Валидация методики оценки биологической активности лекарственного препарата на основе тоцилизумаба и определение критериев приемлемости результатов анализа

ВВЕДЕНИЕ

Интерлейкин-6 (ИЛ-6) относится к цитокинам острой воспалительной фазы и участвует в регуляции функций иммунной, кроветворной, нервной и других систем организма. Показано значимое влияние ИЛ-6 на развитие ревматоидного артрита, пролиферацию опухолевых клеток при раке кишечника, поджелудочной железы, молочной железы, множественной миеломе и других онкологических заболеваниях [1]. Также описана стимулирующая роль ИЛ-6 в развитии «цитокинового шторма» при заболевании COVID-19 [2][3]. Одним из способов терапии этих состояний является использование лекарственных средств (ЛС) на основе моноклональных антител (мАт), направленных на инактивацию ИЛ-6, в частности тоцилизумаба. Тоцилизумаб — это рекомбинантное гуманизированное мАт подкласса иммуноглобулинов IgG1, взаимодействующее с экстраклеточной частью мембраноассоциированных и растворимых форм рецептора ИЛ-6. Связывание тоцилизумаба блокирует взаимодействие рецептора с ИЛ-6 и таким образом ингибирует биологическое действие ИЛ-6 [4].

Критическим показателем качества любого биотехнологического ЛС, будь то гормоны, цитокины или моноклональные антитела, является специфическая биологическая активность¹. Биологические методики оценки специфической активности в условиях in vitro уникальны для каждого ЛС, поскольку результат анализа должен коррелировать с терапевтической эффективностью препарата [5].

Для оценки способности тоцилизумаба связываться со своей мишенью применяют такие методы, как иммуноферментный анализ (ИФА), поверхностный плазмонный резонанс или проточная цитометрия. Однако данные подходы отражают только первый этап механизма действия тоцилизумаба. Комплексно оценить активность ЛС можно с применением методик, основанных на использовании клеточных культур, которые отвечают на сигнал, запускаемый связыванием ИЛ-6 со своим рецептором, что позволяет количественно оценить функциональные свойства препарата. Так, например, можно использовать методы ИФА или проточной цитометрии, основанные на оценке ИЛ-6-индуцированного фосфорилирования сигнального транскрипционного белка STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), запускаемого связыванием ИЛ-6 со своим рецептором [6]. Недостатком таких подходов является их многоэтапность, что отрицательно влияет на прецизионность методик. Специфическую активность тоцилизумаба [6] предложено оценивать по антипролиферативному эффекту ЛС на ИЛ-6-зависимые клетки линии В-клеточной лимфомы DS-1 (ATCC® CRL-11102^ТМ). Однако нами был выбран подход с использованием репортерной линии клеток HEK-Blue™ IL-6. Связывание ИЛ-6 со своим рецептором на поверхности указанных клеток активирует янус-киназу и фосфорилирование STAT3, что запускает синтез секретируемой щелочной фосфатазы (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP). Данная методика обладает рядом преимуществ:

1) демонстрирует специфичный дозозависимый ответ клеток на ИЛ-6;

2) отражает воспроизведение механизма передачи внутриклеточного сигнала после связывания ИЛ-6 с рецептором через фосфорилирование STAT3;

3) отличается относительной простотой выполнения.

Цель работы — получить экспериментальное подтверждение соответствия методики оценки биологической активности лекарственного средства на основе разрабатываемого биоаналога тоцилизумаба (GNR-087) валидационным требованиям и определить количественные границы критериев пригодности аналитической системы и приемлемости результатов анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было оценить специфичность, правильность, линейность в аналитическом диапазоне, прецизионность и устойчивость методики к внесению контролируемых изменений, установить количественные границы критериев пригодности аналитической системы и критериев приемлемости результатов анализа, что является неотъемлемой частью валидации методики и гарантией достоверности полученных с помощью этой методики результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Как правило, при количественной оценке биологической активности анализируют не менее 6–8 серийных разведений стандартного (СО) и испытуемого образца (ИО), каждое разведение тестируют в 3–4 повторностях и аппроксимируют зависимость «доза — ответ» для каждого образца 4-параметрической функцией (4PL). В таких случаях специфическая активность определяется как отношение найденных значений полумаксимальных разведений или концентраций СО и ИО. В качестве критериев пригодности аналитической системы обычно устанавливают параметры для положительного и отрицательного контролей, а также для СО. Критерии приемлемости результатов анализа включают критерии для ИО. При обработке первичных данных необходимо использовать двухуровневую последовательную оценку их соответствия выбранным критериям. На первом этапе необходимо оценить соответствие первичных данных анализа критериям пригодности системы. Несоответствие данных на этом этапе означает, что полученные результаты следует признать недостоверными и повторить анализ. Соблюдение критериев пригодности системы позволяет перейти ко второму этапу — оценке соответствия данных анализа критериям приемлемости для ИО. Расчет специфической активности ИО производят только в том случае, если первичные данные удовлетворяют критериям приемлемости результатов анализа².

