Пирролизидиновые алкалоиды растений семейства Boraginaceae и оценка безопасности их применения по критерию острой токсичности

ВВЕДЕНИЕ

Семейство бурачниковые (Boraginaceae), по данным Angiosperm Phylogeny Group IV (APG IV) (цит. по [1]), объединяет 90 родов и насчитывает около 1700 видов растений, произрастающих по всему миру, в основном в Европе и Азии. Растения данного семейства содержат нафтохиноны, флавоноиды, терпеноиды, фенилпропаноиды и другие биологически активные соединения [1–3], обладающие различными видами фармакологической активности, в том числе противомикробной, противовирусной, противовоспалительной, антиагрегантной [4][5]. Изучение растений семейства Boraginaceae является актуальным с точки зрения возможности их применения в фармакологии и косметологии.

На территории Западной Сибири встречаются представители нескольких триб семейства Boraginaceae, которые имеют обеспеченную сырьевую базу [6]. Из представителей трибы Boragineae широкое распространение имеют медуница мягкая (Pulmonaria mollis Wulf. ex Hornem.) и нонея русская (Nonea rossica Steven), из трибы Lithospermeae — оносма простейшая (Onosma simplicissima L.), из трибы Cynoglossinae — чернокорень лекарственный (Cynoglossum officinale L.) [7][8]. Растения рода Pulmonaria используют в народной и доказательной медицине ряда стран в качестве противовоспалительных и отхаркивающих средств [9]. Представители рода Nonea оказывают антикоагулянтное [10], противовоспалительное, противомикробное, противогрибковое действие, ингибируют ацетилхолинэстеразу [11]. Растения рода Onosma применяют в качестве противовоспалительных, противомикробных и антиоксидантных средств [12]. C. officinale также используют в народной медицине: извлечения из корней — чаще наружно в качестве кровоостанавливающего, антибактериального, обезболивающего и противовоспалительного средства, настой травы или спиртовую настойку принимают внутрь при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, кашле, кровохаркании, гнойных инфекциях и мышечных судорогах. В гомеопатии используется извлечение из свежего цветущего растения при диарее, судорогах и суставных болях [10][13].

Для растений семейства бурачниковые характерно накопление пирролизидиновых алкалоидов (ПА), потенциально оказывающих токсическое действие на организм [10]. По химической природе ПА делят на 4 группы: ретронецин (I), гелиотридин (II), отонецин (III) и платинецин (IV). Структура и количественное содержание алкалоидов у разных представителей семейства Boraginaceae варьирует в широком диапазоне [14], что, в свою очередь, определяет степень выраженности токсических проявлений или их отсутствие.

Наличие алкалоидов в C. officinale является основанием запрета использовать все части растения в составе биологически активных добавок к пище¹. Известны случаи гибели сельскохозяйственных животных при поедании C. officinale [15], что связано с высоким содержанием в различных частях растения ПА подгруппы гелиотридина [10][16–18]. В то же время траву бурачника лекарственного (Borago officinalis L.) в некоторых странах выращивают как овощную культуру и широко используют в пищу [19].

В настоящее время P. mollis, N. rossica, O. simplicissima и C. officinale в Российской Федерации не являются официнальными видами. Тем не менее для этих и некоторых других представителей семейства бурачниковые проведены фитохимические исследования, определены различные метаболиты [4][20], представляющие интерес как биологически активные соединения, установлены их фармакологические свойства [5]. Выбранные для изучения растения по данным скрининговых исследований [21] представляют интерес для разработки новых фитопрепаратов. Вместе с тем наличие характерных для этого семейства ПА, которые могут оказывать гепатотоксическое действие [22], свидетельствует о необходимости предварительной оценки токсикологических исследований.

Цель работы — оценка безопасности применения растений семейства Boraginaceae по критерию острой токсичности и содержанию пирролизидиновых алкалоидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Лекарственное растительное сырье. В качестве объектов исследования (табл. 1) были выбраны высушенные надземные части P. mollis, N. rossica, O. simplicissima и C. officinale, заготовленные в период цветения и вегетации производящих растений на территории Новосибирской области в 2023–2024 гг.

