Алкалоиды термопсиса: обзор методов количественного определения

ВВЕДЕНИЕ

Трава термопсиса ланцетного (Thermopsis lanceolata R. Br.) широко применяется в медицине в качестве отхаркивающего средства [1][2]. Фармакологическая активность этого лекарственного растительного сырья (ЛРС) обусловлена комплексом биологически активных соединений, основную долю которых составляют хинолизидиновые алкалоиды. В траве термопсиса ланцетного, заготовленной в период с начала цветения до плодоношения, преобладающим алкалоидом является термопсин (N-метилцитизин), обусловливающий отхаркивающий эффект. Кроме термопсина в траве содержатся алкалоиды пахикарпин и анагирин, а также сапонины и дубильные вещества. Основным действующим веществом семян термопсиса ланцетного является алкалоид цитизин, применяемый в качестве средства для лечения табачной зависимости [3–5].

В Российской Федерации и ряде стран СНГ фармакопейным методом количественного определения суммы алкалоидов термопсиса остается титриметрия¹, которая, несмотря на свою доступность, обладает рядом существенных недостатков: не позволяет определять содержание индивидуальных алкалоидов, является трудоемким и длительным методом, имеет недостаточно высокую точность, требует использования большого количества токсичных органических растворителей. Фармакологическая активность и токсичность отдельных алкалоидов термопсиса значительно различаются, поэтому критически важны разработка и внедрение высокоселективных, точных и воспроизводимых инструментальных методик количественного определения содержания индивидуальных соединений, а не только контроля их суммы [6].

Цель работы — оценка перспективности применения отдельных аналитических методов для количественного определения индивидуальных алкалоидов термопсиса.

Для анализа, оценки и обоснования перспективы применения современных инструментальных методов количественного определения алкалоидов термопсиса осуществлялся поиск научной литературы с использованием библиографических баз данных eLIBRARY.RU, Scopus, с помощью поискового инструмента Google Scholar с 2020 г. по настоящее время по ключевым словам «Thermopsis lanceolata», «HPLC», «TLC», «thermopsine determination», «cytisine determination», «трава термопсиса ланцетного», «алкалоиды термопсиса».

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Характеристика лекарственного растительного сырья и препаратов термопсиса

Термопсис (Thermopsis sp.) — род многолетних травянистых растений (включает около 30 видов) с характерным внешним видом: прямые ветвистые многочисленные стебли; очередные тройчатые листья; желтые крупные цветки, собранные в верхушечные кисти. Цветение с апреля по май, плоды — бобы продолговато-эллиптической формы, созревают к началу августа [7][8]. Наиболее значимый в медицине вид — термопсис ланцетный (Thermopsis lanceolata R. Br.) [9][10], произрастает на территории Сибири, Дальнего Востока, Китая, Монголии [11]. Трава термопсиса ланцетного содержит хинолизидиновые алкалоиды, сесквитерпены, лигнаны, изофлавоны, птерокарпаны [12][13] и является официнальным ЛРС в Российской Федерации. Сырье заготавливают c начала цветения до появления плодов². Монографии на ЛРС термопсиса в ведущих мировых фармакопеях отсутствуют³.

Фармакологическая активность травы термопсиса ланцетного обусловлена комплексом хинолизидиновых алкалоидов, среди которых ключевую роль играют термопсин (основной маркер травы), цитизин (основной маркер семян), пахикарпин (D-спартеин), анагирин и метилцитизин [14]. Цитизин обладает выраженным рефлекторным действием на дыхательный центр (агонист никотиновых рецепторов) [15], а термопсин и пахикарпин оказывают прямое стимулирующее действие на гладкую мускулатуру бронхов, обеспечивая мощный отхаркивающий эффект.

На территории Российской Федерации зарегистрировано 5 лекарственных растительных препаратов на основе травы термопсиса ланцетного, выпускаемых более чем 10 производителями (табл. 1)⁴. Все зарегистрированные препараты относятся к фармакотерапевтической группе препаратов, применяемых при кашле и простудных заболеваниях (отхаркивающие средства).