При разработке методики в качестве критериев пригодности аналитической системы использовали следующие параметры:

1) разность средних значений оптической плотности (ОП) отрицательного (клетки в базовой среде) и положительного (клетки в среде для теста, содержащей ИЛ-6) контрольных образцов;

2) соотношение средних значений ОП максимального и минимального разведений образцов со средними значениями ОП отрицательного и положительного контрольных образцов соответственно;

3) коэффициент вариации ОП (CV_ОП, %) для каждого разведения СО и контрольных образцов;

4) коэффициент детерминации (R²) кривой зависимости ОП от логарифма разведений СО. Критерии оценки параллелизма включали:

5) соотношение углов наклона (slope);

6) соотношения верхних (top) и нижних (bottom) асимптот кривых зависимости «доза — ответ» СО и ИО [7][8].

Критериями приемлемости для ИО являлись значения CV_ОП для каждого разведения и R² кривой зависимости «доза — ответ».

Приготовление модельных образцов GNR-087. Модельные образцы (МО) с различным содержанием GNR-087 готовили в среде для выполнения теста ДМЕМ/Ф12 (ООО НПП «ПанЭко», кат. № С470п), содержащей фетальную бычью сыворотку 10% oб. (Capricorn Scientific GmbH, кат. № FBS-HI-11A), L-глютамин 2 мМ (ООО НПП «ПанЭко», кат. № Ф032), смесь пенициллина 100 ЕД/мл и стрептомицина 0,1 мг/мл (ООО НПП «ПанЭко», кат. № А075) и ИЛ-6 1 нг/мл (R&D Systems, кат. № 206-IL-010) согласно таблице 1. Каждый МО анализировали в 12 последовательных разведениях с шагом 1:3. Для МО с активностью 100% диапазон разведения по концентрации белка составил 1987,3–0,0112 нМ (кратность от 68 до 12045996).

Продолжительность полного аналитического цикла составляла 3 сут. На один планшет для анализа вносили разведения одного из МО с симулированной активностью от 60 до 140% (МО-ИО) и разведения МО с активностью 100%, который использовали в качестве стандартного образца (МО-СО), а также положительный и отрицательный контрольные образцы. Каждый аналитический цикл состоял из трех этапов: 1) рассев репортерных клеток на планшет, инкубация клеток; 2) внесение на планшет МО-СО, МО-ИО и контрольных образцов; 3) спектрофотометрическая оценка количества SEAP. В зависимости от вида валидационного испытания в течение одного аналитического цикла оценку количества SEAP проводили для одного или нескольких планшетов с независимо приготовленными разведениями МО-СО и МО-ИО.

Процедура анализа. Культивирование клеток HEK-Blue™ IL-6 (InvivoGen, кат. № hkb-hil6) проводили в базовой среде согласно инструкции производителя: ДМЕМ/Ф12, содержащая фетальную бычью сыворотку (10%), L-глютамин (2 мМ), пенициллин (100 EД/мл), стрептомицин (0,1 мг/мл) с добавлением Нормоцина™ (100 мкг/мл) (InvivoGen, кат. № ant-nr-05) и Селектиона™ (0,004% oб.) (InvivoGen, кат. № hb-sel). Во всех валидационных испытаниях кроме тестирования методики по критерию «устойчивость к смене пассажа клеток» использовали клетки 6-го пассажа. В лунки плоскодонных 96-луночных планшетов вносили 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 200 тыс. кл./мл в базовой среде и инкубировали в СО₂-инкубаторе Galaxy 170S (Eppendorf) при температуре 37±1 ºС, 5,0±0,5% СО₂ и 95% влажности (стандартные условия) в течение 20±2 ч. После инкубации в лунки вносили по 100 мкл одного из МО-ИО и разведения МО-СО. В лунки отрицательного контроля (К-) вносили по 100 мкл базовой среды, в лунки положительного контроля (К+) вносили по 100 мкл среды для выполнения теста. МО-ИО и МО-СО тестировали в трех повторностях для каждого разведения, а отрицательный и положительный контрольные образцы — в шести повторностях. Инкубировали клетки с образцами в течение 24±1 ч в стандартных условиях, после чего вносили по 100 мкл реагента для детекции SEAP (InvivoGen, кат. № rep-qbs). Инкубировали в стандартных условиях в течение 60±5 мин и измеряли ОП на планшетном спектрофотометре Infinite M200 (Tecan Group Ltd) при длине волны 655 нм.

