Анализ требований к проведению исследований ингаляционной токсичности химических веществ

Введение

Исследования токсичности химических веществ, поступающих в организм ингаляционным путем, проводятся в различных сферах деятельности человека для установления предельно допустимых концентраций (ПДК) веществ в воздухе при строительстве и эксплуатации производственных, жилых помещений и транспорта, при оценке профессиональных рисков для здоровья работников, а также при исследовании токсичности лекарственных средств. Проведение таких исследований сопряжено с рядом трудностей, связанных с особенностями планирования эксперимента и выбором способа введения химического вещества лабораторным животным (интраназально — только через слизистую носа, эндотрахеально — минуя верхние дыхательные пути, ингаляционно — только через нос или только через голову, либо путем воздействия на всю поверхность тела в камерах), а также с выбором установок для ингаляционного введения, поддерживающих статический или динамический способ ингаляции.

В фармацевтической отрасли ингаляционный путь введения препаратов является относительно новым, особенно для биотехнологических лекарственных препаратов, которые также могут применяться ингаляционно [1, 2]. Сложности в планировании и проведении исследований влекут за собой несоответствия в трактовке терминов и определений, а также в интерпретации результатов. Например, существуют расхождения в наименовании исследований токсичности в зависимости от их продолжительности. В США и странах Европейского союза придерживаются следующей классификации: до 28 сут включительно — подострая токсичность; 29–90 сут (3 мес.) — субхроническая токсичность; свыше 3 мес. — хроническая токсичность. В России же используется другая классификация: исследования продолжительностью менее 28 сут — субхроническая токсичность; свыше 28 сут — хроническая. Различия в терминологии могут вводить в заблуждение относительно истинной продолжительности исследования при планировании экспериментов, в также при анализе научной литературы [2].

Для обеспечения достоверности результатов доклинических исследований лекарственных средств и для гармонизации отечественных требований с международными, в первую очередь с изложенными в документах Организации экономического сотрудничества и развития (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD), в Российской Федерации как национальный стандарт с 1 марта 2010 г. утверждены правила надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, GLP)¹. Однако в реестре Росаккредитации на сегодняшний день зарегистрировано только 14 испытательных лабораторий, работающих в соответствии с методическими рекомендациями OECD².

Цель работы — анализ практики применения нормативных требований к проведению доклинических исследований токсичности химических веществ при их ингаляционном введении.

Нормативные правовые акты

Исследования острой, подострой, субхронической и хронической токсичности при ингаляционном введении в лабораториях, аккредитованных по GLP, проводятся в соответствии с протоколами OECD³ № 403, 412, 413 и 452 соответственно. В Российской Федерации аналогичные требования к проведению этих видов исследований изложены в межгосударственных стандартах, которые действуют в странах Евразийского экономического союза, а также в Таджикистане и Молдове, что определяет возможность дальнейшего экспорта и импорта продукции:

1) ГОСТ 32542-2013⁴ используют при проведе-
нии испытаний химической продукции для количественной оценки риска в соответствии с согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки химических веществ (СГС)⁵;

2) ГОСТ 32643-2020⁶ и ГОСТ 32636-2020⁷ используют для определения токсичности исследуемого химического вещества при ингаляционном поступлении в организм в результате повторного воздействия продолжительностью 28 и 90 сут соответственно, а также для количественной оценки риска при вдыхании газов, паров и аэрозолей наноматериалов;

3) ГОСТ 32383-2013⁸ используют для определения максимальной дозы, не вызывающей явного нежелательного эффекта (no-observed-adverse-effect level, NOAEL), что может быть использовано для установления критерия безопасности исследуемого вещества для человека (рекомендуется проведение комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности);

4) ГОСТ 32646-2014⁹ используют в качестве дополнения к ГОСТ 32542-2013 при проведении частных процедур тестирования газов, паров и аэрозолей.

Пересмотр указанных стандартов и внесение в них изменений были связаны с необходимостью проведения испытаний аэрозольных частиц, включая наноматериалы. Исследования токсичности наноматериалов в Российской Федерации регламентированы ГОСТ 32643-2020, ГОСТ 32636-2020 и ГОСТ Р ИСО 10808-2015¹⁰.

