Определение гидроксикоричных кислот в растительном сырье спектрофотометрическим методом. Часть 2. Определение гидроксикоричных кислот в присутствии полифенольных соединений (обзор)

ВВЕДЕНИЕ

Основной трудностью количественного определения гидроксикоричных кислот (ГКК) в растительных объектах является то, что полифенольные соединения разных классов имеют ярко выраженные полосы поглощения практически в одной и той же области ультрафиолетового спектра, что делает невозможным или затруднительным их определение в растительном сырье методом прямой спектрофотометрии (СФМ). Таким образом, прямую СФМ заменяют специфическими вариантами метода (хромато-СФМ, экстракционной СФМ), комбинируют дифференциальную СФМ и расчетные методы, проводят предварительную пробоподготовку путем химической модификации биологически активных соединений (БАС) [1]. В зарубежные фармакопеи введены методики с использованием реактива Арнова (водный раствор нитрита натрия и молибдата натрия). Так, согласно требованиям Европейской фармакопеи¹ молибдат аммония в смеси с нитритом натрия используется при определении суммы ГКК в растительном сырье подорожника ланцетолистного (Plantago lanceolata L.), белокудренника черного (Ballota nigra L.), ясеня обыкновенного (Fraxinus excelsior L.) и розмарина лекарственного (Rosmarinus officinalis L.). В Государственной фармакопее Республики Беларусь² (ГФ РБ) с помощью реактива Арнова определяется сумма производных фенолокислот или ГКК в корнях одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.), в листьях и траве мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.), створках фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.). Кроме того, в ГФ РБ для определения суммы ГКК в траве эхинацеи пурпурной (Echinaceae purpureae (L.) Moench.) используется сочетание методов бумажной хроматографии (БХ) и СФМ³. По нашему мнению, представляет интерес систематизация данных по использованию различных вариантов СФМ при изучении ГКК в растительном сырье.

Материалом для написания настоящего обзора служили данные источников отечественной научной литературы (научные журналы и публикации научных конференций) за период 2007–2023 гг. Семантический поиск был проведен с использованием информационно-поисковых (PubMed, GoogleScholar), библиотечных баз данных (eLIBRARY.RU, КиберЛенинка) и приложения ResearchGate.

Цель работы — оценка возможности определения количественного содержания гидроксикоричных кислот в присутствии других полифенольных соединений в лекарственном растительном сырье методом спектрофотометрии.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Метод хромато-спектрофотометрии

Одним из первых для определения ГКК в растительном сырье описан метод хромато-спектрофотометрии, согласно которому для отделения суммы ГКК используются различные варианты хроматографии. Наиболее простые и доступные способы разделения основаны на использовании БХ и тонкослойной (ТСХ) хроматографии с разными сорбентами.

Примером использования хромато-СФМ является методика определения ГКК в нескольких видах медуниц (Pulmonaria officinalis L., P. mollissima A. Kerner, P. obscura Dumort), синяке обыкновенном (Echium vulgare L.) и бруннере сибирской (Brunnera sibirica Steven) [2]. Растительное сырье подвергали экстракции спиртом этиловым 90% трижды при комнатной температуре, затем дважды при нагревании водяной бане. ГКК в объединенном извлечении разделяли на хроматографической бумаге «Ленинградская средняя» в системе растворителей: кислота уксусная ледяная — вода (2:98 об.:об.). Аналитические длины волн (АДВ) для количественного определения ГКК выбраны сравнением УФ-спектров элюатов и растворов стандартных образцов (СО) ГКК. Для медуниц всех видов количественное определение ГКК проводили по АДВ поглощения хлорогеновой кислоты; для синяка обыкновенного — транс-коричной кислоты; для бруннеры сибирской — кофейной кислоты с помощью градуировочных графиков, построенных с использованием СО этих соединений. В траве Brunnera sibirica Steven содержание суммы ГКК составило 0,63%, в листьях Pulmonaria mollissima A. Kerner, P. obscura Dumort, P. officinalis L. — соответственно 1,53; 2,02; 1,33%, и в Echium vulgare L. — 1,13% [2].