Статистическая обработка результатов. Обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 6.0, аппроксимируя зависимость значений ОП от десятичного логарифма величины, обратной разведению образца (lg 1/dilution), функцией ингибирования 4PL. Значения полумаксимального ингибирующего разведения (ID₅₀) и R² для СО и ИО рассчитывали автоматически. Расчет средних значений ОП, стандартного отклонения (SD), значений CV_ОП и критериев пригодности системы проводили с использованием программы Microsoft Excel.

Полученные результаты сначала оценивали на соответствие критериям пригодности системы, а затем — критериям приемлемости результатов анализа для ИО.

Критерии пригодности системы:

• коэффициент детерминации R²дозозависимой кривой СО должен быть не менее 0,95;
• коэффициент вариации CV_ОПдля каждого разведения СО, а также для положительного и отрицательного контрольных образцов не должен превышать 20%.

Критерии приемлемости результатов анализа для ИО:

• соотношение значений верхних асимптот дозозависимых кривых СО и ИО должно быть в пределах 0,8–1,25;
• соотношение значений нижних асимптот дозозависимых кривых СО и ИО должно быть в пределах 0,8–1,25;
• соотношение значений углов наклона дозозависимых кривых СО и ИО должно быть в пределах 0,8–1,25;
• коэффициент детерминации R²дозозависимой кривой ИО должен быть не менее 0,95;
• коэффициент вариации CV_ОПдля каждого разведения ИО не должен превышать 20%.

При соблюдении критериев приемлемости для ИО рассчитывали значения относительной специфической активности (RP, %), используя формулу:

(1)

где ID₅₀(МО-СО_100) — значение ID₅₀ для МО со 100% активностью (СО);

ID₅₀(МО-ИО_Х) — значение ID₅₀ для МО с симулированной активностью (ИО).

Правильность определения значения RP для тестируемой пробы — коэффициент выявления (recovery) — (Rc, %) вычисляли по формуле:

(2)

где RP_найд и RP_теор — найденное и теоретическое значения относительной специфической активности препарата соответственно.

Оценивали следующие валидационные характеристики методики: специфичность, прецизионность, правильность, линейность и робастность (устойчивость).

Выполнение валидационных испытаний. Специфичность методики определяли в одном аналитическом цикле, используя в качестве МО-ИО мАт с другой специфичностью, но сходным строением Fc-фрагмента. Валидационные испытания по оценке прецизионности методики (повторяемости/сходимости и внутрилаборатной прецизионности между аналитиками и между днями) проводили в течение нескольких независимых аналитических циклов.

Сходимость оценивали по величине коэффициента вариаций значений RP (CV_RP, %), полученных в трех независимых АЦ, проведенных каждым из аналитиков в течение короткого промежутка времени. Внутрилабораторную прецизионность между аналитиками оценивали по величине CV_RP, рассчитанной как среднее значение результатов, полученных двумя аналитиками в АЦ, проведенных одновременно. Внутрилабораторную прецизионность между днями также оценивали по величине CV_RP каждого МО-ИО с симулированной активностью от 60 до 140%, полученной в разных аналитических циклах каждым аналитиком.

Правильность методики оценивали на МО с симулированной активностью в диапазоне от 60 до 140% номинальной активности (не менее пяти МО-ИО). Методику считали соответствующей критерию «правильность», если значения, принимаемые за истинные (RP_теор), лежали внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов, полученных экспериментально (RP_найд)³. Дополнительно для оценки правильности методики каждым аналитиком был проведен аналитический цикл с образцом с неизвестной симулированной активностью («слепая проба»).

Линейность методики в аналитическом диапазоне (60–140% активности) проверяли с использованием пяти МО-ИО с симулированной активностью. Для оценки линейности строили график линейной регрессии RP_найд от RP_теор и график остатков.