Приготовление экстракта. Сухие экстракты получали в соответствии с подобранными ранее технологическими параметрами [23][24]: сырье измельчали до частиц размера 3 мм, помещали в колбу и заливали 70% спиртом этиловым в соотношении 1:20 (г:мл). Колбу с присоединенным обратным холодильником выдерживали на водяной бане при температуре 55 °С 60 мин, охлаждали при непрерывном перемешивании в течение 60 мин. После охлаждения экстракт фильтровали, удаляли экстрагент конвективной сушкой при температуре 30–40 °С.

Стандартные образцы. Реактивы производства BioCrick Co., Ltd. (Китай): 7-ацетилликопсамин (кат. № BCN2000, ≥98%), N-оксид 7-О-ацетилликопсамина (кат. № BCN8935, ≥98%); реактивы по каталогу Sigma-Aldrich: ликопсамин (кат. № PHL89726, ≥95%), N-оксид ликопсамина (кат. № PHL83447, ≥90%); реактивы производства MedChemExpress (США): интермедин (кат. № HY-113845, ≥99,0%), интермедин N-оксид (кат. № HY-W707957, ≥99,0%); реактивы производства ChemFaces (Китай): N-оксид виридифлорина (кат. № CFN00337, ≥98,0%), 7’-ацетил-интермедин (кат. № CFN00286, ≥98,0%), 7’-ацетил-интермедин N-оксид (кат. № CFN00518, ≥98,0%).

Лабораторные животные. Определение острой токсичности проводили на 102 половозрелых мышах стока CD-1: самцах весом 25±2 г и самках весом 23±2 г в возрасте 12 нед., полученных из ЦКП «Виварий конвенциональных животных» ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН (г. Новосибирск).

Животные находились в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и корму. Условия содержания и манипуляции с животными соответствовали стандартам, установленным в нормативных документах, регламентирующих работу с лабораторными животными². Протокол исследования (№ 162 от 28.11.2024) согласован комитетом по этике ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» (НГМУ) Минздрава России.

Методы

Хроматографическое исследование. Состав и количественное содержание алкалоидов в экстрактах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией-ионизацией электрораспылением (ВЭЖХ-ИЭР-МС). Анализ осуществляли на хроматомасс-спектрометре, оснащенном ВЭЖХ системой LC-20 Prominence (Shimadzu, США), масс-спектрометрическим детектором с тройным квадрупольным масс-анализатором LCMS-8050 (Shimadzu, США; ИЭР-МС) и колонкой ReproSil-Pur 120 C18-AQ (250×4,6×5 мм; Dr. Maisch GmbH, Германия).

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза, элюент A — вода, элюент В — ацетонитрил; программа градиента — 0–20 мин 2–80% B, 20–30 мин 80–100% B, 30–35 мин 100% B, 35–40 мин 100–2% B; инжектируемый объем — 1 мкл; скорость потока — 1 мл/мин, температура колонки — 30°C. Условия ИЭР-МС: режим ионизации — электрораспыление, положительная ионизация; температура интерфейса — 300°C; температура линии десольватации — 250°C; температура нагревательного блока — 400°C; скорость газа-распылителя (азот) — 3 л/мин; скорость газа-нагревателя (воздух) — 10 л/мин; давление газа (Ar), используемого для диссоциации, индуцируемой соударением — 270 кПa; скорость Ar — 0,3 мл/мин; напряжение на капилляре — 3 кВ; диапазон сканирования масс (m/z) 100–1900.

Количественный анализ индивидуальных соединений проводили, как описано ранее [25], для этого серию растворов (1–100 мкг/мл) веществ сравнения (ликопсамин, ликопсамин N-оксид, 7'-ацетил-ликопсамин, 7'-ацетил-ликопсамин N-оксид, интермедин, интермедин N-оксид, 7'-ацетил-интермедин, 7'-ацетил-интермедин N-оксид, виридифлорин N-оксид) хроматографировали в описанных выше условиях трижды для каждой концентрации вещества.

