Моноклональные антитела: разработка платформенных методик оценки примесей высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений

ВВЕДЕНИЕ

Рынок биотехнологических препаратов в целом и моноклональных антител (МАТ) в частности бурно развивается [1]. С первыми лекарственными препаратами данной группы, зарегистрированными на рынках США и ЕС в конце 90-х гг. XX века, в настоящее время конкурируют препараты из европейских стран, Республики Корея, Китая, Индии, Ирана [2]. Наряду с регулярным появлением новых, оригинальных МАТ постоянно увеличивается доля биоаналогичных лекарственных препаратов.

В части контроля качества препаратов и разработки методик испытаний данной группы лекарственных средств (ЛС) также имеются приоритеты развития. Один из них — унификация применяемых методик испытаний и переход производителей на использование платформенных подходов (универсальных методик испытаний), применяемых для лекарственных средств различных составов, содержащих МАТ различных международных непатентованных наименований (МНН), производимых одной компанией как на одной, так и на разных производственных площадках.

Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография (ЭХ) — основной метод мониторинга высокомолекулярных соединений (ВМС), таких как димеры и олигомеры, используемый как на стадии разработки, так и для рутинного контроля качества МАТ. Оценка содержания родственных и производственных примесей (в том числе нежелательных молекулярных вариантов) основывается на разнице их гидродинамических радиусов. Преимущество метода: минимальное влияние на конформацию белка и его структуру, возможность разделения компонентов с различной молекулярной массой (ММ) (например, мономер с ММ ~150 кДа и ВМС с ММ≥300 кДа).

В качестве подвижных фаз в ЭХ применяют натриевые или калиевые фосфатные буферы, в качестве неподвижной фазы колонок — гидрофильный силикагель, оптимальный размер пор хроматографической колонки составляет 200–300 Å, что позволяет определять примеси размером до 500 кДа [3]. Детектирование проводится чаще при длине волны 280 нм, иногда при 214 нм¹ [4]. Перспективным направлением совершенствования данных методик является переход к методам ультраэффективной ВЭЖХ и подбор хроматографических колонок, неподвижная фаза которых не проявляет неспецифическую сорбцию определяемых соединений² [4].

Метод капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) широко используется для анализа чистоты нативных белков (мономеров) (в невосстанавливающих условиях, НВУ) и определения суммарного содержания легких и тяжелых цепей (в восстанавливающих условиях, ВУ), низкомолекулярных примесей (фрагментов), а также неполностью сформировавшихся МАТ — негликозилированных молекул, тяжелых и легких цепей антител и их комбинаций³ [5]. В качестве фонового электролита используется гель, содержащий додецилсульфат натрия (ДСН). Коммерческие гелевые матрицы, имеющие также в своем составе линейные или слабо разветвленные полимеры (линейный полиакриламид, полиэтиленоксид, полиэтиленгликоль, декстран и пуллулан), позволяют разделять белковые молекулы в диапазоне ММ 10–225 кДа. Использование готовых коммерческих гелей в качестве разделяющего буфера позволяет резко повысить воспроизводимость и правильность получаемых результатов [6][7].

Пробоподготовка анализируемых образцов при использовании метода КГЭ включает стадию нагревания в присутствии ДСН в высокой концентрации, что приводит к денатурации вторичных и третичных структур белка, в результате чего молекулы белка становятся равномерно заряженными. Метод определения основан на разделении, идентификации и определении содержания образующихся в результате денатурации комплексов «ДСН–белок» в кварцевом капилляре под действием приложенного высокого напряжения. Возникающее при этом у комплексов «ДСН–белок» постоянное отношение заряда к массе позволяет проводить их разделение по молекулярной массе, что обусловлено различием скорости миграции комплексов через матрицу геля, выступающей в качестве молекулярного сита, за счет различия их гидродинамических радиусов.

В НВУ денатурацию анализируемых белков проводят в присутствии алкилирующих реагентов (йодацетамид, N-этилмалеимид), блокирующих свободные сульфгидрильные группы; в ВУ — в присутствии 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола, восстанавливающих дисульфидные связи белка до гликозилированной и негликозилированной тяжелых цепей и легкой цепи. Анализ МАТ в ВУ позволяет оценить степень гликозилирования тяжелых цепей и применяется для оценки количественного содержания негликозированной тяжелой цепи. Для целей оценки деградации/стабильности продукта более информативным является определение в НВУ, поскольку в этом случае удается оценить собственную фрагментацию образца (в ВУ часть фрагментов может образоваться в ходе реакции восстановления МАТ и разрыва цепей) [8]. Оценка чистоты МАТ методом КГЭ охватывает все перечисленные группы примесей и проводится в условиях как ВУ, так и НВУ [9].

Как правило, в КГЭ используется детектирование в УФ-области спектра, а также флуориметрическое детектирование. Методики с флуориметрическим детектированием имеют значимое (100-кратное) преимущество по чувствительности определения по сравнению с УФ-детектированием, но при этом требуют более сложной пробоподготовки, предусматривающей использование дорогостоящих реактивов. Для рутинных методик определения чистоты и гетерогенности более предпочтительным является УФ-детектирование. КГЭ с флуориметрическим детектированием может быть применен не только для определения чистоты белка, но и, поскольку является более чувствительным, в качестве дополнительного метода обнаружения примесей клеток-хозяев — для обнаружения минорных количеств посторонних белковых частиц [10].

Создание унифицированных методик для МАТ является задачей, решаемой по всему миру. Так, в США в настоящее время действует монография Фармакопеи США (USP)⁴, содержащая платформенную методику определения примесей высокомолекулярных соединений (ВМС) в МАТ методом высокоэффективной эксклюзионной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. В качестве подвижной фазы используется буферный раствор, содержащий хлорид и фосфат калия с рН 6,2. В монографиях Европейской фармакопеи (Рh. Eur.) на голимумаб⁵ и инфликсимаб⁶, а также в проектах на готовую лекарственную форму голимумаба⁷, активную фармацевтическую субстанцию (АФС)⁸ и ЛП⁹ устекинумаба в качестве подвижных фаз указаны буферные растворы, содержащие фосфат натрия в различных концентрациях без/с добавкой натрия хлорида. Для анализа всех упомянутых МАТ используется одна и та же неподвижная фаза (хроматографические колонки (размер зерна 5 мкм, 7,8×300 мм) с гидрофильным силикагелем в качестве сорбента). Для анализа лекарственной формы голимумаба (по сравнению с АФС голимумаба) в дополнение к хроматографической колонке используется предколонка 5 мкм, 0,4×6 мм. Скорости потоков составляют 0,5 мл/мин (USP¹⁰) и 1,0 мл/мин (все монографии Рh. Eur.). Детектирование осуществляется либо при одной длине волны — 280 нм, либо одновременно на двух длинах волн — 214 и 280 нм.

