Определение содержания нафтифина и продуктов его деструкции в лекарственных препаратах методом ВЭЖХ с использованием хроматографических колонок малого объема

ВВЕДЕНИЕ

Нафтифин в лекарственной форме для наружного применения используется для лечения грибковых инфекций кожи и ногтей [1], относится к классу аллиламинов [2] и обладает фунгицидным и фунгистатическим действием.

Фунгицидное действие in vitro нафтифин оказывает против дерматофитных микроорганизмов Trichophyton spp., Microsporum spp. и Epidermophyton floccosum [2][3]. В исследованиях in vivo было показано, что активность нафтифина против T. rubrum и T. mentagrophytes аналогична клотримазолу [4]. Также нафтифин проявляет антибактериальную и противовоспалительную активность, что важно при лечении поверхностных дерматозов, сопровождающихся бактериальной инфекцией и воспалением.

Для количественного определения нафтифина в лекарственных средствах используют методы спектрофотометрии в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне спектра [5] и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [6][7]. Однако при наличии вспомогательных веществ в составе препаратов нафтифина могут быть не выполнены требования специфичности для метода УФ-спектрофотометрии, поэтому наиболее востребованным в контроле качества является метод ВЭЖХ.

В Фармакопее США (USP)¹ для анализа нафтифина гидрохлорида указана методика нормально-фазовой жидкостной хроматографии с использованием в качестве подвижной фазы смеси н-гексана, этанола, диметилформамида и муравьиной кислоты. Компоненты подвижной фазы обладают высокой токсичностью и легковоспламеняемы, а их летучесть может приводить со временем к изменению состава подвижной фазы. Методика достаточно продолжительная, при этом из-за большой скорости потока элюента (2 мл/мин) расходуется большое количество подвижной фазы. Поэтому актуален выбор условий анализа и совершенствование методики определения нафтифина в лекарственных препаратах.

Цель работы — модернизация методики количественного определения нафтифина и его примесей в лекарственных препаратах методом ВЭЖХ с использованием колонок малого объема, позволяющих сократить время анализа и расход реактивов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

• подобрать оптимальные условия хроматографирования нафтифина;
• выбрать условия пробоподготовки для различных лекарственных форм;
• подтвердить пригодность разработанной методики, определив ее валидационные характеристики.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Субстанция-порошок нафтифина (Olon S.p.A.), образцы лекарственных препаратов в форме 1% спиртового раствора и 1% крема для наружного применения, зарегистрированные для применения на территории Российской Федерации², фармакопейный стандартный образец нафтифина гидрохлорида (USP).

Реактивы. Фосфорная кислота (85%, Supelco), метанол (99,9%, J.T. Baker), ацетонитрил (99,9%, CARLO ERBA Reagents), спирт этиловый абсолютизированный (Merck), хлорная кислота (70%, Sigma-Aldrich), хлороводородная кислота (37%, Merck), натрия гидроксид (99,9%, Labochem), водорода пероксид (30%, Merck).

Растворы стандартного образца. Для оценки величины аналитического сигнала, эффективности хроматографической колонки и выбора альтернативного растворителя для анализа различных лекарственных форм готовили по 5 растворов стандартного образца нафтифина (200 мкг/мл) в каждом из следующих растворителей: 0,1% растворе фосфорной кислоты (Р1), метаноле (Р2), смеси воды и этанола (50:50 об./об., Р3), этаноле (Р4), смеси 0,1% хлорной кислоты и ацетонитрила (70:30 об./об., Р5). Затем проводили второе разведение каждого раствора в том же растворителе до концентрации около 10 мкг/мл нафтифина. Все растворы после приготовления отфильтровывали через шприцевые мембранные фильтры из политетрафторэтилена с размером пор не более 0,45 мкм (Agilent Technologies).

Модельные растворы примесей. Для выбора оптимальной длины волны был приготовлен раствор, содержащий 10 мкг/мл нафтифина, 10 мкг/мл коричного альдегида (Sigma-Aldrich) и 10 мкг/мл N-метил-1-нафталинметиламина (Sigma-Aldrich) в 0,1% фосфорной кислоте. Для определения селективности при проведении валидации методики была приготовлена серия модельных растворов. Раствор, содержащий 1000 мкг/мл N-метил-1-нафталинметиламина (Sigma-Aldrich), 1000 мкг/мл коричного альдегида (Sigma-Aldrich) и 10 мкг/мл нафтифина в 0,1% фосфорной кислоте, готовили путем добавления образцов примесей при втором разведении раствора стандартного образца нафтифина. Растворы разложения нафтифина получали при втором разведении раствора стандартного образца путем добавления к нему растворов натрия гидроксида, соляной кислоты (до 0,1 М в конечном растворе) или водорода пероксида (до 10% в конечном растворе). Затем полученные растворы и раствор без добавления разлагающих реагентов термостатировали при 80 ºС в течение 8 ч. Раствор примесей нафтифина, полученных фотолитическим разложением, готовили при облучении УФ-лампой (длина волны 254 нм) раствора, содержащего 10 мкг/мл нафтифина в 0,1% фосфорной кислоте, в течение 8 ч.