Градуировочные графики строили в координатах «концентрация соединения, мкг/мл — площадь масс-спектрометрического пика соединения в режиме регистрации выделенного иона (соответствует величине m/z протонированного иона [M+H]⁺, см. табл. 2), усл. ед.». с применением пакета программ Advanced Grapher v.2.2 (Alentum Software, Inc., США). Данные были представлены в виде среднего значения в серии из пяти определений.

Количественный анализ 3,7'-диацетил-интермедин N-оксида и 3,7'-диацетил-ликопсамин N-оксида проводили с использованием внешних веществ сравнения — 7'-ацетил-интермедин N-оксида и 7'-ацетил-ликопсамин N-оксида соответственно. Расчет содержания 3,7'-диацетил-интермедин N-оксида и 3,7'-диацетил-ликопсамин N-оксида осуществляли с использованием поправочного коэффициента (k = 1,117), учитывающего разницу в молекулярных массах ди- и моноацетатов ПА.

Изучение острой токсичности. Объектами исследования при определении острой токсичности служили сухие экстракты из травы и листьев P. mollis, травы N. rossica, O. simplicissima и C. officinale.

Лабораторных животных разделяли на 10 групп по 6 животных с учетом пола, возраста, массы тела и принципа рандомизации; для проведения пробит-анализа формировали 7 групп по 6 животных в каждой. Дозирование экстрактов проводили в мг/кг массы тела экспериментальных животных. Введение сухого экстракта осуществляли однократно внутрижелудочно в максимально возможной общей дозе 5 г на 1 кг массы тела животных. Сухой экстракт растворяли в дистиллированной воде для получения раствора с концентрацией 0,6 г/мл, объем введения составил 0,17 мл на 20 г массы животного.

При оценке острой токсичности сухих экстрактов из травы и листьев P. mollis, травы N. rossica, O. simplicissima и C. officinale учитывали общее состояние мышей (поведение, внешний вид, двигательная активность, потребление пищи и воды, реакция на внешние раздражители, масса тела), характер клинических проявлений интоксикации, возможный летальный исход³. Время непрерывного наблюдения для выявления первых признаков острой токсичности составляло 8 ч сразу после введения экстрактов. Затем наблюдение продолжалось в течение 14 сут регулярно в дневное время, принимая во внимание нормальный циркадный ритм животного. В качестве параметров острой токсичности рассматривали изменение общего состояния и внешнего вида животных, массы тела на 14 сут после введения препарата, число павших и выживших животных, продолжительность жизни.

В случае гибели животных проводили дополнительные исследования c помощью пробит-анализа по методу В.Б. Прозоровского в компьютерной программе StatPlus с определением основных летальных доз (ЛД): ЛД₁₀, ЛД₅₀, ЛД₉₀ [26] и морфологическое исследование внутренних органов.

Гистологическое исследование препаратов печени павших животных проводили с использованием микроскопа Nikon Eclipse 200 (Япония), камеры Levenhuk 1400M (США) при увеличении в 10–40 раз. Окраску препаратов проводили стандартным методом окраски гематоксилином и эозином.

Статистические методы. Описательная статистика (среднее арифметическое, стандартное отклонение (M±SD)) выполнена с помощью программного обеспечения «Statsoft Statistica 10.0.1011». Проверку нормальности распределения количественных признаков проводили с использованием критерия Шапиро–Уилка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате хроматографического разделения этанольных экстрактов из травы N. rossica, O. simplicissima и C. officinale были обнаружены и идентифицированы ПА (табл. 2). Их качественный состав и количественное содержание сильно варьировали в зависимости от объекта исследования. В генеративных побегах P. mollis алкалоиды не обнаружены, а из листьев они извлекались в следовых количествах.

Наибольшим разнообразием по качественному составу алкалоидов отличалась N. rossica, трава которой накапливает их в количестве до 8,25±0,8 мкг/г воздушно-сухого сырья. В целом в составе надземной части N. rossica преобладали алкалоиды-энантиомеры интермедина и ликопсамина, а также их дериваты. В составе надземной части O. simplicissima, помимо производных ликопсамина, обнаружен виридифлорин N-оксид, суммарное содержание ПА в сырье составило 1,07±0,03 мкг/г. Наибольшее количественное содержание ПА выявлено в траве C. officinale: 676,3±7,4 мкг/г. Результаты хроматографического исследования соединений приведены в таблице 2.