Задача работы — разработка и валидация методик, предназначенных для испытания ЛС, содержащих МАТ, по показателю «Чистота». Новизна предлагаемого решения авторов заключается в оптимизации условий определения, позволяющих оценивать чистоту любых МАТ двумя ортогональными методами. Испытание по универсальным (платформенным) методикам было проведено для максимально широкого перечня МАТ различных МНН, произведенных как отечественными, так и зарубежными производителями, для 28 МАТ по методике ЭХ ВЭЖХ и 18 МАТ по методике КГЭ.

Цель работы — разработка и анализ возможности применения универсальных (платформенных) методик для оценки содержания примесей высокомолекулярных соединений, фрагментов, негликозилированных молекул в различных моноклональных антителах методами эксклюзионной хроматографии и капиллярного электрофореза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В качестве исследуемых образцов использовали лекарственные препараты отечественного и зарубежного производства, соответствующие следующим МНН: пембролизумаб, бевацизумаб, ритуксимаб, тоцилизумаб, ниволумаб, вендолизумаб, секукинумаб, ранибизумаб, экулизумаб, даратумумаб, пертузумаб, динутуксимаб бета, устекинумаб, цетуксимаб, дупилумаб, олокизумаб, нетакимаб, равулизумаб, сарилумаб, элотузумаб, леканемаб, безлотоксумаб, инфликсимаб, полатузумаб ведотин, атезолизумаб, иксекизумаб, рисанкизумаб, сенипрутуг.

Для приготовления подвижных фаз при проведении хроматографических исследований использовали: гидрофосфат калия (кат. № 029619, Central Drug House Ltd.); дигидрофосфат калия (кат. № 60220, Sigma-Aldrich); хлорид калия (кат. № 1.04933.0500, Merck). Для коррекции рН применяли концентрированную фосфорную кислоту (кат. № 345245, Sigma-Aldrich). Для проведения электрофореза использовали SDS-гель буферный раствор и SDS-MW буферный раствор для образцов (кат. № 390953, AB Sciex), йодацетамид (кат. № RC-150, G-Biosciences), β-меркаптоэтанол (кат. № 1425ML100, neoFroxx), 0,1 М натрия гидроксид (кат. № 390953, AB Sciex); 0,1 М хлористоводородную кислоту (№ 390953, AB Sciex). Применяли следующие стандартные образцы (СО): внутренний СО — 10 кДа, 5 мг/мл (кат. № 390953, AB Sciex); СО для гель-фильтрации: тиреоглобулин, бычий гамма-глобулин, куриный овальбумин, лошадиный миоглобин и витамин В₁₂ (кат. № 1511901, Bio-Rad); рабочие СО анализируемых МАТ (in-house СО).

Хроматографические колонки: TSKgel G3000swxl, 5 мкм, 7,8×300 мм (PN:0008541, SN: 0156А068346, LN: 015GA, Tosoh); Phenomenex BioSep SEC-s3000, 5 мкм, 7,8×300 мм (PN:00Н-2146-КО, SN: Н21-322431, LN: 6583-0331, Phenomenex).

Все подвижные фазы и растворы готовили с использованием воды высокоочищенной, полученной на установке Milli-Q Integral 15 (Millipore® Corp.), с последующей фильтрацией под вакуумом через одноразовые системы с мембранным фильтром из полиэфирсульфона с диаметром пор не более 0,2 мкм (кат. № EXVF1000YPS02CZS, GVS).

Оборудование. Использовали хроматографы Agilent Technologies серии 1200, оснащенные детекторами поглощения в УФ-области: диодно-матричными детекторами и детекторами с фиксированной длиной волны (VWD). Для обработки и анализа полученных хроматограмм применяли программное обеспечение OpenLab¹¹. Использовали систему капиллярного электрофореза PA 800 plus (Beckman Coulter), оснащенную диодно-матричным детектором с поглощением в УФ-области, при использовании апертуры 100×200 мкм (кат. № 144712, Beckman Coulter). Полученные электрофореграммы обрабатывали с помощью программного обеспечения Beckman 32Karat¹².

Пробоподготовка. Эксклюзионная хроматография. Образцы анализировали, используя хроматографические колонки для гель-фильтрации, обеспечивающие диапазон определения целевых молекулярных масс, характерных для димеров и агрегатов МАТ в диапазоне 10–500 кДа. Исследуемые образцы готовили восстановлением до концентраций 10 мг/мл с использованием подвижной фазы. СО, содержащий маркеры молекулярных масс, восстанавливали и далее разводили водой для хроматографии до концентрации 10 мг/мл.

Капиллярный гель-электрофорез в невосстанавливающих условиях. Исследуемые образцы разбавляли SDS-MW буферным раствором до расчетной концентрации целевого белка 1 мг/мл. К 95 мкл полученного раствора добавляли 2 мкл внутреннего СО 10 кДа, затем образцы обрабатывали 5 мкл раствора 250 мМ йодоацетамида и нагревали в течение 3 мин при 70 °С. Охлаждали образцы в течение 3 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 300g в течение 1 мин.

Капиллярный гель-электрофорез в восстанавливающих условиях. Исследуемые образцы разбавляли SDS-MW буферным раствором до расчетной концентрации целевого белка 1 мг/мл. К 95 мкл полученного раствора добавляли 2 мкл внутреннего СО 10 кДа. Далее осуществляли восстановление дисульфидных связей образцов добавлением 5 мкл раствора β-меркаптоэтанола и нагреванием в течение 3 мин при 100 °С с последующим охлаждением и центрифугированием при 300g в течение 1 мин.

