Оценка стабильности растворов антибиотиков-цефалоспоринов по показателям «Цветность раствора» и «Примеси»

ВВЕДЕНИЕ

Цефалоспориновые антибиотики — это большая группа β-лактамных антибиотиков, производство и применение которых в медицинской практике в широких масштабах началось с 70-х годов XX века¹. Для получения полусинтетических антибиотиков в общее ядро молекулы цефалоспоринов — 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК) (I) путем направленного химического или биокаталитического синтеза вводят функциональные группы, в основном в положения R₂ и R₁² [1][2]. Модификация структуры 7-АЦК приводит к изменению антибактериального спектра получаемых соединений, их фармакологических и физико-химических свойств³ [2].

Выделяют пять поколений (генераций) антибиотиков цефалоспоринов. К первому поколению относится цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефадроксил. Примерами 2-го поколения являются цефуроксим, цефаклор, 3-го поколения — цефотаксим, цефтриаксон. К 4-й генерации относят цефепим и цефпиром; 5-я генерация пока представлена только цефтралином. Если цефалоспорины первого поколения эффективны в основном против грамположительных бактерий, появление последующих генераций цефалоспоринов было связано с расширением спектра их действия против аэробных грамотрицательных бактерий⁴.

Для большинства антибиотиков, относящихся к первым трем генерациям, в Фармакопее США 2024 года, Европейской фармакопее 11.3 (Ph. Eur.) и в Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ) XV изд. представлены монографии, регламентирующие стандарты качества соответствующих соединений в случае их использования в качестве активных фармацевтических субстанций (АФС). Обязательными показателями качества АФС, особенно если они предназначены для производства парентеральных лекарственных средств, являются «Примеси» и «Цветность раствора». Для проявления биологической активности цефалоспоринов большое значение имеет целостность β-лактамного кольца, неустойчивого в кислой и щелочной среде [3][4]. В водных растворах цефалоспорины также подвергаются деструкции с возможным расщеплением β-лактамного кольца [3–5]. Стабильность растворов цефалоспоринов зависит от температуры, рН, воздействия света. Было показано, что в течение суток цефалоспорины в водных растворах гидролизуются⁵. Анализ степени деструкции цефалоспоринов в водных растворах с течением времени при естественном освещении и взаимосвязь процесса постепенной деградации с изменением качества этих препаратов и их соответствием фармакопейным требованиям в литературе не описаны. При этом наблюдаемое постепенное увеличение интенсивности окрашивания растворов при работе с этими антибиотиками свидетельствует о накоплении продуктов разложения действующего вещества.

Цель работы — оценить стабильность водных растворов цефалоспоринов по показателям «Примеси» и «Цветность раствора» и проследить взаимосвязь между этими показателями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были выбраны АФС, зарегистрированные в Российской Федерации: цефазолин (II), цефуроксим (III), цефтриаксон (IV), а также смесь цефтриаксона с сульбактамом (2:1). Эти три антибиотика легко растворимы в воде и используются в форме натриевых солей для приготовления инъекционных препаратов.

Цефазолин (6R,7R)-3-{[(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)сульфанил]метил}-8-оксо-7-[ 2-(1H-тетразол-1-ил)ацетамидо]-5-тиа-1-азабицикло [ 4.2.0]окт-2-ен-2-карбоксилат⁶ относится к первому поколению соединений цефалоспоринов ряда c гетероциклическим заместителем (R₂). Характеризуется как белый или почти белый порошок, очень гигроскопичен⁷. Цефуроксим (6R,7R)-3-[(карбамоилокси)метил]-7-[(2Z)-2-(метоксиимино)-2-(фуран-2-ил)ацетамидо]-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[ 4.2.0]окт-2-ен-2-карбоксилат⁸ — антибиотик второго поколения с негетероциклическим заместителем (R₂). Белый или почти белый порошок⁹. Цефтриаксон (6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-4-тиазолил)-2-(метоксиимино)ацетамидо]-3-{[(2-метил-6-оксидо-5-оксо-2,5-дигидро-1,2,4-триазин-3-ил)сульфанил] метил}-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[ 4.2.0]окт-2-ен-2-карбоксилат динатрия гидрат (1:3,5)¹⁰ относится к третьей генерации с гетероциклическим заместителем (R₂), представляет собой гидратную форму молекулы¹¹. Белый, почти белый или желтоватый кристаллический порошок¹².

Смесь цефтриаксона с сульбактамом (2:1) легко растворима в воде. Сульбактам в составе препарата¹³ является ингибитором пенициллиназы и также представляет собой β-лактамное соединение.