Контроль качества травы термопсиса ланцетного

Стандартные методы контроля качества травы термопсиса ланцетного основываются на способности алкалоидов вступать в реакцию нейтрализации с кислотами с образованием солей. После экстракции из растительной матрицы и очистки от нейтральных и кислых примесей сумма алкалоидов количественно определяется измерением массы их нерастворимых комплексов (гравиметрия) либо методом кислотно-основного титрования (титриметрия).

Титриметрия является основным фармакопейным методом контроля качества травы термопсиса ланцетного, позволяющим определять содержание суммы алкалоидов в пересчете на термопсин. Основные этапы методики: экстракция (выделение и экстракция алкалоидов в органический слой), очистка (промывка хлороформного извлечения водным раствором аммиака с целью удаления веществ неалкалоидной природы, которые также могут быть оттитрованы щелочным титрантом, что приведет к завышению результата), отгонка растворителя и растворение полученного остатка в хлористоводородной кислоте (для перевода оснований алкалоидов в соли), обратное титрование (титрование избытка хлористоводородной кислоты раствором натрия гидроксида в присутствии метилового красного)⁵.

К основным преимуществам титриметрического определения можно отнести относительную простоту и доступность. Однако такой способ стандартизации является недостаточным в случае стандартизации ЛРС, морфологические группы которого содержат сильнодействующие биологически активные соединения с различающейся активностью и токсичностью.

Другим методом, используемым в анализе алкалоидов термопсиса, является спектрофотометрия (СФМ). Прямая спектрофотометрия позволяет количественно определить содержание цитизина и термопсина благодаря способности алкалоидов поглощать свет в ультрафиолетовой области спектра. Максимумы поглощения цитизина и термопсина близки: максимумы поглощения цитизина отмечены при длине волны 240–250 и 305–310 нм, а термопсин имеет сходный спектр с незначительными батохромными и гипсохромными сдвигами [16]. Для повышения селективности и чувствительности анализа применяются реакции алкалоидов с кислыми красителями (например, бромтимоловый синий) с образованием устойчивых окрашенных ион-ассоциатов, которые экстрагируются в органическую фазу [16]. Преимуществами СФМ можно назвать относительную простоту и быстроту анализа, доступность оборудования, высокую чувствительность. Недостатками, как и в титриметрии, является невозможность дифференциации индивидуальных соединений (определяют сумму алкалоидов), длительная пробоподготовка, наложение спектров других соединений и неспецифичность реакций с красителями. В современной лабораторной практике данный метод используется чаще в качестве экспресс-скрининга, а в арбитражном анализе предпочтение отдается хроматографическим методам, обеспечивающим необходимую селективность [17].

Для полноценной оценки качества, особенно с точки зрения стандартизации отдельных биологически активных веществ, классические методы анализа должны дополняться современными селективными инструментальными методами высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)⁶.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Метод основан на разделении сложной смеси компонентов экстракта термопсиса за счет их различной способности к сорбции на неподвижной фазе и десорбции подвижной фазой (системой растворителей). Идентификация термопсина и цитизина возможна благодаря их поглощению УФ-излучения и дальнейшей визуализации на пластинке с флуоресцентным индикатором в виде темных пятен на зеленом флуоресцирующем фоне. Для повышения специфичности в качестве раствора для обработки пластинки используется реактив Драгендорфа [18].

Для полуколичественного анализа применим метод высокоэффективной ТСХ с денситометрическим детектированием (ВЭТСХ-денситометрия). После хроматографического разделения и обработки пластинки реактивом Драгендорфа проводится сканирование в денситометре. Интенсивность сигнала (площадь пика) пропорциональна количеству вещества в зоне адсорбции, что позволяет оценить содержание цитизина или термопсина по калибровочному графику [19].

ТСХ представляет собой незаменимый скрининговый и качественный метод для стандартизации травы термопсиса [20]. Его ключевыми преимуществами являются наглядность и возможность прямого сравнения многих образцов. Для полуколичественного определения индивидуальных алкалоидов метод ТСХ-денситометрии представляется хорошей альтернативой ВЭЖХ, однако для арбитражного анализа и получения более точных и воспроизводимых результатов метод ВЭЖХ более предпочтителен.