Валидацию методик проводили в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ), Фармакопеи Евразийского экономического союза (ФЕАЭС)¹³ [11] по следующим критериям: специфичность, прецизионность, линейность, правильность, пределы определения и количественного определения, диапазона применимости и устойчивости (робастности) разработанных методик.

Статистическая обработка результатов. Проводили оценку площадей (или скорректированных площадей в случае метода КГЭ) целевых пиков, времени удерживания целевых пиков (хроматографические методы) и времени миграции (метод КГЭ), рассчитывали среднее арифметическое и относительное стандартное отклонение (RSD, %). Интервал значений относительных величин представлял собой величину среднего арифметического значения с учетом отклонений на трехкратную величину стандартного отклонения (SD). Способы расчета и выбор представления значения характеристики и неопределенности соответствовал требованиям ГОСТ Р 8.694-2010¹⁴. Общие статистические принципы определения метрологических характеристик соответствовали требованиям ГФ РФ и Решения Коллегии ЕЭК¹⁵.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основное внимание при разработке методик уделялось их универсальности, то есть возможности определять целевые соединения в любых МАТ, относящихся к разным МНН и имеющим различное специфическое действие. Проводилась работа по допустимому «упрощению» методик в части применения коммерчески доступных и, по возможности, недорогих реактивов, материалов и СО. При этом «упрощение» не должно было приводить к потере специфичности методик и снижению таких аналитических характеристик, как правильность, чувствительность, специфичность.

На первом этапе оценивалась специфичность методики, на втором этапе была проведена количественная оценка по наиболее важным валидационным параметрам: специфичности, воспроизводимости и правильности. Полученный хроматографический профиль и данные по содержанию целевых компонентов (мономера и примесей ВМС), определенные по разработанной нами методике, сравнивали с результатами, полученными при анализе МАТ каждой из исследованных серий с использованием оригинальных методик (ретроспективные данные ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, полученные в результате уставной деятельности учреждения). В случае получения удовлетворительных результатов методики испытаний направлялись отечественным производителям МАТ на апробацию. При этом в ходе апробации в лабораториях отечественных производителей МАТ и при валидации методик авторами подтверждена их специфичность, воспроизводимость и правильность, гарантирующие соответствие методик заявленным целям, для всех испытанных МАТ. После учета замечаний, полученных от производителей МАТ, проводилась валидация методик.

При разработке методик основывались на принципах, изложенных в ГФ РФ¹⁶ и в Решениях Коллегии ЕЭК¹⁷.

Платформенная методика определения содержания высокомолекулярных родственных примесей с использованием метода эксклюзионной хроматографии. При разработке методики определения примесей ВМС в качестве подвижной фазы использовали фосфатно-солевой буферный раствор с рН 6,2, содержащий 200 мМ фосфата калия, 250 мМ хлорида калия. В качестве аналитической была выбрана длина волны 280 нм, которая, имея несколько меньший (по сравнению с детектированием на длине волны 214 нм) отклик, тем не менее обладает большей специфичностью для определяемых соединений, обусловленной отсутствием вклада поглощения полисорбата, который практически всегда входит в состав рецептурного буфера АФС и ЛП терапевтических МАТ. Детектирование проводили в двух вариантах: на диодноматричном детекторе (DAD) и на более чувствительном детекторе с фиксированной длиной волны (VWD). Испытания на детекторе VWD проводились для оценки необходимости повышения чувствительности методики. В качестве неподвижной фазы апробированы 2 варианта хроматографических колонок: колонка TSKgel и колонка BioSep (табл. 1).

По итогам экспериментов была подтверждена специфичность колонки TSKgel по отношению к проанализированным МАТ. Также отмечено, что на колонке TSKgel разделение целевых соединений происходит только по эксклюзионному механизму, то есть порядок выхода и относительные времена удерживания (RRT) всех элюируемых соединений (пиков) не меняются независимо от МАТ. Стандартное время удерживания мономера МАТ, имеющего молекулярную массу ~150 кДа, в выбранных условиях испытания составило 15–18 мин, высокомолекулярные примеси элюировались с относительным временем удерживания (RRT) 0,80–0,85 по отношению к пику мономера (рис. 1. Хроматограмма пемролизумаба. Опубликован на сайте журнала (Приложение 1)¹⁸).

При испытании на колонке BioSep были выявлены неспецифические сорбционные взаимодействия анализируемых белков и сорбента: порядок элюирования пиков менялся, RRT имел нехарактерные значения. Так, например, мономер пембролизумаба и его высокомолекулярные примеси дополнительно удерживаются по обращенно-фазовому механизму, что следует из изменения времени удерживания и изменения порядка выхода пиков. Время удерживания мономера составляет от 24,5 до 25,5 мин, пики примесей ВМС имеют измененный порядок выхода (пик агрегата 1 и агрегата 2 меняются местами) (рис. 2. Хроматограмма пемролизумаба. Опубликован на сайте журнала (Приложение 1)¹⁹). При использовании колонки BioSep подвижную фазу потребовалось бы корректировать введением какого-либо органического модификатора, в связи с этим от дальнейшего использования колонки BioSep при разработке платформенной методики отказались.

Хроматографические профили, а также содержания компонентов препаратов, определенные с использованием колонки TSKgel по платформенной методике и оригинальным методикам, используемым для контроля качества препаратов, сопоставимы (табл. 2; рис. 3. Хроматограмма олокизумаба. Сопоставление профилей МАВ, полученных по платформенной и оригинальной методикам; рис. 4. Хроматограмма даратумаба. Сопоставление профилей МАТ, полученных по платформенной и оригинальной методикам, Опубликован на сайте журнала (Приложение 1)²⁰). В оригинальных методиках используются колонки TSKgel BioAssist G3SW_XL биоинертная версия G3000SWXL, а также колонка, аналогичная предложенной в платформах, TSKgel G3000SWXL 300×7,8, 5 мм, которые позволяют корректно разделять высокомолекулярные соединения и мономер.