Практика применения требований нормативных документов при проведении исследований

Результаты анализа научной литературы за последние 5 лет показали, что на территории Российской Федерации проводится малое количество исследований ингаляционной токсичности согласно принятым ГОСТ [3–5]. Большинство отечественных авторов планируют и проводят эксперименты, не используя принятые в Российской Федерации рекомендации [6–8]. Это может быть связано со сложностями при введении паров, газов и аэрозолей, при выборе способа введения и типа ингаляционной камеры, а также при валидации метода. По этой причине в России встречаются исследования с использованием в качестве альтернативного способа эндотрахеального введения химических веществ как наиболее просто осуществимого при отсутствии специальной ингаляционной техники. Однако данный метод введения, используемый для суспензий или относительно крупнодисперсных аэрозолей, не в полной мере отражает естественный процесс поступления веществ в организм через органы дыхания и может использоваться только на предварительной стадии исследований [9]. При этом в странах OECD большинство исследований ингаляционной токсичности, несмотря на сложность таких исследований, выполняется в соответствии с принятыми стандартами [10–13].

Основные принципы проведения исследований ингаляционной токсичности, особенности метода и детальное описание процедуры представлены в ГОСТ 32542-2013. Согласно этому документу исследование рекомендуется проводить на молодых здоровых линейных крысах. Допустимо использовать другие виды животных при обосновании их выбора. Важным этапом при изучении острой токсичности является выбор вида исследования: традиционный протокол, согласно которому группы животных подвергаются воздействию вещества в предельной концентрации, и протокол Концентрация×Время (протокол C×t). Выбор вида исследования зависит от его целей. Так, согласно традиционному протоколу группы животных подвергают воздействию вещества в предельной концентрации или в серии концентраций поэтапно в заранее установленный, составляющий менее 24 ч промежуток времени, в камерах, предназначенных для воздействия через всю поверхность тела. Протокол C×t применяют для оценки токсичности вещества в одной концентрации (тест на предельно допустимую концентрацию) или в серии концентраций при различной продолжительности эксперимента. Такой подход позволяет воздействовать на животных веществом в различных концентрациях. Испытания данного вида проводят в камере, предназначенной для воздействия через нос (голову)¹¹.

Для обеспечения воздействия исследуемого вещества на все важные области трахеобронхиального дерева необходимо определить размер частиц аэрозолей и паров, которые могут конденсироваться и превращаться в аэрозоль. Рекомендуется использование аэрозоля с масс-медианным аэродинамическим диаметром (mass median aerodynamic diameter, MMAD) частиц в диапазоне от 1 до 4 мкм с геометрическим стандартным отклонением (geometric standard deviation, GSD) в диапазоне от 1,5 до 3,0.

При изучении острой токсичности опираются на получение данных фактической (аналитической) концентрации, которая представляет собой количество исследуемого препарата в зоне дыхания животного в ингаляционной камере. Эту концентрацию определяют, используя адсорбционный и химический методы, метод непосредственной оценки, а также неспецифические методы (гравиметрический, капельный анализ). Указанный в документе гранулометрический состав аэрозолей должен определяться не менее двух раз за 4 ч выдержки при помощи каскадного импактора или другого инструмента (например, аэродинамического спектрометра)¹².

Перед основным исследованием острой токсичности проводят предварительное исследование, результаты которого используют для оценки эффективности изучаемого препарата и выбора уровня концентрации для экспозиции. Далее проводят поэтапное исследование по протоколу C×t.

В отличие от отечественных стандартов тесты OECD № 412, 413 и 452 содержат более детальные указания по проведению исследования, включающие измерение массы тела лабораторных животных, учет потребления ими пищи и воды, оценку функции легких, изучение особенностей возникающей патологии, проведение бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), офтальмологического исследования, макроскопии органов и тканей, гистологического исследования.