Для оценки изменения интенсивности окраски водных растворов цефалоспоринов применяли два фармакопейных метода: визуальный и спектрофотометрический. Использование инструментального метода позволяет получить количественную и более объективную оценку, чем визуальный способ.

Оптическую плотность 10% раствора цефазолина измеряли при длине волны 430 нм согласно требованиям Ph. Eur., 1,2% раствора цефтриаксона и раствора смеси цефтриаксона (1,2%) и сульбактама — в максимуме поглощения при длине волны 450 нм. Выбор концентраций испытуемых растворов соответствовал требованиям Ph. Eur. и ГФ РФ для анализа исследуемых АФС. Анализ смеси было решено проводить аналогично цефтриаксону. При анализе визуальным методом использовали фармакопейные эталоны цветности¹⁴.

Оптическую плотность растворов антибиотиков измеряли на спектрофотометре Agilent 8453, рН — на приборе Mettler Toledo тип Seven Compact, для определения содержания родственных примесей использовали хроматограф Agilent Infinity 1260. Измерения проводили через определенные промежутки времени с использованием одних и тех же растворов. Дополнительно с такой же периодичностью изучали стабильность растворов указанных антибиотиков по содержанию родственных примесей. Концентрации растворов были выбраны в соответствии с требованиями нормативных документов для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) — 0,25% цефазолина, 0,1% цефуроксима и 0,03% цефтриаксона. Все исследуемые растворы хранили при комнатной температуре 22–24 ºС при естественном освещении, исключив попадание прямых солнечных лучей. Антибиотики растворяли в свежеприготовленной воде очищенной и хранили в плотно укупоренных конических колбах.

Содержание примесей оценивали методом внутренней нормализации в процентах с учетом относительного времени удерживания. Единичные примеси идентифицировали, если такая возможность была предусмотрена методикой. Пики растворителей, реактивов и пики, обусловленные компонентами подвижной фазы, в расчет не принимали.

Использовали методики ВЭЖХ, описанные в монографиях Ph. Eur. на цефуроксим натрия и цефтриаксон натрия с незначительными изменениями, определение примесей в растворах цефазолина проводили согласно требованиям Фармакопеи США¹⁵. Условия хроматографирования для определения примесных продуктов:

• цефазолин — подвижная фаза (ПФ) двухкомпонентная (ПФ А — буферный раствор с рН 6,8, ПФ В — ацетонитрил), градиентное элюирование в течение 65 мин, скорость потока 1,5 мл/мин, детектирование при 254 нм и 210 нм, температура колонки 30 ºС, объем вводимой пробы 20 мкл, колонка Luna С18 250×4,6 мм, 5 мкм;
• цефуроксим — ПФ ацетонитрил и ацетатный буферный раствор с рН 3,4 в соотношении 1:99, скорость потока 1,0 мл/мин, детектирование при 273 нм, температура колонки 30 ºС, объем вводимой пробы 20 мкл, колонка Spherisorb С6 100×4,6 мм, 5 мкм.
• цефтриаксон — ПФ буферный раствор с рН 6,0 и ацетонитрил в соотношении 1:1, скорость потока 1,5 мл/мин, детектирование при 254 нм, температура колонки 30 ºС, объем вводимой пробы 20 мкл, колонка Luna С18 250×4,6 мм, 5 мкм.

Статистическую обработку результатов в данном исследовании не проводили.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе работы все исследуемые растворы цефалоспоринов постепенно приобретали более интенсивную желтую окраску по сравнению с первоначальным цветом. Раствор цефтриаксона (1,2%) в начале опыта выдерживал сравнение с эталоном цветности Y₅, что соответствует нормативным требованиям монографии на цефтриаксон натрия¹⁶, через 24 ч хранения на свету приобретал выраженный желтый цвет (эталон Y₄), через 144 ч (6 сут) соответствовал эталону ВY₃. Раствор смеси цефтриаксона с сульбактамом с той же концентрацией цефтриаксона существенно изменял окраску в течение 24 ч от Y₄ до Y₃ с последующим пожелтением раствора на конечном этапе эксперимента до соответствия эталону Y₂. Окраска 10% раствора цефазолина первоначально не превышала эталон Y₃, через 24 ч соответствовала эталону Y₂, и далее в процессе наблюдений цветность раствора практически менялась.

Визуальная оценка цветности 10% раствора цефуроксима в сравнении с эталонами была затруднена, так как интенсивность окраски раствора сразу после его приготовления уже превышала эталон 1 шкалы цветности ВY.

В монографиях Ph. Eur. и ГФ РФ на исследуемые соединения только для цефтриаксона натрия предусмотрено сравнение с эталоном для оценки цветности раствора. Внешний вид растворов 10% раствор цефазолина стандартизуют по значению оптической плотности — «не более 0,15».