Чистота объектов, определенная двумя способами, коррелирует (принимая во внимание то, что в исследовании использованы образцы с уже истекшим сроком годности, что обусловило увеличение примесей ВМС на момент испытаний по разрабатываемой методике) (табл. 2). В таблицу не включены данные по содержанию низкомолекулярных примесей (НМС), поскольку данную методику не рекомендуется использовать для оценки этой группы примесей без дополнительной верификации или валидации для конкретного объекта испытаний. Содержание примесей ВМС и мономера рассчитывали методом внутренней нормализации площадей в процентах от общей площади всех пиков белковой природы на хроматограмме (включая пики НМС). Интегрирование пика мономера выполняли по наиболее строгому варианту с разметкой не полностью разделенных пиков и «плечевых» пиков примесей НМС путем опускания перпендикуляра к общей базовой линии. Таким образом, при расчетах учитывался вклад примесей НМС в общую площадь интегрируемых пиков. Правильность определения НМС как таковых недостаточна, но в силу их относительно малого содержания (в сравнении с мономером и общей площадью пиков) погрешность оценки содержания мономера при таком подходе минимальна.

Стандартные образцы. В качестве СО использовали два типа образцов: СО, содержащий маркеры молекулярной массы, и СО предприятия, аттестованный в установленном порядке, содержащий анализируемый МАТ. Оба типа СО использовались только для проверки пригодности хроматографической системы. В качестве СО с маркерами молекулярной массы использовали набор, содержащий 5 маркеров ВМС (тиреоглобулин, бычий гамма-глобулин, куриный овальбумин, лошадиный миоглобин (белки с ММ 17000–670000 Да) и НМС витамин В₁₂ (ММ 1350 Да)). Может быть использован иной набор аналогичных по качеству СО (маркеров) молекулярной массы, состав которого может быть сокращен, но должен включать один маркер НМС, элюирующегося с общим свободным объемом колонки, и как минимум два белка-маркера с молекулярными массами 50000–600000 Да, отличающимися друг от друга не менее чем в 2 и не более чем в 4 раза.

Оценка пригодности хроматографической системы. Оценку пригодности хроматографической колонки проводили по хроматограмме СО смеси белков-маркеров и НМС; оценку разделительной способности хроматографической системы — с использованием СО маркеров молекулярных масс и СО испытуемого МАТ, обогащенного примесями ВМС. Обогащенный примесями ВМС образец получали путем принудительной деградации СО МАТ в условиях: 1) УФ-облучение при длине волны 254 нм в течение 1 ч с размещением источника облучения на расстоянии 10 см от образца; 2) воздействие повышенной температуры 105 °С в течение 4 ч; 3) воздействие повышенной температуры 60 °С в течение 30 мин. После проведения принудительной деградации количество примесей ВМС возрастало до 5, 15 и 1,7% соответственно.

Оценка пригодности хроматографической системы включала в себя проверку по критериям, требуемым ГФ РФ²¹.

Описание методики и условия проведения анализа. Описание приготовления растворов испытуемых и стандартных образцов, подвижной фазы, требования к пригодности хроматографической системы разработанной универсальной методики определения содержания высокомолекулярных примесей с использованием метода эксклюзионной ВЭЖХ представлены в Приложении 2 (опубликовано на сайте журнала²²). Раствор сравнения 1 включает маркеры молекулярных масс, раствор сравнения 2 включает стандартный образец анализируемого МАТ (in house).

Условия хроматографирования: колонка — 300×7,8 мм, гидрофильный силикагель для хроматографии (5 мкм), размер пор 25 нм, пригодный для разделения глобулярных белков в диапазоне молекулярных масс 10000–500000 Да (например, TSKgel G3000SWXL, 300×7,8 мм, 5 мкм, размер пор 25 нм, Tosoh Bioscience, кат. № 0008541); температура колонки — 23±2 °C; скорость потока — 0,5 мл/мин; детектор — УФ-детектор при 280 нм; температура автосэмплера — 2–8 °C; объем пробы — 20 мкл; нагрузка белка на колонку около 200 мкг; время хроматографирования — 30 мин.

Последовательность хроматографирования. Хроматографировали растворы в следующей последовательности, вводя пробы в количествах, кратных «n»: контрольный раствор (n=1), раствор плацебо (n=1), раствор сравнения 2 (n=2), раствор для оценки чувствительности хроматографической системы (n=1), раствор сравнения 1 (n=3), испытуемый раствор (n=2), раствор сравнения 1 (n=1). Оценку пригодности хроматографической колонки для целей методики и оценку эффективности колонки выполняли с использованием раствора СО маркеров. Оценку разделительной способности и воспроизводимости используемой хроматографической системы — с использованием раствора сравнения СО МАТ.

Обработка результатов и анализ данных. Определение содержания целевых соединений осуществлялось методом внутренней нормализации площадей. На хроматограммах испытуемого раствора и раствора СО МАТ идентифицировали пик мономера как пик самой большой площади, с временем удерживания меньшим, чем время удерживания пика низкомолекулярного маркера молекулярной массы на хроматограмме раствора сравнения 2 и пиков компонентов плацебо. Пики с меньшими временами удерживания, чем пик мономера, соответствовали пикам высокомолекулярных соединений, с бóльшими — пикам низкомолекулярных соединений.

Интегрирование пиков соединений с временем удерживания меньшим, чем время удерживания низкомолекулярного маркера молекулярной массы на хроматограмме раствора сравнения 2, проводили в соответствии с ГФ РФ²³. В расчетах не учитывали пики, присутствующие на хроматограмме контрольного раствора, раствора плацебо, а также отдельно стоящие пики с площадью менее площади пика мономера на хроматограмме раствора для оценки чувствительности хроматографической системы.

Пики ВМС и НМС, имеющие общую базовую линию и отделенные друг от друга вертикальными линиями разметки, учитывали независимо от их содержания.

Валидацию методики определения содержания высокомолекулярных примесей методом эксклюзионной хроматографии проводили на препарате, содержащем пембролизумаб. В соответствии с требованиями ГФ РФ и ФЕАЭС²⁴ проводилась оценка специфичности, прецизионности, линейности, правильности, предела определения и предела количественного определения, диапазона применимости и устойчивости (робастности) разработанной методики.

Оценку специфичности проводили путем визуального сравнения хроматограмм испытуемых образцов и хроматографического профиля, получаемого для каждого из исследуемых МАТ по оригинальной методике производителей данных МАТ. Также для подтверждения отсутствия влияния вспомогательных веществ на профиль хроматограммы использовали растворы плацебо. В качестве раствора плацебо использовали рецептурный буферный раствор, содержащий все компоненты готового нерасфасованного продукта, активной фармацевтической субстанции или ЛП (кроме самого МАТ) и разведенный аналогично испытуемому раствору. Все получаемые хроматографические профили соответствовали профилям, полученным по оригинальным методикам. На хроматограммах растворов плацебо не было обнаружено аналитически значимых пиков в диапазонах времен удерживания пиков целевых соединений. Таким образом, специфичность методики была подтверждена.