Исследования подострой, субхронической и хронической токсичности не предполагают использования различных видов протоколов, из-за чего возникает проблема выбора модели экспозиции и типа ингаляционных камер. По умолчанию в этих исследованиях должна использоваться интраназальная модель. Такой метод предпочтителен для изучения жидких и твердых аэрозолей и паров, которые могут конденсироваться в форме аэрозолей. При этом допускается воздействие через всю поверхность тела лабораторного животного с последующим обоснованием использования этого метода в отчете исследования. Выбор ингаляционных камер зависит от эксперимента, например при проведении исследования по изучению подострой токсичности должны использоваться динамические ингаляционные камеры. Использование статических камер, в которых отсутствует воздушный поток, не допускается¹³.

Сравнительный анализ действующих рекомендаций по проведению исследований различных видов ингаляционной токсичности представлен в таблице 1. При пересмотре документов было рекомендовано соблюдать новые нормативы для возможности проведения исследования аэрозолей с частицами нанодиапазона и повышения способности к осаждению исследуемого вещества в легких: MMAD частиц должен быть не более 2 мкм, а GSD — от 1 до 3 (табл. 1).

Также при пересмотре ГОСТ 32643-2020 и ГОСТ 32636-2020 были учтены принципы гуманного обращения с животным. Рекомендовано при планировании исследования отдавать предпочтение тем вариантам процедуры, которые предполагают использование минимального количества животных.

В публикациях [14–16] отражены изменения, произошедшие при пересмотре тестов OECD № 412 и 413, касающиеся общего плана проведения исследования и агрегатного состояния исследуемого вещества (газ, пар, жидкий аэрозоль или твердый аэрозоль). Отмечены особенности организации исследования, в том числе введение новых стандартных операционных процедур, проведение бронхоальвеолярного анализа жидкости, измерение нагрузки на легкие, измерение MMAD, а также измерение размера частиц в реальном времени, контроль концентрации наноразмерного материала в камере ингаляционного воздействия. Авторы отметили, что введение новых правил для оценки тяжести воспаления легких и легочной нагрузки противоречит политике OECD, и предлагают пересмотреть новые требования. По новым правилам изучение состава жидкости, полученной в результате проведения БАЛ, для всех исследуемых химических веществ следует выполнять путем разделения легких для гистопатологии и БАЛ. Для измерения легочной нагрузки должно исследоваться целое легкое, что подразумевает введение в эксперимент дополнительных животных. В результате количество животных в тесте № 412 увеличивается с 40 до 120, а в тесте № 413 — с 80 до 160. Использование большего количества животных требует обновления или добавления еще одной ингаляционной камеры, портов для экспонирования, увеличивает стоимость исследования и противоречит принципам гуманного обращения с животными. По результатам анализа авторами была представлена схема проведения исследования легких, учитывающая анатомические особенности лабораторных крыс и позволяющая снижать количество животных при изучении токсичности. Для проведения гистоморфологических исследований и оценки результатов БАЛ предложено извлекать правое легкое, а доля левого легкого может использоваться для измерения легочной нагрузки. Данная схема была проверена в исследованиях с растворимыми наночастицами серебра и нерастворимыми наночастицами золота. Было показано, что наночастицы равномерно распределялись в долях легких крыс [14–16].

Различия способов интерпретации результатов исследования ингаляционной токсичности химического вещества для грызунов согласно документам OECD представлены в таблице 2. Следует отметить, что большое значение в протоколах уделено анализу пригодности частиц для вдыхания, полученной аналитической концентрации и анализу вероятного механизма действия исследуемого вещества.

Проведение теста OECD № 452 позволяет получить данные о профиле токсичности исследуемого вещества у животных, которые можно использовать в качестве предварительной оценки его безопасности для человека. Кроме того, на основании полученных данных могут быть инициированы дополнительные исследования репродуктивной токсичности, иммунотоксичности, нейротоксичности или канцерогенности. Следует учитывать, что при прогнозировании результатов воздействия исследуемого вещества на человека необходимо учитывать межвидовую изменчивость и возможное отсутствие релевантности. Протокол исследования № 452 достаточно длителен и трудоемок для выполнения, но содержит допущение о сокращении срока исследования до шести или девяти месяцев, что регламентируется целями и задачами исследования. В случае сокращения срока исследования необходимо предоставить обоснование необходимости такого сокращения.