Растворы для количественного определения. Для определения содержания нафтифина в лекарственных препаратах нафтифина использовали метод внешнего стандарта. Для этого готовили растворы стандартного образца нафтифина с концентрацией около 10 мкг/мл в 0,1% фосфорной кислоте в двух повторениях (стандартный раствор) и растворы лекарственных препаратов нафтифина с той же теоретической концентрацией, рассчитанной с учетом навесок, плотности и разведения препарата (испытуемый раствор). Все растворы после приготовления отфильтровали через шприцевые мембранные фильтры из политетрафторэтилена с размером пор не более 0,45 мкм (Agilent Technologies).

Оборудование. Хроматографирование приготовленных растворов проводили на жидкостных хроматографах Agilent 1200 Infinity и Agilent Infinity II 1290 (Agilent Technologies), оснащенных диодно-матричными детекторами. Хроматографические колонки, которые были использованы при проведении валидации методики и оценке возможности их замены, указаны в таблице 1.

Условия анализа. Объем ввода пробы 5 мкл, скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин, температура колонки 30 ºС, детектирование при 254 нм, подвижная фаза А — 0,1% раствор хлорной кислоты, подвижная фаза Б — ацетонитрил, элюирование проводили в градиентном режиме (табл. 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По своей структуре нафтифин (I) представляет собой третичный амин с метильным, (1-нафтил)метильным и циннамильным заместителями на атоме азота. Нафтифин не растворим в воде, растворим в этаноле, метаноле, диметилсульфоксиде и других органических растворителях, а также в водных растворах кислот.

Возможными примесями нафтифина являются N-метил-1-нафталинметиламин (II), являющийся исходным продуктом при производстве субстанции, и коричный альдегид (III), близкий по структуре к циннамилхлориду — второму компоненту синтеза субстанции.

Основными критериями для выбора условий хроматографирования были максимально возможное сокращение времени анализа и снижение расхода подвижной фазы. Это было достигнуто за счет использования колонок малого объема (свободный объем около 0,3 мл) и выбора состава подвижной фазы, не требующего длительного уравновешивания колонки.

Выбор компонентов подвижной фазы был основан на возможной эффективности разделения, сокращении времени уравновешивания колонки и данных о токсичности растворителя. Ацетонитрил выбран как обладающий большей элюирующей силой и при этом менее токсичный компонент по сравнению с метанолом и более удобный в работе, чем обладающий резким запахом тетрагидрофуран. Хлорная кислота в составе подвижной фазы выбрана как компонент, позволяющий обеспечить растворение нафтифина и при этом не требующий длительного уравновешивания колонки в отличие от солей алкилсульфоновых кислот.

Применение колонок малого объема (свободный объем около 0,3 мл) при относительно большой скорости потока подвижной фазы (1 мл/мин) позволяет использовать градиентное элюирование с быстрым изменением состава подвижной фазы и значительно сократить время уравновешивания колонки перед последующим анализом.

В качестве неподвижной фазы при хроматографировании использовали колонки с фенилгексилсилильным сорбентом (L11 по классификации USP), поскольку при применении такого сорбента основные примеси нафтифина имеют значительно отличающуюся хроматографическую подвижность.

Пригодность хроматографической системы оценивали по разделению пиков нафтифина и его примесей. При хроматографировании раствора, содержащего около 10 мкг/мл каждого из определяемых компонентов, для пиков N-метил-1-нафталинметиламина и коричного альдегида разрешение составило 4,9±0,1, а для пиков коричного альдегида и нафтифина 6,9±0,1 (рис. 1).

Для спектров поглощения нафтифина и его примесей (рис. 2) характерны максимумы 222 и 254 нм (нафтифин), 222 и 282 нм (N-метил-1-нафталинметиламин) и 206, 222, 290 нм (коричный альдегид).

Основанием для выбора длины волны стала наибольшая чувствительность хроматографической системы, характеризующаяся соотношением сигнала и шума для пика определяемого компонента. Для количественного определения нафтифина выбрали длину волны 254 нм, поскольку для этого максимума поглощения нафтифина наблюдали низкий уровень шумов и дрейфа базовой линии. Для определения примесей выбрали длину волны 222 нм, при которой чувствительность хроматографической системы была выше, чем при 254 нм.