Прецизионность. Оценка повторяемости проводилась путем расчета значения RSD относительных значений площадей целевых пиков, а также их времен удерживания. Статистическую обработку проводили по результатам измерения шести независимых проб одной серии препарата с индивидуальной пробоподготовкой в разные дни двумя аналитиками в одних условиях хроматографирования. Значение показателя RSD абсолютных площадей пиков при оценке сходимости работы аналитиков составило: для мономера — 0,37%, для группы агрегатов № 1–8%, группы агрегатов № 2 — 0,51%, для общей площади пиков, принимаемых в расчет, — 0,39%. Для относительной площади мономера RSD составило 0,02%. Значение RSD абсолютных времен удерживания пиков составило: для мономера — 0,03%, для группы агрегатов № 1 — 1,73%, группы агрегатов № 2 — 0,06 %.

Прецизионность методики также оценивали по аналогичным критериям для СО белков-маркеров молекулярных масс.

Значение показателя RSD абсолютных площадей пиков при оценке сходимости работы аналитиков составило: для тиреоглобулина — 1,39%, гамма-глобулина — 4,24%, овальбумина — 7,1%, миоглобина — 0,84%, витамина В₁₂ — 1,10%, общей площади пиков — 2,04%. Для относительной площади пика витамина В₁₂ RSD составило 2,27%, для абсолютных времен удерживания пиков указанных соединений — 0,01–0,05%.

Линейность. Линейность методики определяли путем оценки коэффициента детерминации (r²) линейной регрессии зависимости отклика детектора (по пику мономера) от концентрации испытуемого раствора в диапазоне 0,5–20%. Для этого последовательно анализировали в одних хроматографических условиях растворы с концентрацией специфичного МАТ (мг/мл (%)): 0,005 (0,5); 0,01 (1); 0,025 (2,5); 0,05 (5); 0,075 (7,5); 0,25 (25); 0,5 (50); 0,8 (80); 1,0 (100); 1,2 (120). Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием линейной модели. Отдельно оценивали диапазоны 0,5–7,5% (для оценки неспецифической сорбции белка в системе) и 80–120%. Значение r² площади пика мономера на участках как нижней, так и верхней границ диапазона составило 1,0000. Таким образом, линейность методики была подтверждена в диапазоне концентраций 0,5–120% от целевой концентрации испытуемых растворов, значительного влияния неспецифической сорбции белка в нижней части аналитического диапазона методики не выявлено.

Правильность методики оценивали с помощью данных, полученных при подтверждении линейности методики. Для этого вычисляли открываемость относительно теоретического значения для рассчитанной по уравнению линейной регрессии концентрации каждого проанализированного раствора. Значение открываемости составило: в диапазоне 0,5–7,5% — от 99,9 до 102,1%; в диапазоне 80–120% — от 99,05 до 99,22%. Таким образом, правильность методики была подтверждена.

Предел количественного определения методики был установлен на уровне 0,5% от целевой концентрации белка, в соответствии с данными, полученными при подтверждении линейности и правильности методики.

Платформенная методика определения родственных примесей (фрагментов) методом капиллярного электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. При разработке методики КЭФ основывались на данных литературы [8][12], а также на протоколе пробоподготовки руководства «Система фармацевтического анализа PA 800 plus SDS-MW метод разделения белков по размеру Beckman Coulter», США²⁵.

Пробоподготовка. Исследуемые образцы разбавляли SDS-MW буферным раствором для образцов до расчетной концентрации целевого белка 1 мг/мл, после чего к 95 мкл полученного раствора добавляли 2 мкл внутреннего СО 10 кДа. Далее в НВУ добавляли 5 мкл раствора для алкилирования и нагревали в течение 3 мин при 70 °С. В ВУ осуществляли восстановление дисульфидных связей МАТ путем добавления 5 мкл раствора β-меркаптоэтанола, после чего нагревали образцы в течение 3 мин при более высокой температуре (100 °С). По окончании нагревания все образцы охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали при 300g.

Оригинальные методики также основаны на протоколах, сопровождающих аналитическое оборудование, но варьируются в части соотношений целевого белка и реактивов (растворы йодацетамида, 2-меркаптоэтанола), используемых в пробоподготовке, различного состава и значений рН буферных растворов, целевых концентраций белка (колеблются в интервале 1,0–2,5 мг/мл). Значительные отличия имеются в условиях проведения этапа термической обработки реакционной смеси. Применяются капилляры различной длины (общей и эффективной) от 50 до 67 см и от 10 до 20 см соответственно, разделение в диапазоне напряжений от 0 до +30 кВ (повышение напряжения от 0 кВ до 15,0 кВ за 1,0 мин), с величиной тока от 0 до 300 мкА, условий подготовки капилляра к разделению (промывка и кондиционирование) ввода и разделения образцов на приборе (настройки оборудования), времени электрофоретического разделения. Все вышеперечисленное оказывает прямое влияние на чувствительность и разделительную способность системы. Различным является подход к расчету и оценке результатов испытаний.

В изначально выбранных условиях испытания (величина тока менее 10 кВ и время разделения 30 мин) для нескольких МАТ в НВУ на электрофореграммах наблюдалась неполная картина разделения, часть пиков ВМС оказалась за пределами рабочего времени проведения электрофореза (более 30 мин) и они не отразились на электрофореграммах, что было неприемлемым. Для оптимизации разделения в ВУ и НВУ были подобраны следующие условия электрофоретического разделения.

Капилляр: кварцевый капилляр без покрытия Uncoated Capillary, внутренний диаметр 50 мкм, общая длина 30,2 см, эффективная длина 20 см (из набора SDS-MW Analysis Kit, кат. 338451, Beckman Coulter), апертура 100×200 мкм (кат. № 144712, Beckman Coulter).

