Метрологическая оценка методик определения воды полумикрометодом и микроопределением в лекарственной форме «Лиофилизаты»

ВВЕДЕНИЕ

Определение содержания воды является обязательным показателем при контроле качества лиофилизатов. Превышение содержания воды в лекарственной форме может оказать негативное влияние на физико-химические свойства лиофилизата, биодоступность действующего вещества (веществ), стабильность лиофилизата¹, привести к гидролизу действующих веществ или образованию примесей, которые могут оказывать влияние на терапевтическую эффективность лекарственного средства.

Поскольку вода в лиофилизатах может присутствовать в различных формах, количественное определение остаточной влажности должно быть точным, прецизионным и предпочтительно селективным. Количественное содержание остаточной влаги в лиофилизате может быть определено с помощью различных методов. Важно, чтобы метод, используемый для определения остаточной влажности, соответствовал изучаемому готовому продукту, количеству и состоянию присутствующей воды². В настоящее время наиболее часто для определения остаточной влажности используют: определение потери в массе при высушивании, титрование по методу Карла Фишера, термогравиметрический анализ и метод спектрометрии в ближней инфракрасной области.

В нормативную документацию на лиофилизаты включают следующие методы определения воды: потеря в массе при высушивании, титрование по К. Фишеру полумикрометодом (волюметрическое титрование) и микроопределение (кулонометрическое титрование). Учитывая разные подходы к оценке остаточной влажности в лиофилизатах, выбранный метод должен быть метрологически обоснованным и статистически достоверным. Это особенно важно, если для аналогичных лекарственных препаратов разных производителей предусмотрены различные методы контроля качества по показателю «Вода». В некоторых нормативных документах производителей эти методы указаны как альтернативные.

Физический метод оценки остаточной влажности (показатель качества «Потеря в массе при высушивании») в лиофилизатах широко применяется из-за универсальности и простоты выполнения анализа без использования сложного оборудования [1]. При этом метод является неселективным по отношению к воде, так как при нагревании испаряются летучие примеси и остаточные органические растворители.

Определение воды по методу К. Фишера основано на количественной реакции воды с серы диоксидом и йодом в подходящей безводной среде в присутствии основания с достаточной буферной емкостью³. Определение полумикрометодом (волюметрическое титрование) проводят путем титрования испытуемого образца в метаноле или ином растворителе реактивом К. Фишера. Реактив К. Фишера содержит йод, диоксид серы, амин (как правило, пиридин или имидазол) и неводный растворитель, в котором йод и диоксид серы быстро и количественно поглощаются водой, содержащейся в образце.

В случае микроопределения воды (кулонометрическое титрование) йод получают электрохимическим способом в результате анодного окисления йодид-иона в кулонометрической ячейке. Образующийся йод расходуется на реакцию до тех пор, пока в среде находится вода. Конечной точкой титрования служит возникновение избытка йода в среде, фиксируемое потенциометрически [2].

Цель работы — оценить влияние выбора метода на результат определения содержания воды в лекарственной форме «Лиофилизаты» на примере образца лекарственного средства «Микафунгин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования был выбран лиофилизат для приготовления раствора для инфузий «Микафунгин», действующее вещество которого представляет собой полусинтетический липопептид, получаемый путем химической модификации продуктов жизнедеятельности плесневого гриба Coleophoma empetri (Rostr.), являющегося патогеном растений. В структуре липопептида присутствуют гидрофобные цепи жирных кислот и гидрофильные пептиды. В настоящее время применяется для лечения инвазивного кандидоза⁴.

Содержание остаточных органических растворителей в лиофилизате для приготовления раствора для инфузий «Микафунгин» не нормируется, норма содержания воды в данных образцах варьируется производителями от «не более 1,5%» до «не более 3%». Все исследуемые объекты упакованы во флаконы первого гидролитического класса, укупорены пробкой резиновой, обжаты алюминиевым колпачком с пластиковой крышкой. Для проведения исследования были использованы образцы с действующим сроком годности. Учитывая наличие в структуре вещества гидрофильного компонента, а также на основании имеющихся данных по изучению стабильности можно предположить, что содержание воды в лиофилизате с течением времени может незначительно (в пределах 0,1%) увеличиваться в процессе хранения. Для нивелирования влияния фактора времени на увеличение содержания остаточной влажности в лиофилизате все сравнительные испытания объектов проводили параллельно.

