Опыт проведения валидации in vitro методики оценки инсулинозависимого захвата глюкозы

Согласно требованиям нормативных документов, как российских, так и международных, методики, применяющиеся при исследовании биоэквивалентности, сопоставимости показателей качества биотехнологических (биологических) препаратов, выпускающем контроле качества лекарственных препаратов и прочих не менее важных in vitro исследованиях, должны быть валидированы. Для этих исследований in vitro используют тесты на связывание молекулы с рецептором   и на биологическую активность препаратов. Однако в настоящее время не существует единого подхода к валидации биоаналитических методик in vitro, не связанных с определением концентрации действующего вещества в биологических жидкостях. Цель работы: валидировать методику оценки инсулинозависимого захвата глюкозы и доказать пригодность набора ГЛЮКОЗА GOD-PAP для определения глюкозы в культуральной среде. Материалы и методы: в исследовании использовали препараты производства ОАО «ГЕРОФАРМ» РинФаст® и плацебо  к инсулину аспарт, клеточную линию миобластов крысы L6J1, набор ГЛЮКОЗА GOD-PAP для определения концентрации глюкозы.  Исследование  проводили на дифференцированных клетках, которые культивировали в течение 7 сут. Для дифференцировки L6J1 использовали питательную среду DMEM с содержанием глюкозы 4,5 г/л и 2% сыворотки лошадиной. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения Prism 9. Результаты: продемонстрированы показатели специфичности методики; в максимальной концентрации препарат отличается от плацебо в 4 раза по остаточному уровню глюкозы в культуральной среде. Определена прецизионность методики: сходимость составила 4–9%, внутрилабораторная прецизионность 11–16%. Коэффициент вариации устойчивости методики составил 14% в 4 независимых экспериментах в 9 аналитических сериях. Проведено сравнение инсулиновых продуктов (инсулин аспарт и генно-инженерный инсулин человека), для которых показатели концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) различались в 1,5 раза. Для набора ГЛЮКОЗА GOD-PAP коэффициент детерминации линейной регрессии составил 0,9983; чувствительность — 1 ммоль/л, диапазон правильности — 95–107%. Выводы: можно утверждать, что методика является специфичной, высокопрецизионной и устойчивой для проведения оценки инсулинозависимого захвата глюкозы с использованием клеточной линии миобластов крысы L6J1 в качестве тест-системы и является пригодной для детектирования биологической активности препаратов инсулина в in vitro исследованиях.

1. Yaffe D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1968;61(2):477–83. https://doi.org/10.1073/pnas.61.2.477

2. Mandel JL, Pearson ML. Insulin stimulates myogenesis in a rat myoblast line. Nature. 1974;251(5476):618– 20. https://doi.org/10.1038/251618a0

3. Jacobs FA, Bird RC, Sells BH. Differentiation of rat myoblasts. Regulation of turnover of ribosomal proteins and their mRNAs. Eur J Biochem. 1985;150(2):255–63. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1985.tb09015.x

4. Portiér GL, Benders AG, Oosterhof A, Veerkamp JH, van Kuppevelt TH. Differentiation markers of mouse C2C12 and rat L6 myogenic cell lines and the effect of the differentiation medium. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999;35(4):219–27. https://doi.org/10.1007/s11626-999-0030-8

5. Alvim RO, Cheuhen MR, Machado SR, Sousa AGP, Santos PCJL. General aspects of muscle glucose uptake. An Acad Bras Cienc. 2015;87(1):351–68. https://doi.org/10.1590/0001-3765201520140225

6. Goodyear LJ, King PA, Hirshman MF, Thompson CM, Horton ED, Horton ES. Contractile activity increases plasma membrane glucose transporters in absence of insulin. Am J Physiol. 1990;258(4 Pt 1):E667–72. https://doi.org/10.1152/ajpendo.1990.258.4.E667

7. Lee AD, Hansen PA, Holloszy JO. Wortmannin inhibits insulin-stimulated but not contraction-stimulated glucose transport activity in skeletal muscle. FEBS Lett. 1995;361(1):51–4. https://doi.org/10.1016/0014-5793(95)00147-2

8. Lund S, Holman GD, Schmitz O, Pedersen O. Contraction stimulates translocation of glucose transporter GLUT4 in skeletal muscle through a mechanism distinct from that of insulin. Proc Natl Acad Sci USA. 1995;92(13):5817–21. https://doi.org/10.1073/pnas.92.13.5817

9. Rothman DL, Magnusson I, Cline G, Gerard D, Kahn CR, Shulman RG, Shulman GI. Decreased muscle glucose transport/phosphorylation is an early defect in the pathogenesis of non-insulin-dependent diabetes mellitus. Proc Natl Acad Sci USA. 1995;92(4):983–7. https://doi.org/10.1073/pnas.92.4.983

10. Jiang S, Zhang Y, Yang Y, Huang Y, Ma G, Luo Y, et al. Glucose oxidase-instructed fluorescence amplification strategy for intracellular glucose detection. ACS Appl Mater Interfaces. 2019;11(11):10554–8. https://doi.org/10.1021/acsami.9b00010

11. Trinder P. Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system with a non-carcinogenic chromogen. J Clin Pathol. 1969;22(2):158–61. https://doi.org/10.1136/jcp.22.2.158