Условия определения ГКК в ряде видов растительного сырья методом хромато-СФМ приведены в таблице 1. При использовании данного метода после детектирования хроматограммы с раствором СО отмечают участки на хроматограмме извлечения с зонами, соответствующими проявленным полосам СО, и вырезают их. Из вырезанных участков ГКК элюируют растворителем, элюаты обьединяют и измеряют оптическую плотность в максимуме поглощения доминирующей кислоты.

ГКК из растительного сырья извлекают в основном спиртом этиловым различной концентрации при кратности экстракции от 1 до 3 раз и настаивании как при комнатной температуре, так и на кипящей водяной бане. При комнатной температуре извлечение проводят в течение суток, тогда как при нагревании время экстракции составляет 30–60 мин. Количественное содержание ГКК рассчитывают с использованием градуировочных графиков СО [2][5] или значений удельного показателя поглощения ГКК [6].

Для разделения индивидуальных ГКК применяется также прием предварительной очистки суммы ГКК от других сопутствующих соединений. Так, согласно ФС.2.5.0055.15 «Эхинацеи пурпурной трава» (Echinaceae purpureae herba) Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV изд. сумму ГКК экстрагируют из сухого сырья спиртом этиловым 95% в присутствии щавелевой кислоты при нагревании на магнитной мешалке в течение 45 мин. Для отделения ГКК от сопутствующих соединений применяют фильтровальную бумагу, хроматографируют восходящим методом в хлороформе. После окончания процесса хроматографирования участки бумаги на линии старта вырезают, помещают в колбу и экстрагируют 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты. Содержание суммы фенилпропаноидов вычисляют, используя удельный показатель поглощения СО цикориевой кислоты при 328 нм, равный 782.

По аналогичной методике определена сумма ГКК в извлечении из травы синюхи голубой (Polemonium caeruleum L.) после очистки извлечения от сопутствующих соединений методом БХ и ТСХ. Содержание суммы ГКК в траве синюхи голубой составляет 1% в пересчете на цикориевую кислоту [7]. Таким же образом была определена сумма фенолкарбоновых кислот в траве гравилата городского (Geum urbanum L.), которая в пересчете на хлорогеновую кислоту составила 0,7% [8].

Метод хромато-СФМ является довольно трудоемким и времязатратным из-за многочисленных операций пробоподготовки, связанных с получением извлечений, и последующим хроматографированием.

В последние годы вместо метода хромато-СФМ используют сочетание ТСХ с видеоденситометрической регистрацией аналитического сигнала (метод планарной хроматографии). Так, этот метод использован для идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в извлечении из корневищ с корнями любистока лекарственного (Levisticum officinale W.D.G. Koch.). Хроматографирование проведено на пластинках Sorbfil с использованием подвижной фазы: н-бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (5:4:1 об.:об.:об). Детектирующий реагент — пары аммиака. Хлорогеновая кислота проявляется в виде пятен темно-коричневого цвета с R_f⁴ (0,54±0,02). Хроматограммы обработаны с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil». Содержание хлорогеновой кислоты в корнях и корневищах любистка лекарственного составило 0,37% [9].

Метод экстракционной спектрофотометрии

Как было показано ранее, количественному определению суммы ГКК в извлечениях из растительного сырья методом прямой СФМ мешают другие производные фенола [10]. При этом наибольший вклад в поглощение полученных извлечений в УФ-области вносят флавоноиды. Для преодоления указанного недостатка в работе В.М. Косман с соавт. на примере модельной смеси рутина с кофейной кислотой предложена избирательная экстракция ГКК этилацетатом. Показано, что при рН 2 ГКК экстрагируются этилацетатом до 85%, а в водной фазе остается до 85% рутина [11].