Для принятия решения о возможной взаимозаменяемости методов анализа проведена оценка содержания воды в образце лиофилизата «Микафунгин» тремя разными методами: титрование по К. Фишеру полумикрометодом (волюметрическое титрование), микроопределение (кулонометрическое титрование) и определение потери в массе при высушивании. Титрование проводили на титраторах C30 Mettler Toledo (универсальный кулонометрический титратор) и Metrohm 787 KF Titrino. Для оценки потери в массе при высушивании образец высушивали при температуре 105 °С до постоянной массы. Каждый эксперимент проводили в трех повторностях, находили среднее значение результатов в каждой группе и объединенный средний результат всех полученных значений. Далее выполняли дисперсионный анализ ANOVA и апостериорные множественные сравнения с использованием критерия Тьюки, расчеты проводили в программе Microsoft Excel.

Для изучения подходов производителей к определению содержания воды в лиофилизатах проведен анализ проектов нормативных документов на препараты, содержащие микафунгин, поступивших в ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России на этапе регистрации лекарственного средства с 2020 по 2024 г.

Для сравнения результатов и оценки неопределенности измерений содержание воды полумикрометодом и микроопределением определяли в образцах лиофилизатов с микафунгином разных производителей. Для этого выполнили серии из трех параллельных измерений для четырех различных образцов в одинаковых условиях. В соответствии с методиками, представленными производителями препаратов, определение воды полумикрометодом проводили из точной навески препарата 0,5 г, а определение воды микроопределением проводили непосредственно из флакона. В растворителе (метанол) перед проведением анализа также определяли содержание воды, которое учитывали в окончательных расчетах.

Для интерпретации результатов эксперимента выполняли статистическую обработку данных в соответствии с фармакопейными требованиями⁵.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведен анализ содержания воды в одном образце лиофилизата тремя разными методами. Исходя из предположения, что полученные результаты содержания воды в лиофилизате принадлежат одной генеральной совокупности, за нулевую гипотезу принято утверждение, что на результат определения содержания воды методика определения не оказывает влияния. Чтобы принять или отвергнуть данную гипотезу, определено соотношение межгрупповой дисперсии к внутригрупповой дисперсии. В качестве показателя изменчивости использовали сумму квадратов отклонения значений содержания воды в образце от объединенного среднего. Общая сумма квадратов состояла из межгрупповой суммы квадратов и внутригрупповой суммы квадратов. Значение критерия Фишера вычислено на основании значений средних квадратов отклонений внутри групп и между ними и числом степеней свободы 2 между группами и 6 внутри групп⁶. Найденное значение критерия Фишера было больше критического при заданном количестве наблюдений и количестве групп при уровне доверительной вероятности 0,95. Следовательно, нулевая гипотеза должна быть отвергнута, выбор методики определения оказывает влияние на полученный результат. Результаты определения содержания воды в лиофилизате «Микафунгин» разными методами с однофакторным дисперсионным анализом ANOVA представлены в таблицах 1 и 2.

Проведены апостериорные множественные сравнения с использованием критерия Тьюки (Q) для определения статистических различий между результатами, полученными тремя разными методами. Для этого вычислена абсолютная разность между парами средних значений, полученных с использованием разных методов для определения содержания воды в образце. По данным объединенной средней дисперсии и размера выборки 3 для каждой группы вычислено критическое значение критерия Q_кр⁷. Абсолютная разность между всеми парами средних значений была больше Q_кр. Следовательно, разница в средних значениях между результатами, полученными тремя разными методами, статистически значима. Апостериорное сравнение результатов определения воды разными методами проведено с использованием критерия Тьюки (табл. 3).

Так как между всеми группами были выявлены статистически значимые различия, необходимо дальнейшее проведение исследования с использованием дополнительных источников информации.

Проведен анализ 20 проектов нормативных документов производителей лиофилизатов для приготовления раствора для инфузий, содержащих микафунгин, произведенных в 6 странах и зарегистрированных на территории Российской Федерации. В изученных документах метод потери в массе при высушивании для определения воды не используется. Проведение испытаний на содержание воды с использованием полумикрометода (волюметрическое титрование) включено в 13 проектов нормативных документов (65% от проанализированного количества документов), среди них в 8 документах разработчики рекомендуют проводить определение воды из точной навески препарата, а 5 разработчиков предлагают определять содержание воды непосредственно во флаконе лиофилизата. Проведение испытаний на содержание воды с использованием микроопределения (кулонометрическое титрование) включено в 7 (35%) проектов нормативных документов, при этом все разработчики, использующие микроопределение, рекомендуют проводить титрование непосредственно из флакона лиофилизата.