Европейское партнерство по альтернативным подходам к тестированию на животных (European Partnership for Alternative Approaches to Animal Testing, EPAA) совместно с Межведомственным центром по оценке альтернативных токсикологических методов (NTP (National Toxicology Program) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, NICEATM) проводит семинары, посвященные исследованиям ингаляционной токсичности наноматериалов и острой системной токсичности, рассматривает текущие методы тестирования острой токсичности, а также подходы, которые помогут сократить и (или) заменить исследования острой ингаляционной токсичности у млекопитающих²⁰ [17].

Исследования острой ингаляционной токсичности проводятся только на крысах или мышах в соответствии с рекомендациями OECD, тесты № 403 и 433. Результаты этих тестов могут оказаться необъективными из-за различия строения и функционировании дыхательных путей у различных видов животных, что затрудняет выводы о потенциальной опасности вдыхаемых соединений для человека. На сегодняшний день не существует альтернативной модели in vitro, которая могла бы быть принятой регуляторными органами для замены исследования ингаляционной токсичности на животных. В руководстве EPAА указано, что NOAEL, полученная для исследуемого вещества в других исследованиях, должна быть скорректирована для проведения исследований ингаляционной токсичности до эквивалентной концентрации с учетом данных об анатомических и видовых различиях, например минутного объема дыхания, частоты дыхания и др. [18].

Для изучения местного токсического действия при ингаляционном введении важны следующие параметры: характер оседания исследуемого вещества на поверхности органов дыхания и пути его выведения из организма. С одной стороны, осаждение вдыхаемых веществ зависит от динамики воздушного потока, которая различна у животных и человека из-за анатомических различий как верхних, так и нижних дыхательных путей. С другой стороны, на клиренс вещества влияют объем тканей, типы клеток, состав и распределение слизи, биохимические механизмы активации дыхательных путей и ферментозависимые процессы.

Легкие крысы имеют моноподиальный характер ветвления дыхательных путей, тогда как у человека имеют симметричное разветвление. Таким образом, у человека в области бифуркации трахеи происходит скопление частиц исследуемого вещества, что невозможно воспроизвести на моделях грызунов. Кроме того, диаметр дыхательных путей у крысы меньше, чем у человека. В результате вдыхание нерастворимого твердого аэрозоля может приводить к закупорке дыхательных путей крыс и, как следствие, к гибели самих животных при исследовании препарата в высоких дозах, даже если соединение не токсично для человека.

Опубликованы результаты использования двух альтернативных методов in vitro, подходящих для определения острой ингаляционной токсичности. Первая тест-система представляет собой 3D-модель мукоцилиарной ткани in vitro — EpiAirway^TM, состоящую из нормальных человеческих эпителиальных клеток трахеи/бронхов, культивируемых на границе раздела воздух–жидкость (air–liquid interface, ALI). Модель, воспроизводящая характерную для человека структуру ткани и клеточную морфологию и имеющая высокую однородность, состоит из базальных эпителиальных клеток, структурированных при помощи кератина 5⁺, бокаловидных клеток, продуцирующих слизь, функциональных плотных соединений и пульсирующих ресничек²¹ [19]. Подтверждение чувствительности тест-системы было показано при ее использовании для прогнозирования токсичности 59 химических веществ. Предварительно класс токсичности этих веществ был определен в исследованиях на животных. Использование модели EpiAirway^TM позволило идентифицировать химические вещества, относящиеся к I–II классам токсичности по СГС с чувствительностью 100% и специфичностью 43,1% [20]. Согласно данным поисковой базы PubMed за последние 5 лет, авторы исследований широко применяли модель EpiAirway^TM для скрининга лекарственных средств, проявляющих активность против вируса SARS-CoV-2, однако полученные результаты требовали подтверждения в дополнительных исследованиях [21–23]. Так, например, была показана эффективность митоксантрона для ингибирования инфекции SARS-CoV-2 с дозозависимым снижением вирусной нагрузки как через 24 ч, так и через 96 ч после инфицирования [24].