Оценку устойчивости методики проверяли, внося в аналитическую систему контролируемые изменения: 1) использование клеток разных пассажей (от 6 до 10); 2) использование ИЛ-6 двух разных лотов; 3) использование реагента для детекции SEAP двух разных лотов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На этапе разработки методики были подобраны оптимальные условия проведения анализа — концентрация ИЛ-6 и диапазон разведений GNR-087, количество клеток на лунку, время инкубации и др. В качестве основных критериев рассматривали характеристики дозозависимой кривой 4PL, соответствующие следующим требованиям:

• диапазон разведений тоцилизумаба должен давать размах значений ОП от уровня значений ОП положительного контрольного образца (К+, среда для выполнения теста) до уровня значений ОП отрицательного контрольного образца (К–, базовая среда), при этом значения ОП при минимальном и максимальном разведении ЛС должны быть близки к значениям К– и К+ соответственно;
• дозозависимая кривая должна быть симметричной, при этом на верхней и нижней асимптотах должно быть не менее 3-х точек и не менее 3-х точек должно находиться на линейной части кривой [5].

Типичная дозозависимая кривая представлена на рисунке 1.

При определении специфичности методики использовали омализумаб (серия AVXS257506, «Новартис Фарма АГ»), поскольку омализумаб, как и тоцилизумаб, относится к подклассу IgG1 антител, но имеет другую специфичность и не способен связывать рецептор ИЛ-6. Омализумаб вносили в аналитическую систему в концентрациях, соответствующих концентрациям тоцилизумаба в разведениях МО-ИО_100, при этом разведения тоцилизумаба использовали как СО, а разведения омализумаба как ИО. Результаты считали приемлемыми, если критерии пригодности системы были соблюдены и наблюдалось дозозависимое ингибирование тоцилизумабом ИЛ-6-зависимой секреции SEAP, а при действии омализумаба ингибирование отсутствовало. Полученные результаты подтвердили специфичность методики (рис. 2).

Прецизионность методики определяют по близости результатов, получаемых одним аналитиком в нескольких аналитических циклах, проведенных в течение короткого промежутка времени (сходимость, повторяемость) и (или) разными аналитиками в разные дни (промежуточная, внутрилаборатоная прецизионность)⁴. Методику считали соответствующей критериям прецизионности, если CV_RP для каждого МО-ИО не превышал 20%.

Тестирование методики по показателям «сходимость» и «внутрилабораторная прецизионность между аналитиками» проводили два аналитика с использованием МО-ИО_100. Разброс значений RP, полученный в испытаниях «сходимость» и «внутрилабораторная прецизионность между аналитиками», представлен на рисунке 3.

В испытании сходимости средние значения RP±SD составили 102±9% и 107±4% у аналитиков 1 и 2. CV_RP между аналитическими циклами аналитиков 1 и 2 был 8 и 4% соответственно. При тестировании «воспроизводимости между аналитиками» RP±SD были равны 105±0,7%, 111±1,4% и 99±8,5% в аналитических циклах 1–3. Значения CV_RP составили 1% в аналитических циклах 1–2 и 9% в аналитическом цикле 3.

Для оценки внутрилабораторной прецизионности между днями каждым аналитиком было протестировано по пять ИО-МО с симулированной активностью от 60 до 140%. Было выполнено по три независимых аналитических цикла с каждым МО-ИО с разницей в несколько дней. Разброс значений RP_найд в испытании внутрилабораторной прецизионности между днями представлен на рисунке 4. Средние значения RP, SD и CV_RP представлены в таблице 2 «Средние значения относительной специфической активности и коэффициенты вариации_, полученные двумя аналитиками в тесте “воспроизводимость между днями”», опубликованной на сайте журнала⁵.

При оценке внутрилабораторной прецизионности максимальное значение CV_RP составило 9% для прецизионности между аналитиками и 14% для прецизионности между днями. Полученные результаты соответствовали требованиями, предъявляемым к прецизионности методики.