В таблице 3 представлены основные характеристики методики в зависимости от используемого растворителя и количественного содержания нафтифина в растворе стандартного образца (С, мкг/мл): средние площади пиков нафтифина (S, mAU×c), средний отклик, выраженный как отношение средней площади пика к концентрации (S/C, mAU×с×мл/мкг), относительное стандартное отклонение (RSD) полученного значения S/C для растворов 10 и 200 мкг/мл нафтифина, а также для всей выборки растворов.

Для проверки отсутствия влияния растворителя на форму пика нафтифина, которое могло бы нарушить точность определения площадей пиков, дополнительно определяли средние значения времени удерживания, асимметрии пика и эффективности, выраженной в количестве теоретических тарелок.

RSD отношения S/C для раствора 10 мкг/мл стандартного образца нафтифина в различных растворителях составило 0,486%, что не превышает 2%, требуемых для соблюдения критериев правильности методики. Растворы 200 мкг/мл стандартного образца нафтифина использовали для проверки сходимости результатов. На хроматограммах этих растворов наблюдали увеличение асимметрии пика и уменьшение количества теоретических тарелок, что свидетельствует о слишком большом количестве аналита для данной колонки, однако RSD отношения S/C составило 0,522% (0,566% для всей выборки). На хроматограммах, полученных для растворов нафтифина в этаноле, было отмечено уменьшение числа теоретических тарелок на ≈20% и увеличение ширины пика, при этом другие параметры изменились в допустимых пределах.

В качестве растворителя проб выбрали 0,1% раствор ортофосфорной кислоты как наиболее экономичный и сделали вывод о возможности применения любого из рассмотренных растворителей для приготовления растворов стандартного образца и испытуемых растворов препаратов, для которых может потребоваться альтернативный растворитель. Хроматограммы стандартного и испытуемого растворов представлены на рисунке 3.

Валидацию методики проводили согласно фармакопейным требованиям³, оценивали специфичность, аналитическую область, линейность, правильность, внутрилабораторную прецизионность, сходимость и устойчивость (робастность) методики. Для проведения валидации выбрали лекарственный препарат в форме 1% спиртового раствора нафтифина для наружного применения, поскольку входящие в его состав вспомогательные вещества не влияют на хроматографическое поведение нафтифина и растворение препарата не требуется. Для препаратов в форме крема с различным составом вспомогательных веществ могут требоваться значительные корректировки растворителя при пробоподготовке.

Специфичность. Хроматографировали растворитель (0,1% ортофосфорная кислота), подвижную фазу (смесь 0,1% хлорной кислоты и ацетонитрила в соотношении 70:30) и модельные растворы, содержащие родственные примеси нафтифина, получая не менее трех хроматограмм каждого раствора. В качестве модельных растворов использовали растворы, содержащие N-метил-1-нафталинметиламин и коричный альдегид, и растворы, подвергшиеся ускоренному разложению.

На хроматограмме модельного раствора, содержащего по 1000 мкг/мл N-метил-1-нафталинметиламина и коричного альдегида и 10 мкг/мл нафтифина, обнаружили дополнительный пик примеси коричного альдегида, элюирующейся вблизи пика нафтифина (рис. 4). Концентрация примесей в модельном растворе в 100 раз больше концентрации нафтифина, при этом площади пика нафтифина на хроматограммах модельного и стандартного растворов различаются менее чем на 10%. Таким образом, присутствие данных примесей даже в значительных количествах не оказывает существенного влияния на определение содержания нафтифина в препарате.

На хроматограммах растворов, полученных после термического, кислотного и щелочного разложения нафтифина, не обнаружили новых пиков примесей по сравнению со стандартным раствором, что свидетельствует об устойчивости нафтифина в данных условиях.

После окислительного и фотолитического разложения нафтифина на хроматограммах соответствующих растворов обнаружили новые пики примесей, а площадь пика нафтифина значительно уменьшилась. Пики примесей имеют разрешение с пиком нафтифина не менее 2,0 и не влияют на количественное определение нафтифина в растворе.

Аналитическая область методики. С учетом лекарственных форм, в которых препараты нафтифина представлены на российском фармацевтическом рынке (растворы для наружного применения и кремы для наружного применения), была определена аналитическая область методики. В диапазоне 80–120% от предлагаемой концентрации нафтифина в испытуемом растворе (10 мкг/мл) проводили определение линейности, правильности и прецизионности методики.

