки (самки, p=0,0013; самцы, p=0,0013), ОЧ на 7 сутки (самки, p=0,0009; самцы, p=0,0009), и ОС на 4 сутки (самки, p=0,0074; самцы, p=0,0009), ОС на 7 сутки (самки, p=0,0007; самцы, p=0,0009) (рис. 1).

Сравнение экспериментальных групп с применением критерия Краскела–Уоллиса выявило статистически значимые отличия на 4 сут (Н♀ГГТ=16,37810, р=0,0009; Н♂ГГТ=20,70583, р=0,0001; Н♀АЛТ=20,25245, р=0,0002; Н♂АЛТ=20,64484, р=0,0001; Н♀АСТ=16,37810, р=0,0009; Н♂АСТ=13,58027, р=0,0035). На 4 сут введение настоя листьев ОЧ приводило к статистически значимому снижению по сравнению с контрольной группой при попарном сравнении следующих показателей: ГГТ — на 51,23% (самки, р=0,0074) и 57,59% (самцы, р=0,0009); АЛТ — на 28,61% (самки, р=0,0038) и 35,02% (самцы, р=0,0009). Под действием настоев листьев ОС на 4 сут происходило статистически значимое снижение по сравнению с контрольной группой: ГГТ — на 52,74% (самки, р=0,0074) и 57,96 (самцы, р=0,0009); АЛТ — на 43,82% (самки, р=0,0014) и 37,22% (самцы, р=0,0009). Под действием препарата сравнения диклофенака натрия ГГТ снижался на 65,75% (самки, р=0,0009) и на 67,91% (самцы, р=0,0009); АЛТ — на 36,32% (самки, р=0,0009) и 38,99% (самцы, р=0,0009).

Попарное сравнение показателей экспериментальных групп спустя 7 сут после введения настоя выявило статистически значимые отличия (Н♀ГГТ=11,96109, р=0,0075; Н♂ГГТ=11,72695, р=0,0084; Н♂АЛТ=12,67885, р=0,0054; Н♀АСТ=13,20031, р=0,0042; Н♂АСТ=21,06423, р=0,0001). Введение настоя листьев ОЧ и ОС животным приводило к статистически значимому снижению по сравнению с контрольной группой активности ГГТ на 62,37% (самки, р=0,0074) и 51,89% (самцы, р=0,0063) и на 53,41% (самки, р=0,0100) и 45,08% (самцы, р=0,0157) соответственно. Под действием препарата сравнения диклофенака активность ГГТ снижалась на 60,93% (самки, р=0,0038) и 51,13% (самцы, р=0,0086); АСТ — на 17,19% (самки, р=0,0013) и 19,31% (самцы, р=0,0009).

Таким образом выявлено, что отвары листьев ОЧ и ОС при внутрижелудочном введении крысам обладали выраженной противовоспалительной активностью при генерализованном воспалении.

Анализ результатов действия извлечений листьев ОЧ и ОС на модели локального каррагенанового воспаления с применением критерия Краскела–Уоллиса выявил статистически значимые отличия приростов масс лап (Н♀=13,83072, р=0,0031; Н♂=16,22205, р=0,001) и диаметров лап (Н♀=18,63621, р=0,0003; Н♂=14,74989, р=0,002) по сравнению с контрольной группой, которая получала воду очищенную (табл. 1).

В таблице 2 представлены результаты оценки противовоспалительного действия гелей, содержащих настойки листьев ОЧ и ОС, на модели локального каррагенанового воспаления. Сравнение экспериментальных групп с применением критерия Краскела–Уоллиса выявило статистически значимые отличия приростов масс (м) и диаметров (д) лап при применении гелей № 1-30ч, № 2-30с, П30 и геля диклофенака (Н♀м=25,95269, р=0,0000; Н♂м=25,67312, р=0,003, Н♀д=22,14344, р=0,0002; Н♂д=19,11310, р=0,0007), а также гелей № 3-60ч, № 4-70с, П70 и диклофенака (Н♀м=25,87957, р=0,0000; Н♂м=24,98495, р=0,0001, Н♀д=21,61240, р=0,0002; Н♂д=18,48856, р=0,001).

При применении гелей на основе настоек из листьев ОЧ и ОС прирост массы и диаметра воспаленных лап был статистически значимо меньше, чем в контрольной группе животных и в группах, где применялись гели-плацебо (табл. 2). При этом индекс ингибирования (рассчитанный по массе) для геля, содержащего настойку листьев ОЧ на спирте этиловом 60%, был максимальным и составил 57,95% (самки) и 56,53% (самцы). Данный показатель был аналогичным 56,78% (самцы) для геля, содержащего настойку листьев ОС на спирте этиловом 70%. Индекс ингибирования при использовании геля диклофенака 50 мг/г составил 67,86% (самки) и 69,94% (самцы). Приросты массы и диаметра лап при использовании гелей-плацебо статистически значимо не отличались от соответствующих приростов в контрольной группе.

ВЫВОДЫ

Таким образом, доказана противовоспалительная активность водных и спиртовых извлечений из листьев ольхи черной и ольхи серой на моделях генерализованного и локального воспаления у крыс. Водные извлечения в дозе 200 мг/кг при внутрижелудочном введении статистически значимо снижали уровень специфического показателя воспаления — СРБ на 4 и 7 сутки воспаления по сравнению с контрольной группой. Внутрижелудочное введение отваров из листьев ольхи черной и серой в дозе 200 мг/кг, а также наружное применение гелей, содержащих спиртовые извлечения листьев ольхи черной на основе 30 и 60% спирта этилового и листьев ольхи серой на основе 30 и 70% спирта этилового, вызывало статистически значимое угнетение отека лап при локальном воспалении суставов лап крыс.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: О.В. Мушкина — работа с источниками литературы, проведение эксперимента, формулировка выводов, написание текста рукописи, концепция работы, постановка задачи; Н.С. Гурина — методическое руководство, участие в формулировании выводов, утверждение окончательной версии рукописи для публикации.

Соответствие принципам этики. Авторы заявляют, что все исследования одобрены этической комиссией УО «Белорусский государственный медицинский университет» (протоколы № 7 от 20.04.2021, № 21 от 22.04.2015).

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Olga V. Mushkina — work with literature sources, conducting an experiment, formulating conclusions, writing the text of the manuscript, concept of work, statement of the problem. Natalia S. Gurina — methodological guide, participation in the formulation of conclusions, approval of the final version of the manuscript for publication.

Ethics approval. According to the authors, the studies have been approved by the ethical commission of the Belarusian State Medical University (Protocol No. 7 dated 20.04.2021, No.21 dated 22.04.2015).