Условия разделения: ввод пробы — электрокинетический, в течение 20 с при 5 кВ, полярность — обратная (ввод с длинного конца капилляра); параметры разделения — напряжение 15,0 кВ, давление 20 psi на оба конца капилляра, линейное повышение напряжения от 0 до 15,0 кВ за 1,0 мин, время разделения 40 мин. Детектирование: детектор — УФ-детектор, аналитическая длина волны — 220 нм, частота сбора данных — 2 Гц, ширина щели 10 нм. Температура капилляра — 25±2 °C. Температура автосэмплера — 25±2 °C. Смена растворов (цикл) — каждые 8 вводов.

Время разделения может изменяться в зависимости от анализируемого объекта, но должно составлять не менее 1,1 от времен миграции пика тяжелой цепи на электрофореграмме восстановленного раствора сравнения или 1,1 от времен миграции основного пика на электрофореграмме невосстановленного раствора сравнения.

Стандартные образцы. Использовали два типа стандартных образцов: внутренний СО и СО, содержащий определяемый МАТ. Внутренним СО, предназначенным для количественного определения целевых пиков, являлся маркер молекулярной массы — иммуноглобулин с ММ 10 кДа. Второй стандартный образец — СО предприятия (in-house), аттестованные в установленном порядке, содержащие МАТ, испытания которых проводились методом КГЭ. Для проверки пригодности электрофоретической системы использовался in-house СО МАТ.

Провести сравнительный анализ результатов, полученных по разным методикам, для всех исследованных в этой работе МАТ не представлялось возможным, поскольку для анализа некоторых из них в оригинальных методиках использован метод электрофореза в полиакриламидном геле, для некоторых метод интегрирования пиков и способ расчета содержания отличается от принятого в платформенной методике, для некоторых оценка фрагментов вообще не была предусмотрена на этапе выходного контроля МАТ и не была включена в нормативную документацию.

Немаловажным фактором при сравнении результатов, полученных методом КГЭ с использованием оригинальной и платформенной методик, является способ интегрирования пиков и способ расчета чистоты в МАТ. Оригинальные методики по-разному оценивают чистоту МАТ (содержание фрагментов): в одних случаях к основным пикам относят только пик интактного иммуноглобулина (НВУ) или пики легкой и тяжелой цепей (ВУ) (методики определения МАТ № 2–3). В других случаях с основными пиками суммируют пик негликозилированной тяжелой цепи, повышая таким образом относительную площадь на 2–5% (методики определения МАТ № 1), что приводит к завышению результатов (табл. 3).

Оценка пригодности электрофоретической системы. Проверку пригодности системы осуществляли с использованием СО испытуемого МАТ. Основными критериями пригодности системы являлись:

• выявление примесей в соответствии с заявленным пределом обнаружения методики и количественную оценку в соответствии с заявленным пределом количественного определения (оценка чувствительности по значению отношения сигнал/шум);
• разделение примесей между собой и с пиками мономера/легкой/тяжелой цепей (требование к степени разрешения между пиками и числу теоретических тарелок);
• миграция пиков всех оцениваемых соединений от зоны ввода пробы к детектору (требование к времени миграции пика внутреннего СО (10 кДа));
• параметры пиков соединений позволяют оценивать их с приемлемой воспроизводимостью и правильностью (требования к относительному стандартному отклонению скорректированной площади пиков и времени их миграции, требование к значению симметрии пиков).

Описание методики и условия проведения анализа. Детальное описание приготовления растворов испытуемых и стандартных образцов в условиях НВУ и ВУ, программы предварительного кондиционирования капилляра, разделения, промывки капилляра после проведения анализа, требования к пригодности электрофоретической системы в условиях НВУ и ВУ, разработанной методики определения содержания низкомолекулярных примесей (фрагментов) и негликозилированных частей молекул с использованием КГЭ представлены в Приложении 2 (опубликовано на сайте журнала²⁶). В качестве рабочей была выбрана концентрация 1 мг/мл. Проверку разделительной способности электрофоретической системы в условиях НВУ предложено проводить по раствору СО МАТ, подвергнутому стрессовому воздействию (в результате которого увеличивается содержание фрагмента негликозилированной тяжелой цепи), что позволяет оценить степень разрешения между пиками негликозилированной цепи и мономера. В ВУ разделительная способность системы оценивается по стандартному раствору МАТ, полученному в условиях, аналогичных для испытуемого образца (для ВУ), путем оценки разрешения между пиками легкой и тяжелой цепей. Чувствительность системы в НВУ и ВУ подтверждается по раствору, содержащему анализируемое МАТ в концентрации, соответствующей ПКО.

Последовательность ввода испытуемых образцов. Каждый из растворов, приготовленных в НВУ и ВУ, вводили в количествах кратных «n» в нижеприведенной последовательности: холостой раствор (n=1), раствор для оценки чувствительности (n=1), раствор сравнения (n=3), раствор для проверки пригодности электрофоретической системы (n=1), испытуемый раствор (n=3), раствор сравнения (n=1).

Электрофоретический профиль образцов в НВУ и ВУ (рис. 8. Электрофореграмма раствора даратумумаба в невосстанавливающих условиях; рис. 9. Электрофореграмма раствора даратумумаба в восстанавливающих условиях, Опубликован на сайте журнала (Приложение 1)²⁷) представлял собой хорошо разделенные целевые пики. Все электрофореграммы соответствовали требованиям пригодности электрофоретической системы: на электрофореграммах обнаруживался пик внутреннего СО с ММ 10 кДа с временем миграции менее 14,0 мин (12,3–12,9 мин); относительное стандартное отклонение скорректированных площадей основного пика / пика тяжелой цепи для трех последовательных вводов каждого исследуемого раствора (n=3) составляло не более 5,0% (0,096–1,410%); относительное стандартное отклонение времен миграции основного пика / пика тяжелой цепи для трех последовательных вводов исследуемого раствора (n=3) — не более 2,0% (0–0,413%); отношение пик/долина (p/v), рассчитанное для основного пика / пика тяжелой цепи и предшествующего ему пика примеси, — не менее 1,05; фактор симметрии основного пика / пика тяжелой цепи — не более 4,0 (1,14–3,42).