Под правильностью методики понимают близость полученных значений к значениям, принимаемым за истинное. Согласно Государственной фармакопее Российской Федерации валидируемая методика соответствует критерию «правильность», если значения, принимаемые за истинные (RP_теор), лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике (RP_найд)⁶. В нормативных документах нет четких указаний к определению правильности клеточных тестов для оценки специфической активности биологических ЛС. В своей работе мы опирались на рекомендации для методик, основанных на оценке связывания лиганда (ligand-binding assay, LBAs), как наиболее близких к клеточным тестам. Согласно рекомендациям⁷, разброс значений между тестируемым и номинальным значением измеряемого показателя не должен превышать 20%. Для образцов нижнего (НПКО) и верхнего (ВКПО) пределов количественного определения разброс значений может возрастать до 25%⁸. То есть значение коэффициента Rec, вычисленного по формуле 2, для тестируемой пробы должно находиться в диапазоне 80–120%, а в случае НПКО и ВКПО — в диапазоне 75–125%. В описанной методике МО-ИО_60 рассматривали как НПКО, а МО-ИО-140 как ВПКО, поэтому разброс значений (CV_Rc) допускался до 25%, для остальных МО-ИО CV_Rc не должен был превышать 20%.

Результаты валидационных испытаний по критерию «правильность» считали приемлемыми, если соблюдались следующие условия:

• значение Rcдля МО с симулированной активностью от 80 до 120% должно находиться в диапазоне от 80 до 120% включительно;
• значение Rcдля МО с симулированной активностью 60 и 140% должно быть в диапазоне от 75 до 125% включительно;
• значения Rcдля «слепой пробы» должны находиться в диапазоне от 80 до 120% или от 75 до 125% включительно;
• теоретические значения RPдолжны находиться внутри доверительных интервалов средних найденных значений RP.

Средние значения Rc, SD_Rc, CV_Rc, а также границы 95% доверительных интервалов (95% ДИ) для каждого МО-ИО с симулированной активностью представлены в таблице 3 «Результаты валидационных испытаний на соответствие методики критерию “правильность” с использованием модельных образцов»⁹, результаты тестирования «слепой пробы» — в таблице 4 «Результаты валидационных испытаний на соответствие методики критерию “правильность” с использованием “слепой пробы”», опубликованных на сайте журнала¹⁰. Значения Rс МО-ИО с симулированной активностью от 60 до 140%, в том числе результатов анализа «слепой пробы», находились в диапазоне 80–120% от номинальной активности.

Соответствие полученных данных установленным требованиям к критерию «правильность» позволило нам сделать вывод, что разработанная методика характеризуется приемлемой правильностью в аналитическом диапазоне от 60 до 140% номинальной активности препарата.

Для подтверждения линейной зависимости аналитического сигнала от количества определяемого вещества в пределах аналитической области методики¹¹ строили графики линейной регрессии и графики остатков, аппроксимируя значения измеренной активности препарата (RP_найд) от ожидаемой величины (RP_теор) в МО с симулированной активностью от 60 до 140%. Определение линейности методики проводили, используя данные, полученные в испытаниях «воспроизводимости между днями». Считали, что методика соответствует критерию «линейность» при соблюдении следующих условий:

• значение R²должно быть не менее 0,95 (R²≥0,95);
• значение коэффициента kв уравнении линейной регрессии y=kx±b должно быть в диапазоне 0,8≤k≤1,2;
• график остатков должен носить случайный характер распределения.

Значение коэффициента R² составило 0,9973 для результатов аналитика 1, и 0,9916 — у аналитика 2. Уравнение линейной зависимости по результатам аналитика 1 было выражено как у=0,9800x+8,00 и у аналитика 2 как у=1,155x—15,90. По усредненным результатам двух аналитиков у=1,060х–3,000. Графики остатков демонстрировали случайный характер распределения. Таким образом, было показано, что методика характеризуется приемлемой линейностью в аналитическом диапазоне от 60 до 140% номинальной активности препарата.

Для анализа устойчивости методики при вероятных небольших отклонениях от оптимальных условий проведения анализа¹² тестировали возможные изменения критичных компонентов биоаналитической системы: 1) другой пассаж репортерных клеток; 2) другой лот ИЛ-6; 3) другой лот реагента для детекции SEAP.

Для оценки влияния пассажа клеток на определение RP проводили три независимых аналитических цикла с использованием клеток 6-го, 7-го и 10-го пассажей. Для анализа влияния лота ИЛ-6 было выполнено по одному независимому аналитическому циклу для каждого лота. По аналогии с ИЛ-6 было проверено влияние лота реагента для детекции SEAP. Все аналитические циклы в исследовании устойчивости были проведены одним аналитиком с использованием МО-ИО_100. Методику считали устойчивой, если при смене компонентов аналитической системы значение Rc для МО_100 находилось в интервале от 80 до 120%, а CV_Rc не превышал 20%.