Ликопсамин проявляет противоопухолевую активность в отношении рака легких, его антипролиферативные эффекты связаны со способностями к аутофагии, апоптозу и ингибированию экспрессии интерлейкина-2 [27]. Учитывая значительное содержание производных ликопсамина в траве C. officinale, перспективно выделение данного соединения и проведение скрининга в отношении антипролиферативных свойств.

Генеративные побеги P. mollis не накапливают ПА, а ее листья содержат минимальное количество — менее 0,01 мкг на 1 г воздушно-сухого сырья, что косвенно свидетельствует о безопасности этих видов сырья. Для подтверждения этого предположения на следующем этапе проводили определение острой токсичности всех исследуемых видов сырья в эксперименте in vivo.

Гепатотоксическое действие большинства ПА развивается при хроническом применении, а при введении высоких доз — при остром отравлении [28][29]. В эксперименте животным вводили внутрижелудочно извлечения в высоких дозах — 5000 мг/кг. При этом отсутствовала летальность у животных, получавших сухие экстракты из травы и листьев P. mollis, травы O. simplicissima и N. rossica (табл. 3. Масса тела мышей после однократного внутрижелудочного введения экстрактов из надземной части некоторых растений в дозе 5000 мг/кг. Опубликована на сайте журнала⁴), что не позволило установить параметры острой токсичности методом пробит-анализа (ЛД₁₀, ЛД₅₀, ЛД₉₀). Полученные данные свидетельствуют о безопасности извлечений из данных видов сырья в указанных дозах.

Из-за отсутствия летальных случаев при максимально возможной дозировке ЛД₅₀ для сухих экстрактов из травы и листьев P. mollis, травы O. simplicissima и N. rossica при внутрижелудочном введении мышам ЛД₅₀ должна составлять 5 г/кг, что позволяет отнести изучаемые объекты к 5 классу токсичности (малотоксичные вещества) согласно действующей нормативной документации⁵. Необходимы дальнейшие исследования субхронической токсичности, что позволит выявить возможные функциональные нарушения при введении экстракта.

При внутрижелудочном введении экстракта из травы C. officinale все животные из группы погибли в течение первых трех суток наблюдения, после чего были произведены вскрытие животных и забор материала для гистологического исследования.

При исследовании морфологии внутренних органов наблюдали изменения в желудочно-кишечном тракте: желудок растянут (вздут); поджелудочная железа имела признаки острой воспалительной реакции, цвет темно-коричневый с редкими мелкими фокусами стеатоза, некроза; печень увеличена незначительно, цвет неравномерный — крупные фокусы светло-коричневого и темно-коричневого цвета, границы между ними нечеткие; остальные органы выраженных изменений не имели.

При гистологическом исследовании печени (рис. 2) выявлены признаки повреждения: центролобулярное полнокровие и обширные кровоизлияния; синусоиды расширены, полнокровны. Морфологические изменения в печени представлены жировой дистрофией гепатоцитов (рис. 2а) и мононуклеарной (воспалительной) инфильтрацией в портальных трактах (рис. 2b). Строение печени в норме представлено на рисунке 2c.

Определен диапазон доз экстракта C. оfficinale, при введении которых наблюдали переход от отсутствия гибели животных до 100% летальности: от 2,75 до 4,25 г/кг. В данном диапазоне с шагом 0,25 мг/г животным вводили исследуемые экстракты для установления количества смертей при каждой дозе (табл. 4. Летальность животных после внутрижелудочного введения экстракта травы C. officinale. Опубликована на сайте журнала⁶).

С применением пробит-анализа по методу В.Б. Прозоровского для спиртового извлечения (70%) из травы C. officinale были рассчитаны ЛД различных уровней и определено, что ЛД₅₀ составила 3,51±0,13 г/кг. Выявленные значения позволяют отнести экстракт из травы C. officinale к 4 классу токсичности согласно действующей нормативной документации.