Обработка результатов и анализ результатов испытаний. Содержание примесей фрагментов и примесей ВМС рассчитывали методом внутренней нормализации скорректированных площадей в процентах от общей скорректированной площади всех пиков белковой природы на электрофореграмме. Интегрирование пиков во всех случаях проводилось по варианту с разметкой смежных, не полностью разделенных пиков и «плечевых» пиков примесей путем опускания перпендикуляра из разделяющей пики впадины или точки перегиба к общей базовой линии (как представлено на типичных электрофореграммах (рис. 8. Электрофореграмма раствора даратумумаба в невосстанавливающих условиях; рис. 9. Электрофореграмма раствора даратумумаба в восстанавливающих условиях. Приложение 1. Опубликованы на сайте журнала²⁸)). Не полностью разделенные пики примесей, имеющие общую базовую линию или не имеющие явной точки перегиба, интегрировали совместно и учитывали в любом случае, независимо от индивидуальной интенсивности каждого из таких пиков. Интегрировали и оценивали скорректированные по времени площади всех пиков, мигрирующих после пика внутреннего СО с молекулярной массой 10 кДа до окончания времени электрофоретического разделения (40 мин). Пик с молекулярной массой 10 кДа и сопутствующие пики, представляющие собой «всплески» базовой линии, в расчетах не учитывали.

Невосстанавливающие условия. На электрофореграммах испытуемого раствора и раствора сравнения идентифицировали основной пик как самый высокий пик на электрофореграмме. Пики с временами миграции, предшествующими основному пику, соответствовали пикам низкомолекулярных соединений. Пики с временами миграции, превышающими время миграции основного пика, соответствовали пикам высокомолекулярных соединений. Их интегрировали (рис. 8. Электрофореграмма раствора даратумумаба в невосстанавливающих условиях, Приложение 1. Опубликован на сайте журнала²⁹) и учитывали в расчетах.

Восстанавливающие условия. На электрофореграммах испытуемого раствора и раствора сравнения идентифицировали пики легкой и тяжелой цепей. Неидентифицированные пики с временами миграции, предшествующими пику тяжелой цепи, соответствовали пикам НМС, с временами миграции, превышающими время миграции пика тяжелой цепи, — пикам ВМС.

В НВУ и в ВУ случаях, когда на электрофореграммах присутствовал пик негликозилированной тяжелой цепи, его относили и нормировали как пик НМС. Все вышеперечисленные пики примесей интегрировали (рис. 9. Электрофореграмма раствора даратумумаба в восстанавливающих условиях, Опубликован на сайте журнала (Приложение 1)³⁰) и учитывали в расчетах.

Сопутствующие пики «всплесков» базовой линии представляют собой пики, имеющие характерную форму с острыми вершинами, отличную от формы пиков примесей и основных пиков (обладающих гауссоидальной формой и плавной вершиной). Сопутствующие пики считаются допустимыми, если присутствуют в качестве единичных пиков, не интерферируют с целевым пиками, подлежащими оценке, и не мешают их интегрированию.

Валидация методики определения родственных примесей (фрагментов) методом капиллярного гель-электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Данные по валидации были получены двумя аналитиками на разных единицах приборов в разные дни.

Специфичность. Для оценки специфичности методики сравнивали получаемые электрофоретические профили и содержание целевых примесей, определенных с использованием платформенной и оригинальной методик. Значимых отличий между профилями и содержанием примесей выявлено не было. На электрофореграммах растворов плацебо не было обнаружено пиков с временами миграции, совпадающими с временами миграции целевых пиков исследуемых образцов.

Для оценки предела обнаружения (ПО) были приготовлены образцы с концентрацией белка 0,003 мг/мл (0,3% от концентрации испытуемого раствора) и 0,005 мг/мл (0,5% от концентрации испытуемого раствора) для НВУ и ВУ соответственно. Для раствора ПО были получены значения соотношения сигнал/шум от 12 до 15 (НВУ) и от 13 до 17 (по пику тяжелой цепи) (ВУ).

Для оценки предела количественного определения (ПКО) были приготовлены образцы с концентрацией белка 0,005 мг/мл (0,5% от концентрации испытуемого раствора) и 0,0075 мг/мл (0,75% от концентрации испытуемого раствора) для НВУ и ВУ, соответственно (рис. 10. Электрофореграмма раствора ПКО в невосстанавливающих условиях; рис. 11. Электрофореграмма раствора ПКО в восстанавливающих условиях. Опубликован на сайте журнала (Приложение 1)³¹). По результатам оценки чувствительности в НВУ для раствора ПКО были получены значения соотношения сигнал/шум от 20 до 32; в ВУ по пику тяжелой цепи — от 27 до 39.

Линейность методики определяли путем оценки коэффициента детерминации (r²) линейной регрессии зависимости отклика детектора (по основным пикам) от концентрации испытуемого раствора в диапазоне 0,5–300%. Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием линейной модели.

Оценку линейности и аналитического диапазона методики проводили, основываясь на результатах собственных экспериментов и общепринятых нормах содержания примесей низко- и высокомолекулярных соединений, определяемых методами КГЭ (суммарно не более 5–7%). При оценке верхней границы аналитического диапазона опирались на рабочие концентрации МАТ испытуемых/стандартных растворов, принятых в оригинальных методиках — 300% (3 мг/мл) от номинальной концентрации (1 мг/мл). Оценка линейности проводилась аналогично методу ЭХ — в трех диапазонах: нижнем, верхнем и объединенном. Данные линейности нижнего диапазона (в области 0,5–7,0%) получены с использованием 5 точек концентраций; верхнего диапазона (в области 80–300%) получены с использованием 8 точек концентраций; объединенного — 13 точек концентраций. В верхнем диапазоне были приготовлены образцы с концентрациями от 80 до 300% (0,8–3,0 мг/мл) относительно целевой концентрации 1 мг/мл для НВУ и ВУ с точками концентраций 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200 и 300%. В нижнем диапазоне концентраций были приготовлены образцы с концентрациями: НВУ от 0,5% (0,005 мг/мл), ВУ 0,75% (0,0075 мг/мл)до 7,0% (0,070 мг/мл (для НВУ и ВУ)) относительно целевой концентрации 1 мг/мл. Объединенные точки концентраций составили; 0,5% (для НВУ) и 0,75% (для ВУ), 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200 и 300%.