При использовании клеток 6, 7 и 10-го пассажей Rс составлял 115, 105 и 110% соответственно, CV_Rc составлял 5%. При замене лотов ИЛ-6 Rс составлял 97 и 96% для лота 1 и 2 соответственно, а CV_Rс был равен 1%. Значения Rc при использовании лотов 1 и 2 реагента для детекции SEAP были равны 97 и 93%, CV_Rс между этими значениями — 3%.

Поскольку значения Rс при изменении перечисленных компонентов системы находились в пределах от 80 до 120%, CV_Rc не превышал 20%, был сделан вывод об устойчивости методики при использовании диапазона пассажа клеток с 6 по 10 и при замене лотов ИЛ-6 и реагента для детекции SEAP.

Расчет критериев приемлемости результатов. До начала валидационных испытаний нами были разработаны предварительные (установленные до анализа) критерии пригодности системы и критерии приемлемости результатов анализа для ИО, а также установлены их допустимые значения. Результаты, полученные в испытаниях, были статистически обработаны, и для каждого критерия были установлены предельно допустимые значения (табл. 5).

Систему считали пригодной, если R² кривой СО был выше или равен 0,95, а CV_ОП для каждого разведения СО, положительного и отрицательного контрольных образцов не превышал 20%. Минимальное значение R² СО составило 0,9965, а максимальное значение CV_ОП СО, (К+) и (К-) было 15%. По результатам валидационных испытаний нижнюю границу R² СО оставили на значении 0,95, а верхнюю границу CV_ОП СО, (К+) и (К-) снизили до 15% (табл. 5).

Расчет RP МО-ИО проводили, если первичные результаты тестирования ИО соответствовали критериям приемлемости результатов для ИО. Критерии включали в себя оценку параллелизма дозозависимых кривых СО и ИО, а также минимального значения R² ИО и максимального значения CV_ОП разведений ИО. Дозозависимые кривые СО и ИО считали параллельными, если соотношения значений верхних и нижних асимптот находились в диапазоне 0,8–1,25, а соотношение углов наклона — в диапазоне 0,7–1,25. При этом значение R² ИО должно было быть не ниже 0,95, а CV_ОП для каждого разведения ИО — не выше 20%. Средние значения соотношений асимптот ±3SD составили 1,02±0,16 для верхних асимптот, для нижних асимптот 0,99±0,07 и для углов наклона 1,01±0,15. Параллелизм дозозависимых кривых СО и ИО был подтвержден. Минимальное значение R² ИО было 0,9967, максимальное значение CV_ОП ИО — 14%. Границы критериев параллелизма дозозависимых кривых и минимальное значение R² ИО оставлены без изменений, а верхняя граница CV_ОП разведений ИО снижена до 15%.

Однако более полная характеристика правильности работы системы в каждом аналитическом цикле требует расширения перечня критериев ее пригодности. Поскольку в основе методики лежит дозозависимый ответ репортерных клеток HEK-Blue™ IL-6 на ИЛ-6, дополнительные критерии пригодности системы должны характеризовать этот ответ. К таким характеристикам относили: 1) подтверждение активирующего действия ИЛ-6 на индукцию щелочной фосфатазы и отсутствие ИЛ-6-независимой секреции; 2) полное ингибирование сигнала ИЛ-6 при инкубации клеток HEK-Blue™ IL-6 с минимальными разведениями СО; 3) отсутствие ингибирования при инкубации с максимальными разведениями СО; 4) разницу средних значений ОП верхней и нижней асимптот СО.

Для подтверждения активирующего действия ИЛ-6 и отсутствия спонтанной секреции рассчитывали разницу между средними значениями ОП положительного и отрицательного контрольных образцов (ОП_К+ и ОП_К–). Полное ингибирование сигнала ИЛ-6 тоцилизумабом определяли по отношению средних значений ОП лунок с максимальным разведением СО к средним значениям лунок ОП_К–, а отсутствие ингибирующего действия — по отношению средних значений ОП лунок с минимальным разведением СО к средним значениям лунок ОП_К+. Также для подтверждения ингибирующего действия тоцилизумаба в зависимости от дозы рассчитывали разницу средних значений ОП верхних и нижних асимптот СО.