Производители оборудования для определения воды по методу К. Фишера рекомендуют использовать кулонометрическое титрование для образцов с низким влагосодержанием, например 0,001–1%. Волюметрическое титрование применяют при влагосодержании образца не менее 0,1%⁸.

Проведена оценка содержания воды в четырех образцах лиофилизатов микафунгина разных производителей полумикрометодом и микроопределением. Для сравнения двух дисперсий критерий Фишера вычислили как отношение большей дисперсии к меньшей и провели сравнение с критическим значением при доверительной вероятности 0,95. Для всех серий испытаний вычисленный критерий Фишера был меньше критического значения, это позволяет предположить, что различие между дисперсиями во всех сериях испытаний незначимо, следовательно, воспроизводимость методик одинакова.

Для сравнения средних результатов, полученных с применением разных методик, произведен расчет средневзвешенного стандартного отклонения и вычислен критерий Стьюдента. Критическим значением служил коэффициент Стьюдента при доверительной вероятности 0,95 для 2 степеней свободы. Для всех серий испытаний вычисленный критерий Стьюдента был больше критического значения, что позволяет признать неравенство средних результатов⁹, полученных с использованием разных методик. Содержание воды, определенное волюметрическим и кулонометрическим методами титрования по К. Фишеру, и результаты статистической обработки данных представлены в таблице 4.

Для оценки степени неопределенности полученных результатов рассчитаны граничные значения доверительных интервалов (ДИ) по критерию Стьюдента для каждого определения с доверительной вероятностью 0,95 и 0,99 для двустороннего интервала [3]. Результаты расчета граничных значений ДИ представлены в таблице 5.

Анализ вычисленной неопределенности измерений при определении содержания воды в образцах разными методами показал, что границы ДИ не пересекаются как при уровне доверительной вероятности 0,95, так и при уровне доверительной вероятности 0,99, что необходимо учитывать при выборе оптимального метода определения содержания воды.

Очевидно, при любом уровне доверительной вероятности неопределенность измерения содержания воды полумикрометодом меньше неопределенности, полученной при микроопределении того же показателя, что необходимо учитывать в случае получения результата, близкого к границе спецификации.

Однако оценка неопределенности измерений на основе определения граничных значений ДИ не учитывает возможного смещения результата, например из-за влияния пробоподготовки или особенностей оборудования. При оценке содержания воды полумикрометодом из точной навески смещение результата в сторону завышения может возникнуть из-за возможного поглощения воды лиофилизатом из окружающей среды при взвешивании препарата. При микроопределении воды смещение возникает, если продукты катодной реакции восстановления оказываются способными окисляться на аноде, что также может привести к завышенным результатам анализа. Данный эффект может быть минимизирован с помощью диафрагмы, разделяющей катодное и анодное отделение¹⁰. Для учета перечисленных факторов в суммарной неопределенности результата необходимо провести дополнительные исследования.

В связи с недостаточностью экспериментальных данных проведенное исследование не позволяет дать исчерпывающие рекомендации по выбору способа определения воды в лекарственных средствах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен анализ остаточного содержания воды в лиофилизате для приготовления раствора для инфузий «Микафунгин» методами определения потери в массе при высушивании, титрования по К. Фишеру полумикрометодом (волюметрическое титрование) и микроопределением (кулонометрическое титрование). Метрологическая оценка позволила выявить существенное различие результатов, полученных разными методами, что не позволяет рекомендовать их в качестве альтернативных.

Показано, что неопределенность измерений, основанная на вычислении граничных значений доверительного интервала, при определении воды полумикрометодом по К. Фишеру меньше неопределенности, полученной при микроопределении данного показателя.

При выборе способа определения содержания воды в лекарственной форме «Лиофилизаты» разработчики должны учитывать технологию производства лекарственного препарата, физическое состояние действующего вещества и вспомогательных веществ при их наличии.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.А. Турундаева — концепция работы, статистическая обработка данных, написание текста рукописи, формулировка выводов; Е.А. Мамашина — анализ нормативной документации, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; С.И. Кулешова — идея и концепция работы, участие в формулировании выводов, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; С.Е. Григорьева — проведение эксперимента; А.А. Рыжова — проведение эксперимента.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Anna A. Turundaeva conceptualised the study, performed statistical data processing, drafted the manuscript, and formulated the conclusions. Ermonia A. Mamashina analysed manufacturer specification files and approved the final version of the manuscript for publication. Svetlana I. Kuleshova elaborated the study idea and concept, participated in the formulation of the conclusions, and approved the final version of the manuscript for publication. Svetlana E. Grigorieva conducted experiments. Anastasia A. Ryzhova conducted experiments.