Линейность. Для определения зависимости величины сигнала от концентрации определяемого вещества в испытуемом растворе готовили пять растворов, содержащих 8, 9, 10, 11 и 12 мкг/мл стандартного образца нафтифина в 0,1% фосфорной кислоте, соответствующих уровням концентрации 80, 90, 100, 110 и 120%. Зависимость площади пика нафтифина на хроматограммах полученных растворов от его концентрации описывается линейным уравнением регрессии y=18,536x–1,4793. Аппроксимация линейной регрессии считается приемлемой при значениях коэффициента корреляции (R) не менее 0,99, для нафтифина в диапазоне концентраций от 80 до 120% R² составил 0,9943, что подтверждает линейность методики.

Правильность. Открываемость результатов при оценке правильности методики должна находиться в диапазоне от 98,0 до 102,0%⁴. Готовили два стандартных раствора нафтифина (10 мкг/мл) для расчета сходимости между ними, а также три испытуемых раствора препарата, содержащих около 8, 10 и 12 мкг/мл нафтифина (табл. 4). Концентрацию нафтифина в испытуемом растворе (С_исп) определяли методом внешнего стандарта по формуле (1):

С_исп = S_исп × O_ст, (1)

где S_исп — площадь пика нафтифина на хроматограмме испытуемого раствора, O_ст — среднее значение отклика пика нафтифина (O_ст), рассчитанного по формуле (2) для двух последовательных хроматограмм стандартного раствора, полученных до и после хроматографирования испытуемого раствора.

(2)

где a_ст, P_ст, V_ст — навеска, чистота и объем разведения стандартного образца нафтифина соответственно, S_ст — средняя площадь пика нафтифина на хроматограммах стандартного раствора. Содержание нафтифина в препарате рассчитывали по формуле (3):

(3)

где a_исп, ρ_исп, V_исп — навеска, плотность и объем разведения препарата нафтифина соответственно, C_исп — концентрация нафтифина в испытуемом растворе.

Для вычисления открываемости использовали известное значение содержания нафтифина в препарате 9,79±0,09 мг/мл, определенное по методике производителя. Открываемость (%) рассчитывали как отношение определенного значения содержания нафтифина в препарате к известному.

Среднее значение открываемости составило 100,18±0,06% и находилось в границах диапазона приемлемости и диапазона известного значения содержания нафтифина в препарате. Полученные результаты подтверждают правильность разработанной аналитической методики.

Внутрилабораторная прецизионность и сходимость. Анализ отдельных проб испытуемого образца, отобранных в одной и той же серии, проводили два аналитика в разные дни на разном оборудовании с применением одних и тех же реактивов. Сходимость результатов определения содержания нафтифина для каждого аналитика оценивали по значению RSD, которое не должно было превышать 2,0%. Внутрилабораторную прецизионность определяли по значению RSD для общей выборки результатов двух аналитиков, также оценивали пересечение доверительных интервалов средних значений содержания нафтифина (табл. 5). Значение RSD не должно было превышать 2,0%, а пересечение доверительных интервалов считали приемлемым, если среднее значение содержания нафтифина, полученного каждым из аналитиков, находилось в границах доверительного интервала другого аналитика.

Значение RSD найденного содержания нафтифина не превышало 2,0% для каждого аналитика (0,59 и 0,26%). Для общей выборки результатов двух аналитиков RSD составило 0,44%, средние значения, полученные каждым аналитиком, находились в границах интервала другого аналитика. Полученные результаты подтверждают внутрилабораторную прецизионность и сходимость методики.

Устойчивость. Для оценки устойчивости методики количественного определения нафтифина при изменении условий проведения анализа хроматографировали стандартный раствор нафтифина концентрацией 10 мкг/мл и регистрировали влияние следующих параметров на результат:

• изменение температуры термостата колонок (от 20 до 60 °С);
• изменение скорости потока (±20%);
• изменение длины волны детектора (±2 нм от заданного значения 254 нм);
• использование альтернативных колонок (табл. 1).

Влияние изменений перечисленных параметров на результат анализа считали незначительным при соблюдении следующих характеристик пригодности системы:

• RSD площади пика нафтифина не превышает 2,0%;
• RSD времени удерживания пика нафтифина не превышает 2,0%;
• фактор симметрии пика нафтифина составляет от 0,8 до 1,5;
• число теоретических тарелок по пику нафтифина составляет не менее 2000;
• изменение площади пика нафтифина относительно полученной в стандартных условиях проведения анализа удовлетворяет критериям правильности и находится в диапазоне ±2%.