Для каждой точки концентрации каждым аналитиком готовились по 3 независимые пробы с индивидуальной пробоподготовкой. Статистическую обработку проводили по результатам измерения шести независимых проб, одной серии образца каждой из указанных ниже концентраций.

Все зависимости отклика детектора от концентрации линейны, отвечают условию r≥0,99, что подтверждает линейность данной методики. Аналитический диапазон методики составляет 0,5–300% для НВУ и 0,75–300% для ВУ.

Данные по линейности представлены в Приложении 3 (опубликовано на сайте журнала³²).

Оценку правильности методики определяли путем сравнения фактической концентрации и рассчитанной по градуировочному графику зависимости аналитического сигнала от концентрации в верхнем диапазоне концентраций (от 80 до 300%, суммарно для 8 концентрационных точек) (относительно теоретической). По полученным данным рассчитывали общее среднее арифметическое значение данных, полученных обоими аналитиками (суммарно для 48 результатов). Правильность составила: в НВУ от 97,59 до 103,77% (в точке 1 мг/мл — 103, %); в ВУ: для тяжелой цепи от 98,11 до 102,55% (в точке 1 мг/мл — 101,24 %); для легкой цепи от 98,43 до 101,74 % (в точке 1 мг/мл — 101,39%); суммарно по тяжелой и легкой цепям — от 98,43 до 102,24%.

Прецизионность оценивали для концентраций верхнего диапазона, для 8 концентрационных точек: 80, 90, 100, 110, 120, 150, 200 и 300 % от целевой концентрации (1 мг/мл). Статистическую обработку проводили по результатам измерения шести независимых проб, одной серии образца каждой из указанных концентраций с индивидуальной пробоподготовкой каждым из аналитиков, в одних условиях разделения (в общей сложности для 48 результатов (n=48). По полученным данным рассчитывали общее среднее арифметическое значение (между двумя аналитиками), среднеквадратичное отклонение и RSD. RSD составили:

• НВУ — абсолютное время миграции 0,09–0,18%; относительное содержание интактного иммуноглобулина 0,14–1,01%;
• ВУ — абсолютное время миграции тяжелой цепи 0,14–1,00%, легкой цепи 0,15–1,02%; относительное содержание: тяжелой цепи 0,28–1,0 %, легкой цепи 0,37–0,8%, суммы тяжелой и легкой цепей 0,30–0,75%, что соответствует установленному допустимому разбросу значений по оцениваемым параметрам «не более 5%».

Устойчивость методики оценивали путем варьирования температуры термостата для хранения образцов (20, 25 °С) и сменой капилляра на идентичный, но другой серии, Uncoated Capillary (внутренний диаметр 50 мкм, общая длина 30,2 см из набора SDS-MW Analysis Kit (эффективная длина 20 см), кат. №338451, Lot. M304684, Beckman Coulter), апертура 100×200 мкм. Анализировали по 3 параллельно приготовленных образца с концентрациями 1,0 мг/мл (НВУ) и 0,8 мг/мл (ВУ).

Устойчивость оценивали по соответствию скорректированных площадей и времен миграции допустимому диапазону, установленному по результатам валидации. Была показана устойчивость методики при варьировании температуры термостата для образцов от 20 до 25 °С, а также при использовании разных лотов идентичных капилляров.

ВЫВОДЫ

Таким образом, нами разработаны методики для определения родственных примесей с использованием методов эксклюзионной ВЭЖХ, капиллярного электрофореза в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях в препаратах МАТ, которые были апробированы для МАТ 28 различных МНН российского и зарубежного производства.

Разработаны критерии оценки пригодности хроматографических и электрофоретических систем для выбранных условий испытаний.

Валидационные характеристики разработанных методик (специфичность, предел количественного определения, аналитическая область, линейность, правильность, прецизионность, устойчивость) соответствовали установленным критериям приемлемости. Для методики определения ВМС в МАТ методом эксклюзионной хроматографии прецизионность (RSD) определения площадей пиков составила: для мономера — до 0,4%, для групп агрегатов — до 8%, для общей площади пиков — до 0,4%, для относительной площади мономера — 0,02%. Линейность методики подтверждена в линейном диапазоне 0,5–120%, правильность — в диапазоне концентраций 99,1–102,1%, предел количественного определения методики составил 0,1%.

Для методики оценки чистоты МАТ метода капиллярного гель-электрофореза в ВУ и НВУ с определением содержания иммуноглобулина, тяжелых и легких цепей, примесей низко- и высокомолекулярных фрагментов, а также негликозилированных фрагментов МАТ, с использованием метода капиллярного гель-электрофореза в ВУ и НВУ: прецизионность составила до 1,0% для относительного содержания основных пиков и до 1,0% для абсолютных времен миграции основных пиков. Линейность методики подтверждена в диапазоне концентраций 0,5–300%, правильность — 97,6–103,7%. Предел количественного определения — 0,5%.

Предлагаемые универсальные методики испытаний могут быть применены на любом этапе жизненного цикла продукта: при производстве (в ходе контроля очистки продукта, этапов хранения очищенного белка или других промежуточных продуктов); при испытаниях фармацевтической субстанции и ЛП (при выпускающем контроле и исследовании стабильности); при валидации производственного процесса; при подтверждении биоаналогичности (аналитической сопоставимости); при оценке сопоставимости производственных процессов.

Дополнительная информация. Приложения 1, 2, 3 размещены на сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств».

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346-annex1

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346-annex2

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346-annex3

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: О.А. Ваганова — концепция работы, написание и оформление текста рукописи; Р.С. Смирнов, С.А. Ленин, К.С. Фунташев — разработка методик испытаний, валидация методик; А.А. Костромских — разработка плана валидационных мероприятий; А.С. Перегудова, Д.А. Кадыкова — участие в валидационных мероприятиях; В.А. Меркулов — утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Additional information. Appendices 1, 2, 3 are published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346-annex1

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346-annex2

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346-annex3

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Olga A. Vaganova laborated the concept, drafted and formatted the manuscript. Roman A. Smirnov, Sergei A. Lenin, Kirill S. Funtashev perfomed development and validation of analytical procedure. Anastatsia A. Kostromskih developed validation plan. Alexandra S. Peregudova, Darya A. Kadykova perfomed validation of analytical procedures. Vadim A. Merkulov approved the final version of the article for publication.