Считая данные условия оптимальными для разделения ГКК и флавоноидов, М.С. Ларькина и соавт. при изучении динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) получали суммарное водно-спиртовое извлечение, которое затем упаривали до водного остатка и при рН водной фазы, равном 2, извлекали ГКК этилацетатом. Проведенная сравнительная оценка результатов количественного определения суммы ГКК в пересчете на кофейную кислоту методами прямой и экстракционной СФМ (экстрагент — спирт этиловый 70%) показала, что содержание суммы ГКК в надземной части василька шероховатого составляет, соответственно, 4,9±0,5 и 1,6±0,5% [12]. Очевидно, что данный метод приемлем для анализа ГКК в присутствии гидрофильных флавоноидов, таких как рутин. Вполне возможно, что в предлагаемых условиях нерастворимые в воде флавоноиды будут также хорошо экстрагироваться этилацетатом.

Е.Г. Санниковой с соавт. подобная методика использована для определения суммы ГКК в побегах и коре ивы трехтычинковой (Salix triandra L.) и ивы белой (Salix alba L.), в коре ивы пурпурной (Salix purpurea L.). Содержание суммы ГКК пересчитывали на доминирующий компонент (табл. 2) [13][14].

Методом экстракционной СФМ при 325 нм определена сумма ГКК в пересчете на кофейную кислоту в листьях 4 видов рода Rhododendron подсекции Rhodorastra. Содержание ГКК составило 0,5–1,0% [15].

Описанный метод не получил широкого распространения, поскольку многостадиен, достаточно длителен, требует использования токсического растворителя и характеризуется значительной потерей определяемых веществ [15].

Расчетный метод спектрофотометрического определения

Расчетный метод (метод Фирордта) использован для определения суммарного содержания флавоноидов, ГКК и изофлавоноидов в одной навеске травы стальника посевного (Ononis arvensis L.). Для исключения влияния поглощения флавоноидов при определении суммы ГКК в растительном сырье А.М. Сампиев и соавт. исходили из принципа аддитивности суммы оптических плотностей БАС при АДВ. Разработанная методика включает использование методов дифференциальной спектрофотометрии для определения суммы флавоноидов по реакции комплексообразования с алюминия(III) хлоридом в пересчете на доминирующий флавоноид и прямой СФМ для суммы ГКК при длине волны 325 нм. С этой целью авторы рассчитывали предполагаемую оптическую плотность флавоноидов при длине волны 325 нм по предварительно определенному содержанию суммы флавоноидов в сырье и удельному показателю поглощения СО флавоноида при 325 нм. Аналогичным образом расчетный метод использован и для определения содержания изофлавоноидов при длине волны 260 нм. Предварительно были рассчитаны значения удельных показателей поглощения соответствующих СО флавоноидов, ГКК и изофлавоноидов при всех АДВ [16].

Расчетным способом определено количественное содержание суммы ГКК столбиков с рыльцами кукурузы (Zea mays L.) и травы посконника конопляного (Eupatorium cannabinum L.). Сумма ГКК (хлорогеновая, феруловая, кофейная) в кукурузных рыльцах составила 1,96 [17] и 3,85% [18]; в траве посконника конопляного — 2,22%⁵.

На наш взгляд, описанный подход к анализу содержания ГКК в растительном сырье имеет недостатки. В частности, достоверный результат может быть получен только в том случае, если известно, что растительное сырье содержит только флавоноиды, способные вступать в реакцию комплексообразования с алюминия(III) хлоридом. Если в растительном сырье содержатся флавоноиды, которые не взаимодействуют с данным реактивом, рассчитанное содержание ГКК будет иметь некорректное значение. Кроме того, для выполнения анализа необходимо наличие СО флавоноида, на который ведется пересчет количественного содержания, или рассчитанное значение удельного показателя поглощения СО в максимуме поглощения ГКК.