Для исследуемых растворов цефазолина в течение 16 сут, цефтриаксона и смеси цефтриаксона с сульбактамом в течение 11 сут наблюдали увеличение оптической плотности при хранении на свету (рис. 1). Наиболее стабильным соединением в условиях испытания по показателю «Цветность раствора» оказался цефазолин. Оптическая плотность 10% раствора цефазолина через 9 сут (216 ч) наблюдения не превышала установленное¹⁷ предельное значение 0,15.

Считается, что водные растворы натриевых солей цефалоспоринов обладают буферными свойствами [6]. Наблюдения за динамикой изменения рН показали, что исследуемые растворы цефтриаксона с сульбактамом и цефазолина имели слабокислую реакцию с постепенным сдвигом в щелочную. Так, рН раствора цефтриаксона с сульбактамом изменялся от 6,4 в начале эксперимента до 6,9 в конце испытаний, рН раствора цефазолина — от 6,0 до 6,8 соответственно, последнее значение превысило нормативные требования¹⁸ («от 4,0 до 6,0» для 10% раствора цефазолина натрия). Диапазон изменений рН раствора цефтриаксона был шире и составил от 6,6 до 7,5, тем не менее эти значения не превышали нормативные пределы («от 6,0 до 8,0»)¹⁹. Возможно, что в процессе хранения растворов цефалоспоринов образуются продукты деструкции, обладающие щелочными свойствами.

Оценивая полученные результаты анализа по показателю «Цветность раствора», представляется интересным проследить изменения содержания родственных примесей (продуктов деструкции) в растворах цефалоспориновых антибиотиков. При анализе результатов деструкции цефазолина в 10 и 0,25% водных растворах показано (рис. 2), что сумма примесей превышала нормативные требования (3,5%)²⁰ через 96 ч (4 сут), а через 6 сут составила более 5%. Суммарное содержание примесей в исследуемых объектах может увеличиваться в результате образования как одной, так и одновременно нескольких примесей.

Процесс деструкции не отличался в растворах разных концентраций — увеличивалось содержание в основном двух примесей: тетразолиацетамида ацеталя (V) (N-(2,2-дигидроксиэтил)-2-(1H-тетразол-1-ил)ацетамид)²¹ и цефозолина с открытым лактонным кольцом или 3-гидрокси-метил цефазолина (VI) (6R,7R)-7-[ 2-(1H-тетразол-1-ил)ацетамидо]-3-(гидроксиметил)-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[ 4.2.0]окт-2-ен-2-карбоксикислота)²². Тогда как содержание примеси цефазолина лактона (N-{(5aR,6R)-1,7-диоксо-1,3,4,5a,6,7-гексагидроазето[ 2,1-b]фуро[ 3,4-d][ 1,3]тиазин-6-ил}-2-(1H-тетразол-1-ил)ацетамид)²³ в исследуемых растворах уменьшалось. Это отчасти объясняет увеличение содержания примеси 3-гидроксиметил цефазолина, поскольку согласно данным литературы [4] цефазолин гидролизуется первоначально до цефазолина лактона, затем эта примесь распадается до цефазолина с открытым лактонным кольцом.

Диаграммы процесса деструкции цефтриаксона в растворах разных концентраций представлены на рисунке 3. Согласно требованиям Ph. Eur. предельное содержание единичной примеси в цефтриаксоне натрия должно быть не более 1,0%, суммарно — не более 4,0%. Процесс разложения цефтриаксона в разбавленном 0,03% растворе протекал интенсивнее, чем в более концентрированном. Сумма примесей (4,2%) в первом случае не соответствовала требованиям Ph. Eur. через 48 ч, во втором — через 168 ч (4,5%).

Накопление единичных примесей цефтриаксона имело некоторые различия в растворах разных концентраций. Значительное увеличение с 0,5% в начале испытания (0 ч) до 1,5% через 72 ч и до 4,0% в конце срока хранения наблюдали для соединения с относительным временем удерживания (reference retention time, RRT) 0,68 в 1,2% растворе цефтриаксона. В разбавленном в 40 раз растворе количество этой же примеси возрастало с 0,5% (0 ч) до 2,0% через 48 ч и в конечной точке эксперимента превысило 8,0%. В то же время в разбавленном растворе наблюдали существенное увеличение примеси с RRT 1,18, которая в свежеприготовленных растворах обеих концентраций не проявлялась на хроматограммах. Количество этой примеси практически не изменилось в 1,2% растворе, но постепенно увеличилось содержание примеси с RRT 0,76. Количество остальных примесей не превышало фармакопейных норм, содержание примеси А (Е-изомер цефтриаксона)²⁴ оставалось практически неизменным в течение всего эксперимента.