Минимальное значение разницы средних значений ОП_К+ и ОП_К– составило 0,31. Максимальное значение соотношения средних значений ОП лунок минимального разведения СО и К+ было равным 1,0, а минимальное значение соотношения средних значений ОП лунок максимального разведения СО и К- составляло 0,72. Минимальное значение разницы ОП лунок максимального (верхняя асимптота) и минимального (нижняя асимптота) разведений составляло 0,42. Полученные значения были приняты в качестве границ критериев пригодности системы (табл. 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представлены результаты валидации методики определения специфической активности GNR-087 с использованием репортерной клеточной линии HEK-Blue™ IL-6, а также расчет количественных границ критериев пригодности системы и критериев приемлемости результатов анализа. Показано, что количественные границы критериев по мере накопления дополнительных данных могут быть ужесточены.

Валидационные испытания подтвердили, что разработанная методика оценки биологической активности лекарственных средств на основе тоцилизумаба, основанная на ингибировании ИЛ-6 зависимой секреции эмбриональной щелочной фосфатазы SEAP, измеряемой спектрофотометрически, обладает приемлемой специфичностью, правильностью, повторяемостью, внутрилабораторной прецизионностью и линейностью в аналитическом диапазоне от 60 до 140% от номинальной активности препарата.

Специфичность методики подтверждена дозозависимым ингибированием тоцилизумабом ИЛ-6-зависимой секреции SEAP и отсутствием ингибирования при действии омализумаба. Методика прецизионна — вариабельность результатов при исследовании сходимости составила 8 и 4% соответственно у аналитиков 1 и 2 и 14% при исследовании «воспроизводимости между аналитиками». Подтверждена правильность методики — значение коэффициента выявления (Rс) модельных образцов со симулированной активностью в диапазоне от 60 до 140% и «слепых проб» находились в диапазоне от 80 до 120%, а теоретические значения относительной специфической активности (RP) находились внутри доверительных интервалов средних найденных значений RP. Методика линейна, что подтверждено значениями коэффициента детерминации R²≥0,99, значение коэффициента k в уравнении линейной регрессии находилось в диапазоне от 0,8 до 1,2 и графики остатков демонстрировали случайный характер распределения. Показана устойчивость методики к использованию репортерных клеток разных пассажей (от 6-го до 10-го) (CV_RP=10%), замене лотов ИЛ-6 (CV_RP=1%) и реагента для детекции SEAP (CV_RP=3%), при этом значение Rс во всех случаях находилось в диапазоне 80–120% от номинального значения RP.

Разработанная методика может служить как для рутинного контроля биологической активности, так и для использования в исследованиях при доказательстве биоподобия разрабатываемых препаратов оригинальному (референтному) препарату на основе тоцилизумаба.

Дополнительная информация. На сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств» размещены таблицы 2–4.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329-table2

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329-table3

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329-table4

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Ю.А. Никонова — выполнение валидационных испытаний, анализ полученных результатов, расчет критериев приемлемости, написание текста рукописи; С.Г. Аббасова — разработка концепции исследования, анализ полученных результатов, расчет критериев приемлемости, написание и редактирование текста рукописи; П.Е. Каргополова — выполнение валидационных испытаний; О.М. Стрижакова — разработка методики оценки биологической активности тоцилизумаба, критический пересмотр текста рукописи; И.В. Лягоскин — критический пересмотр текста рукописи, анализ полученных результатов, согласование и утверждение окончательного варианта рукописи для публикации; А.П. Василев — разработка методики оценки биологической активности тоцилизумаба; А.С. Першин — критический пересмотр текста рукописи, согласование и утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Additional information. Tables 2–4 are posted on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329-table2

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329-table3

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-317-329-table4

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Yulia A. Nikonova performed validation tests, analysed the results obtained, calculated acceptance criteria, and drafted the manuscript. Svetlana G. Abbasova conceptualised the study, analysed the results obtained, calculated acceptance criteria, drafted and edited the manuscript. Polina E. Kargopolova performed validation tests. Olga M. Strizhakova developed the analytical procedure for assessing the biological activity of tocilizumab and critically revised the manuscript. Ivan V. Lyagoskin critically revised the manuscript, analysed the results obtained, coordinated approvals and approved the final version of the manuscript for publication. Alexandr P. Vasilev developed the analytical procedure for assessing the biological activity of tocilizumab. Andrey S. Pershin critically revised the manuscript, coordinated approvals and approved the final version of the manuscript for publication.