Метод спектрофотометрии с использованием реактива Арнова

Для исключения влияния сопутствующих соединений на результаты количественного определения ГКК в извлечениях из растительного сырья некоторые авторы использовали СФМ определение после химической модификации извлечений [1]. Для определения ГКК в растительном сырье применяется метод, основанный на реакции фенольных соединений с реактивом Арнова (10,0 г молибдата натрия, 10,0 г нитрита натрия в 100,0 мл воды). Общее содержание ГКК устанавливают по продуктам их окисления в области 490–550 нм.

В Европейской фармакопее и ГФ РБ⁶, а также в некоторых научных работах [19–25] описано применение реактива Арнова для определения суммы фенолкарбоновых кислот. В исследованиях Ю.А. Старчак⁷ данный реактив использован при разработке методики дифференциальной СФМ для количественного определения ГКК в растениях рода тимьян (Thymus). С этой целью параллельно измеряют оптическую плотность продуктов реакции ГКК в извлечениях из растительного сырья и СО розмариновой кислоты с реактивом Арнова при длине волны 505 нм (метод дифференциальной СФМ). Для расчетов количественного содержания ГКК используют величину удельного показателя поглощения продукта реакции СО розмариновой кислоты с указанными реактивами (равен 400). Выбор СО и АДВ обусловлен совпадением максимумов спектров поглощения продуктов взаимодействия ГКК спиртовых извлечений из травы растений рода тимьян и раствора СО розмариновой кислоты с реактивом Арнова при длине волны 505 нм [19]. Одновременно определена сумма ГКК в извлечении из растений рода тимьян методом прямой СФМ (табл. 3).

Содержание суммы ГКК, определенное методом прямой СФМ, составляет 3,27–10,83%. Метод дифференциальной СФМ по реакции с реактивом Арнова показывает значительно меньшее содержание суммы ГКК (1,04–6,34%) в тех же объектах. Авторы методики отмечают расхождение в результатах, что связано с низкой избирательностью методики прямой СФМ. Суммарное поглощение в этой области спектра объясняется содержанием в растениях не только ГКК, но и других фенольных соединений, в частности флавоноидов [19].

Эти исследования подтверждают рациональность включенного в Европейскую фармакопею⁹ количественного определения суммы ГКК в растениях СФМ с молибдатом натрия и нитритом натрия.

Согласно ГФ РБ¹⁰ одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) корни стандартизуют по сумме ГКК с пересчетом на кофейную кислоту методом СФМ по реакции с реактивом Арнова после экстракции ГКК водой. Для поиска более эффективных экстрагентов ГКК из данного сырья были использованы вода, органические растворители (этанол, пропанол-1, ацетон, диметилсульфоксид) и их водные растворы с объемными долями 20; 40; 60 и 80%. Содержание ГКК определяли в пересчете на хлорогеновую кислоту согласно изложенной в ГФ РБ СФМ-методике. Установлено, что водно-органические экстрагенты извлекают ГКК из этого сырья в 2–4 раза эффективнее, чем фармакопейный экстрагент — вода. Так, среднее содержание ГКК при экстракции 60% пропанолом-1 составило 0,796%; 60% диметилсульфоксидом — 0,553%; 60% ацетоном — 0,422%; 40% этанолом — 0,345% и водой — 0,204% [20].

Влияние предварительной ультразвуковой обработки сырья и ультразвуковой экстракции в течение различных промежутков времени на содержание ГКК в извлечениях из корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) изучалось также методом СФМ с использованием реакции с реактивом Арнова. Показано, что оптимальное время ультразвуковой экстракции составляет 15 мин. Увеличение продолжительности ультразвуковой обработки исходного сырья или экстракции снижает содержание ГКК в 1,7–2,5 и 1,1–2,2 раза соответственно [21].

Как отмечается в работе [22], применение дополнительных технологий при пробоподготовке позволяет получить серьезные преимущества: сократить время экстракции, увеличить выход экстрагируемых компонентов и снизить расход растворителя. Ультразвуковая экстракция — метод достаточно дешевый и требующий минимального аппаратурного оформления — начинает все чаще использоваться для выделения БАС из растительного сырья.