Другая тест-система in vitro представляет собой органотипическую модель ткани первичных трахеобронхиальных эпителиальных клеток человека (normal human bronchial epithelial cells, NHBE), имеющих in vivo подобную структуру и функции. Данная тест-система формируется in situ путем дифференцировки клеток NHBE на границе ALI, созданной на полупроницаемой мембранной подложке (например, Transwell®, Millipore®, Millicell®). Апикальная поверхность культуры ALI подвергается воздействию окружающего воздуха, который насыщает кислородом эпителиальные клетки и способствует клеточной дифференцировке. В этих двухфазных условиях культивирования клетки NHBE пролиферируют и дифференцируются в поляризованную псевдомногослойную тканеподобную структуру, напоминающую эпителий дыхательных путей, с реснитчатыми клетками, перемежающимися бокаловидными клетками, обращенными к апикальной стороне, и базальными клетками, распространяющимися вдоль базолатеральной мембраны. Наличие обращенной к воздуху поверхности позволяет проводить исследования in vitro, имитирующие воздействие на органы человека. Однако этот метод требует дальнейшей стандартизации и валидации [25].

В работе [26] использование тест-системы in vitro было предложено при исследовании фиброза легкого, вызванного воздействием многослойными углеродными нанотрубками. Использование этой модели имело ряд преимуществ: имитировало легкое человека, позволяло упростить расчет дозы, а также проводить параллельное тестирование сокультур для оценки сопоставимости результатов. Метод ALI рассматривается регуляторными органами для использования в практике доклинических исследований, и данная тест-система, возможно, будет применяться наряду с обязательным 90-дневным исследованием ингаляционной токсичности. В результате можно будет осуществлять оценку фибриногенного потенциала исследуемых наночастиц с использованием двух тест-систем in vitro и in vivo [26].

Сравнение трех тест-систем (ALI, клеточная линия альвеолярного эпителия человека (A549) и мышиные макрофаги) проводили на образцах газообразных выбросов при сжигании древесины. Было показано, что воздействие аэрозолей in vitro и in vivo вызывало противоположный порядок повреждений ДНК. Опыты in vitro являлись более чувствительными тест-системами. При их использовании было выявлено, что газообразная фракция выбрасываемых аэрозолей вызывала неблагоприятные токсические эффекты. Однако авторами поддерживается проведение параллельных экспериментов in vitro и in vivo для оценки сопоставимости результатов исследования аэрозолей, при этом предпочтение отдается альтернативным клеточным методам [27].

Таким образом, в настоящее время для исследования ингаляционной токсичности успешно применяют методы in vitro, однако используемые тест-системы еще не приняты регуляторными органами для полной замены исследований на животных.

Заключение

Проведенный анализ основных нормативных правовых документов по исследованию острой, подострой и хронической ингаляционной токсичности показал, что данные документы основаны на риск-ориентированном подходе, подразумевающем количественную оценку риска, связанного с воздействием на организм химических веществ при их вдыхании. При этом в отечественных стандартах не уделяется внимание вопросу расчета экспозиционных и поглощенных доз для газов, паров и аэрозолей, что необходимо для оценки эффективности лекарственных препаратов при обосновании выбора подходящего для медицинского применения ингалятора.

Основной задачей исследования токсичности химических веществ при ингаляционном введении является определение предельной концентрации химического вещества, токсичной для грызунов, согласно традиционному протоколу, а также протоколу Концентрация×Время (C×t), позволяющему оценить среднюю летальную концентрацию (LC₅₀) и нелетальную пороговую концентрацию (LC₀₁) вещества. Протокол C×t позволяет проводить количественную оценку риска и определять класс токсичности в соответствии с согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки химических веществ.

Отмечено, что предпочтительным объектом исследований во всех рассмотренных нормативных правовых документах определены крысы/мыши, которые имеют анатомические различия с человеком. При этом класс токсичности вещества определяют у грызунов без переноса дозовой зависимости на человека. Изучение хронической токсичности по ГОСТ 32383-2013 позволяет оценить значимое влияние исследуемого вещества на человека, однако процедура исследования является трудозатратной и длительной (продолжительность 12 мес.). В качестве альтернативы исследованиям на животных разрабатываются и валидируются методы in vitrо, которые требуют рассмотрения и утверждения регуляторными органами.