Капиллярный электрофорез. Смесь алкалоидов разделяют за счет образования при подкислении положительных ионов, мигрирующих к катоду с разной скоростью в зависимости от размера частицы (молекулы), ее заряда и гидрофобности. Для проведения анализа не требуются дорогостоящие реактивы, скорость разделения составляет 15 мин [21]. Основными недостатками метода по сравнению с ВЭЖХ являются относительно низкая чувствительность и производительность, а также сложность проведения анализа при рутинном контроле.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — высокоспецифичный метод, основанный на реакции «антиген–антитело». В качестве антигена выступает молекула конкретного алкалоида (например, цитизина) [22][23]. Алкалоид конъюгируют с белком-носителем и иммунизируют животных для получения специфических антител. Специфические антитела, иммобилизованные на планшете, избирательно связывают только целевой алкалоид из образца. Связывание детектируется вторичными антителами, меченными ферментом (например, пероксидазой хрена), который катализирует окрашивание субстрата. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации определяемого алкалоида [24][25]. К преимуществам метода можно отнести высокую специфичность и чувствительность, к недостаткам — непригодность для анализа многокомпонентных смесей и высокую стоимость. Метод мог бы найти применение в научных лабораториях, проводящих узкоспециализированные исследования, например по изучению динамики накопления конкретного алкалоида в растении в ответ на различные воздействия без учета остальных компонентов смеси. Однако для стандартизации лекарственного растительного сырья метод малопригоден.

Высокоэффективная жидкостная хроматография основана на разделении компонентов сложной смеси за счет их взаимодействия с подвижной и неподвижной фазами при прохождении образца через хроматографическую колонку. В анализе алкалоидов, как правило, используется обращенно-фазовая ВЭЖХ [26]. После очистки от балластных веществ метод ВЭЖХ позволяет разделить и количественно определить основные алкалоиды травы и семян термопсиса (термопсин, пахикарпин, цитизин и др.), что является основным преимуществом метода [27]. Относительная погрешность метода, как правило, не превышает 2%. К преимуществам метода ВЭЖХ относят высокую чувствительность и возможность полной автоматизации. С использованием ВЭЖХ можно установить содержание не только суммы, но и основных индивидуальных алкалоидов (например, термопсина или цитизина), контролируя тем самым стабильность фармакологического действия лекарственных препаратов, содержащих лекарственное растительное сырье термопсиса. Метод ВЭЖХ используется в научной деятельности для поиска новых биологически активных соединений в термопсисе ланцетном и близкородственных видах [13][26–29].

Для наглядности информация о методах анализа алкалоидов травы термопсиса ланцетного представлена в таблице 2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Титриметрия может использоваться в фармакопейном анализе и рутинном контроле, но не обеспечивает полноценной оценки качества травы термопсиса ланцетного; методы ТСХ и СФМ применимы в экспресс-скрининге; КЭ и ИФА не нашли практического применения в рутинном анализе многокомпонентных смесей и могут быть использованы только для узкопрофильных исследований. Для селективного и точного количественного определения индивидуальных алкалоидов травы термопсиса ланцетного наилучшим методом является ВЭЖХ, для полуколичественного определения — ВЭТСХ-денситометрия.

Разработка и внедрение ВЭЖХ-методики анализа алкалоидов термопсиса ланцетного в фармакопейную практику позволит дополнить контроль суммарного содержания алкалоидов анализом индивидуальных соединений, что соответствует общемировым тенденциям стандартизации сильнодействующего ЛРС.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.Д. Кахраманова — работа с источниками литературы, написание текста рукописи, формулировка выводов; С.Д. Алиджанова — работа с источниками литературы; Н.П. Антонова — концепция работы, участие в формулировании выводов, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; С.С. Прохватилова — работа с источниками литературы, участие в формулировании выводов; Е.П. Шефер — участие в формулировании выводов.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Sabina D. Kakhramanova analysed literature data, drafted the manuscript, and formulated conclusions. Sultana D. Alidzhanova analysed literature data. Natalia P. Antonova conceptualised the study, participated in formulating conclusions, and approved the final version for publication. Svetlana S. Prokhvatilova analysed literature data and participated in formulating conclusions. Elena P. Shefer participated in formulating conclusions.