Результаты оценки стабильности растворов цефуроксима разных концентраций представлены на рисунке 4. Примесь А — основной продукт деструкции цефуроксима — нормируется отдельно от суммы других примесей (не более 1,0%)²⁵. В свежеприготовленных растворах цефуроксима содержание примеси А (дезкарбомоилцефуроксим; (6R,7R)-7-[[ (2Z)-2-(фуран-2-ил)-2-метоксииминоацетил]амино]-3-(гидроксиметил)-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[ 4.2.0]окт-2-ен-2-карбоновая кислота)²⁶ составило менее 0,4%, затем через 24 ч увеличилось до 2,5% в 10%-ном растворе цефуроксима и почти до 5,0% в разбавленном растворе. Таким образом, цефуроксим в данном исследовании проявил себя наименее стабильным соединением в водных растворах, через 24 ч содержание примеси А превысило нормативные требования в 2,5–5 раз.

Стандарт качества на смесь цефтриаксона с сульбактамом (2:1) в ведущих фармакопеях в настоящее время не представлен. В связи с этим была изучена стабильность раствора смеси цефтриаксона с сульбактамом (содержание цефтриаксона 1,2%) по отношению к стабильности сухой смеси, из которой через указанные промежутки времени отбирали навески и проводили определение примесей в свежеприготовленном (не более 2 ч хранения) растворе той же концентрации. Влияние естественного освещения на стабильность порошка смеси изучаемых веществ оказалось незначительным, сумма примесей не превысила 1,2% на 16 сут хранения (рис. 5a). Деструкция цефтриаксона с сульбактамом в водном растворе протекала интенсивно, сумма примесей на конец испытания составила около 9% (рис. 5b).

Поскольку деструкция в разбавленных растворах цефазолина (0,25%), цефтриаксона (0,03%) и цефуроксима (0,1%) проходила интенсивнее, чем в растворах более высоких концентраций (10% растворы цефазолина и цефуроксима, 1,2% раствор цефтриаксона), и наблюдали минимальное разложение β-лактамных соединений в порошке по сравнению с растворами, можно предположить, что водная среда и ее объем являются основными факторами, влияющими на накопление родственных примесей в процессе хранения. При этом в процессе деградации молекулы исследуемых антибиотиков в водных растворах разрушаются с образованием преимущественно одной-двух примесей в течение 24–96 ч, тогда как содержание остальных родственных соединений изменяется незначительно.

Визуально можно отметить увеличение оптической плотности при увеличении суммы примесей в растворах цефтриаксона и цефазолина, однако линейная функция не подтверждена статистически, что связано, скорее всего, с неравномерным вкладом примесных продуктов в общее поглощение исследуемых растворов.

Учитывая, что растворы исследуемых цефалоспоринов в процессе хранения при естественном освещении приобретали более интенсивную желтую окраску, можно предположить, что в процессе деструкции образуются родственные примеси исследуемых β-лактамных соединений, интенсивно поглощающие в диапазоне длин волн синей области видимого спектра.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стабильность водных растворов цефазолина, цефтриаксона, цефтриаксона с сульбактамом (2:1) и цефуроксима по показателям «Цветность раствора» и «Примеси» зависит от химического строения вещества, концентрации растворов и длительности хранения при естественном освещении. Между значениями оптической плотности растворов цефазолина и цефтриаксона отмечена визуально наблюдаемая взаимосвязь с увеличением количества отдельных примесей, однако четкой линейной зависимости не выявлено, что, вероятно, обусловлено неравномерным вкладом примесных продуктов в общее поглощение исследуемых растворов. Проведенные исследования могут быть полезны при разработке и оптимизации методик, необходимых для оценки качества и стабильности лекарственных средств β-лактамных соединений. На основании полученных результатов в дальнейших исследованиях предполагается оценить изменение чувствительности тест-микроорганизмов к цефалоспоринам, подвергшимся деструкции под воздействием внешних факторов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.И. Кулешова — идея, общая концепция исследования, написание текста рукописи, анализ результатов; И.А. Денисова — подбор методик, проведение испытания методом ВЭЖХ, анализ результатов; Т.И. Пшеничных — выполнение испытаний спектрофотометрическим и визуальным методами, измерение рН, анализ результатов.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Svetlana I. Kuleshova conceived the study idea, conceptualised the study, drafted the manuscript, and analysed the results. Irina A. Denisova selected analytical procedures, conducted HPLC testing, and analysed the results. Tatiana I. Pshenichnykh conducted the tests using spectrophotometric and visual methods, measured the pH, and analysed the results.