Результаты проведенных тестов, а также их соответствие критериям приемлемости приведены в таблице 6.

При изменении температуры термостатирования хроматографической колонки в диапазоне 25–60 ºС не наблюдали значительных изменений характеристик пиков. При температуре 20 ºС обнаружили увеличение числа теоретических тарелок для пика нафтифина, что связано с увеличением времени удерживания пика и его элюированием на другой стадии градиентной программы. При таком режиме элюирования есть вероятность наложения пика нафтифина на пики примесей и получения ошибочных результатов анализа. Влияния других параметров системы на характеристики ее пригодности не обнаружили.

При изменении скорости потока учитывали, что особенностью проточного спектрофотометрического детектора является изменение времени нахождения детектируемого вещества в ячейке детектора. Поэтому в расчетах при определении влияния скорости потока на результат значение площади пика нафтифина умножали на соответствующее значение скорости потока подвижной фазы (мл/мин). На основании полученных данных подтвердили, что при учете пересчета площадей система остается устойчивой к изменениям скорости потока элюента. При проведении анализа при измененной, но постоянной в течение анализа скорости потока, значительных влияний на результаты не обнаружили.

Изменение длины волны детектора в диапазоне ±2 нм от заданного значения не оказало существенного влияния на результат анализа. При замене хроматографической колонки также не обнаружили значительных различий в результатах количественного определения нафтифина. Однако при использовании колонки Acquity BEH Phenyl бóльшей длины и с частицами меньшего размера (75×2,1 мм, 1,7 мкм) обнаружили значительное увеличение эффективности хроматографического разделения, что может улучшить определение примесей нафтифина и послужить основой для более детального анализа. За счет изменения диаметра колонки ее свободный объем отличается незначительно (табл. 1), вследствие чего не происходит изменения времени удерживания пика нафтифина. Недостатком такой замены можно считать дополнительные требования к хроматографической системе, связанные с бóльшим давлением на колонке Acquity BEH Phenyl, что требует использования хроматографа системы ультраэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ).

Полученные результаты позволили подтвердить, что внесение изменений в условия проведения анализа не приводит к значительным изменениям результатов определения содержания нафтифина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования была разработана эффективная ВЭЖХ-методика количественного определения нафтифина в лекарственных средствах, которая позволяет сократить время анализа (время удерживания нафтифина — около 2 мин) и свести к минимуму расход используемых реагентов с сохранением критериев пригодности хроматографической системы. В ходе исследований определены оптимальные условия анализа: колонка XBridge Phenyl (20×4,6 мм, с размером частиц 2,5 мкм), температура колонки 30 ºС, подвижная фаза А — 0,1% раствор хлорной кислоты, подвижная фаза Б — ацетонитрил, элюирование в градиентном режиме с увеличением доли ацетонитрила от 30 до 80%, скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин, объем ввода пробы 5 мкл, детектирование при 254 нм для количественного определения нафтифина и 222 нм для определения примесей.

Показана возможность использования разных растворителей для приготовления испытуемого раствора для препаратов различных лекарственных форм без значимых изменений хроматографических параметров.

Проведена валидация разработанной методики, подтверждены ее специфичность, аналитическая область (концентрация растворов от 8 до 12 мг/мл), линейность (R² составил 0,9943), правильность (RSD составило 0,09%), сходимость (RSD составило 0,59%), внутрилабораторная прецизионность (RSD составило 0,44%) и робастность. Полученные результаты валидации соответствуют требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации и свидетельствуют о пригодности и воспроизводимости разработанной методики.

Выбраны предварительные условия анализа для определения содержания примесей нафтифина. Установлена возможность их разделения и предварительно определена длина волны детектирования (222 нм).

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.Ю. Якупов — идея, написание и графическое оформление текста рукописи, разработка хроматографических условий и проведение испытаний, выполнение валидации методики, интерпретация полученных результатов; С.И. Кулешова — разработка концепции исследования, критический пересмотр текста рукописи, анализ результатов; О.Н. Высочанская — проведение валидации, написание и графическое оформление текста рукописи; Е.П. Симонова — разработка условий проведения испытания, выполнение валидации методики.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Ilya Yu. Yakupov conceived the study idea, drafted the manuscript, designed the graphical material, developed the chromatographic conditions, conducted testing, validated the analytical procedure, and interpreted the results obtained. Svetlana I. Kuleshova conceptualised the study, critically revised the manuscript, and analysed the study results. Olga N. Vysochanskaya conducted validation, drafted the manuscript, and designed the graphical materiaL. Elena P. Simonova developed the testing conditions and validated the analytical procedure.