Токсичность экстракта из травы C. officinale, вероятно, обусловлена метаболизмом ПА и их производных в соответствующие пирролы [30], обладающие высокой реакционной способностью и прерывающие репликацию ДНК, в результате которой возникают мутации, приводящие к раку печени [31][32].

В некоторых странах ведется мониторинг и нормирование содержания ПА в пищевых продуктах и фитопрепаратах в связи с риском возрастания уровня хронических заболеваний печени [33]. При норме допустимого потребления алкалоидов 1 мкг/кг [34] максимально допустимая доза ПА составит 70 мкг/сут.

Таким образом, результаты проведенного исследования показывают, что извлечения из травы и листьев P. mollis в исследуемых дозах при пероральном применении являются нетоксичными, для извлечений из травы O. simplicissima и N. rossica необходимо проведение дальнейших исследований для определения токсичности при длительном применении, а извлечения из травы C. officinale — токсичны и не могут использоваться для внутреннего применения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом ВЭЖХ установлено отсутствие ПА в траве P. mollis, наличие их следовых количеств (0,01 мкг/г) в листьях P. mollis. Трава и листья P. mollis не обладают гепатотоксическим действием при внутрижелудочном введении мышам в дозе 5 г/кг.

В траве O. simplicissima содержание ПА составило 1,07±0,03 мкг/г, в траве N. rossica — 8,25±0,08 мкг/г, в траве C. officinale выявлено высокое содержание ПА — 676,3±7,4 мкг/г.

Различия в компонентном составе и количественном содержании ПА явились причиной развития токсического эффекта при однократном внутрижелудочном введении исследуемых экстрактов мышам. Экстракты из травы и листьев P. mollis, травы N. rossica и травы O. simplicissima относятся к 5 классу токсичности (малотоксичные вещества), экстракт из травы C. officinale — к 4 классу токсичности⁷.

Таким образом, исследуемые растения семейства Boraginaceae содержат разное количество ПА и в связи с этим имеют различные перспективы медицинского применения. Так, трава и листья P. mollis не вызывают признаков проявления острой токсичности при однократном внутрижелудочном введении лабораторным животным; применение препаратов на основе травы N. rossica и O. simplicissima требует проведения дальнейших исследований для определения токсичности при длительном пероральном применении, а лекарственные формы на основе травы C. officinale токсичны, и их использование для внутреннего применения исключено.

Дополнительная информация. Таблицы 3, 4 размещены на сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств».

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-701-711-table

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Вклад авторов распределен следующим образом: В.В. Величко — концепция и дизайн исследования, написание текста рукописи, формулировка выводов, утверждение окончательной версии статьи для публикации; Д.Н. Оленников — получение, анализ данных химического состава, их интерпретация, редактирование текста рукописи; Е.Д. Олешко — пробоподготовка, получение экспериментальных данных; К.И. Ершов — проведение экспериментов с животными, статистическая обработка и интерпретация экспериментальных данных; Д.С. Круглов — статистическая обработка экспериментальных данных, работа с источниками литературы, критический пересмотр и доработка текста рукописи; К.А. Кошлич — морфологическое и гистохимическое исследование, интерпретация данных.

Соответствие принципам этики. Исследование было одобрено на заседании Комитета по этике Новосибирского государственного медицинского университета (протокол № 162 от 28.11.2024).

Additional information. Tables 3, 4 are published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-701-711-table

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Viktoriya V. Velichko developed research concept and design, wrote the manuscript, formulated conclusions, and finally approved the manuscript for publication. Daniil N. Olennikov obtained and analysed chemical composition, interpreted them and corrected the manuscript. Egor D. Oleshko prepared the samples and obtained experimental data. Konstantin I. Ershov conducted animal experiments, processed and interpreted statistical data. Dmitriy S. Kruglov statistically processed experimental data, worked with literature sources, and critically revised the manuscript. Ksenia A. Koshlich performed morphological and histochemical study and interpreted the data.

Ethics approval. The research was approved at a meeting of Ethics Committee, Novosibirsk State Medical University (Meeting Minutes No. 162 of 11 November 2024).