При количественном определении методом СФМ по реакции с реактивом Арнова содержание суммы ГКК в извлечениях из травы яснотки белой (Lamium album L.) и яснотки крапчатой (Lamium maculatum L.) составило от 2 до 4% в пересчете на хлорогеновую кислоту [23]. Реактив Арнова использован и для количественного определения ГКК в пересчете на хлорогеновую кислоту в траве четырех видов растений рода бодяк: бодяк болотный (Cirsium palustre (L.) Scop.), бодяк серый (Cirsium canum (L.) All.), бодяк огородный (Cirsium oleraceum (L.) Scop.) и бодяк обыкновенный (Cirsium vulgare (Savi) Ten.). Установлено, что наибольшее количество ГКК содержит бодяк огородный (Cirsium oleraceum (L.) Scop.) — 0,8% [24].

В.А. Костиковой и Т.Н. Веклич с помощью СФМ-метода с реактивом Арнова исследовано содержание фенолкарбоновых кислот в листьях и соцветиях спиреи иволистной (Spiraea salicifolia L.), произрастающей на территории Сибири и Дальнего Востока России. Выявлено, что концентрация фенолкарбоновых кислот в листьях (3,59–7,69%) выше, чем в соцветиях (2,24–5,52%) вне зависимости от территории произрастания растений [25].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для количественного определения ГКК и других полифенольных соединений в растениях, произрастающих или культивируемых на территории Российской Федерации, широко используются различные варианты СФМ. Объектом исследования в основном является надземная часть растений. Для исключения влияния других сопутствующих БАС, в том числе полифенолов, используются несколько методов. Метод хромато-СФМ позволяет получать более достоверные результаты количественного определения ГКК, чем прямая СФМ, однако он длителен и многостадиен и, возможно, вследствие этого не обладает высокой точностью. Другой альтернативой методу прямой СФМ может являться метод экстракционной СФМ, который позволяет отделять ГКК от сопутствующих ингредиентов фенольной структуры, в частности флавоноидов. Данный метод также длителен и многостадиен, требует использования токсического растворителя. Поэтому описанные методы в настоящее время не получили широкого распространения.

Для количественного определения ГКК в растительном сырье методом СФМ при наличии сопутствующих полифенольных соединений перспективно использование расчетных способов. Такие методики позволяют математическими способами вычленять из суммарного поглощения БАС поглощение соответствующих групп действующих веществ и рассчитывать их количественное содержание в пересчете на СО соединений соответствующего класса. Это позволяет упростить процедуру количественного определения за счет исключения операций по разделению БАС.

Другой способ повысить селективность количественного определения ГКК методом СФМ при содержании в растительных объектах суммы фенольных соединений основан на их способности окисляться реактивом Арнова, доступным и простым в изготовлении.

Таким образом, для анализа содержания ГКК могут быть использованы различные варианты СФМ, которые доступны и относительно просты в исполнении. В то же время не все эти методы имеют достаточную селективность для количественного определения ГКК в присутствии других полифенольных соединений, что свидетельствует о необходимости дальнейшего совершенствования методик количественного определения ГКК в растительном сырье.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.В. Компанцева — существенный вклад в концепцию и дизайн статьи; сбор, анализ литературы, утверждение окончательного варианта статьи для публикации; А.С. Саушкина — написание текста и критический пересмотр его содержания, утверждение окончательного варианта статьи для публикации; А.Ю. Айрапетова — сбор, анализ литературы, редактирование текста рукописи, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

Authors’ contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Eugenia V. Kompantseva made a significant contribution to the study concept and design, collected and analysed literature, approved the final version of the manuscript for publication. Anna S. Saushkina drafted the manuscript and critically revised its content, and approved the final version of the manuscript for publication. Asya Yu. Ayrapetova collected and analysed literature, edited the manuscript, approved the final version of the manuscript for publication.