Комплексная оценка функционального состояния мочевыделительной системы в доклинических исследованиях. Часть 1. Инструментальные и лабораторные методы оценки (обзор)

ВВЕДЕНИЕ

Одной из основных задач доклинических исследований является оценка безопасности потенциальных фармакологически активных веществ [1][2]. В контексте данной задачи должно быть определено влияние исследуемого препарата на функциональное состояние систем организма и выявлены органы-мишени его возможного токсического действия. В связи с этим возникает проблема выбора методов оценки безопасности препарата в отношении систем и органов.

В настоящее время среди всех представленных на рынке лекарственных средств около 20% обладают нефротоксическим потенциалом, который может быть реализован одним или несколькими общими патогенными механизмами: изменением внутриклубочковой гемодинамики, канальцевой токсичностью, воспалением, кристаллической нефропатией, рабдомиолизом и тромботической микроангиопатией [3][4]. В доклинических исследованиях нефротоксичность выявляется лишь у 8% потенциальных фармакологически активных веществ [3–5]. В то же время для большинства тестируемых препаратов-кандидатов, проявивших нефротоксичность в клинических исследованиях, на доклиническом этапе не было обнаружено их влияния на мочевыделительную систему [6].

Методы in silico и in vitro [7][8] хотя и решают проблему этики — использование большого количества животных в токсикологических исследованиях — и позволяют в некоторой степени прогнозировать безопасность и эффективность изучаемых веществ, но не в полной мере моделируют морфологические и функциональные особенности почки и, следовательно, не способны продемонстрировать комплексную реакцию, схожую с повреждениями in vivo, что в дальнейшем требует осторожной экстраполяции полученных результатов. Используемые в настоящее время стратегии прогнозирования лекарственной нефротоксичности требуют оптимизации для корректной комплексной оценки функционального состояния мочевыделительной системы при разработке и изучении новых лекарственных средств (ЛС) [9]. Так, в регуляторных документах¹ упоминается, что в рамках исследования мочевыделительной системы следует изучить влияние исследуемого вещества на такие показатели работы почек, как объем и плотность мочи, осмоляльность, pH, водно-электролитный баланс, содержание белка в моче, цитологию мочи, а также некоторые биохимические маркеры в крови. Необходим четкий регламент, содержащий ясную и последовательную стратегию оценки нефротоксичности в доклинических исследованиях.

Цель работы — систематизация инструментальных и лабораторных методов оценки функций мочевыделительной системы лабораторных животных и выявление основных принципов изучения нефротоксического действия лекарственных средств.

В обзор включены публикации, доступные для поиска в базах данных PubMed и Google Scholar по состоянию на 16.02.2024. В приоритете были статьи, опубликованные за последние 5 лет.

Обзор не преследовал цели провести сравнительный анализ различных методик исследования и их статистических ограничений. Эта работа призвана обобщить последние достижения в исследованиях потенциального нефротоксического действия лекарственных средств, уделяя особое внимание применимости разных методов в отношении животных разных видов.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Лабораторные методы оценки функций мочевыделительной системы в доклинических исследованиях

Лабораторные методы анализа мочи — наиболее простые для проведения, они достаточно информативны и не стрессогенны для животных. Именно поэтому оптимальным вариантом для начального этапа оценки нефротоксичности ЛС в токсикологических исследованиях является общий анализ мочи с микроскопией осадка.

Важным аспектом при проведении любого лабораторного исследования является метод отбора биоматериала, а также временной интервал с момента забора мочи до момента непосредственного проведения лабораторного теста [10]. Наиболее достоверные результаты получают при сокращении временны́х интервалов [11]. Моча может храниться при комнатной температуре не более 2–3 ч, более длительное хранение в этих температурных условиях приводит к изменению ее физико-химических свойств. Если своевременное проведение исследования невозможно, то допускается хранение образца в холодильнике (+2…+8 °С) в течение 24 ч, также биообразец можно подвергнуть консервации (например, толуолом).

Способы получения мочи зависят от вида лабораторных животных, а также цели и дизайна эксперимента (табл. 1). Идеальный метод сбора мочи должен быть простым, не вызывающим стресса (как для животного, так и для человека), безболезненным и обеспечивающим получение образца надлежащего качества [12].

Отметим, что у грызунов (песчанки, хомяки, мыши, крысы, морские свинки) можно отобрать небольшой объем биоматериала. У кроликов образцы мочи могут быть легко получены методом поглаживания брюшной стенки в области мочевого пузыря. У хищников (хорьки, кошки, собаки), карликовых свиней, приматов зачастую отбор незагрязненных проб мочи проводят с помощью цистоцентеза — под наркозом, с контролем ультразвуковым исследованием [12].

Посмертный способ забора также является приемлемым и несложным методом ввиду отсутствия движения животного и возможности единовременно взять большой объем биообразца. Недостатком отбора мочи непосредственно из мочевого пузыря во время эвтаназии является загрязнение пробы кровью, что может повлиять на проведение анализа и интерпретацию полученных данных [12].

При проведении исследования необходимо учитывать физико-химические особенности мочи разных видов лабораторных животных (табл. 2). Например, моча хомяка густая и кремообразная, но это физиологическая норма, а не пиурия. Почки песчанок чрезвычайно хорошо приспособлены для концентрирования мочи, в которой обычно содержится небольшое количество белка, глюкозы, билирубина и ацетона [12][13].

Для разных видов животных характерен разный цвет мочи в норме, который зависит от концентрации растворенных в ней веществ и пигментов, выделяемых почками. Интенсивность цвета значительно варьируется в зависимости от концентрации мочи, диеты и применяемых лекарственных препаратов. Концентрированная моча имеет темно-желтый цвет, тогда как разбавленная — бледно-желтый. По сравнению со стандартным желтым, более темный желтый цвет наблюдается в случае наличия билирубина и связанных с ним продуктов. Также моча темнеет при продолжительном хранении. Изменение цвета мочи происходит при разных патологических состояниях и часто зависит от присутствия в ней крови (красноватый оттенок), гемоглобина (красно-коричневый цвет), метгемоглобина (черный цвет). Также на цвет мочи могут влиять питание и прием ЛС. Например, при применении фенолов моча становится темной или темно-зеленой, препараты карболовой кислоты изменяют цвет мочи до коричневого или черного, метиленовая синька — до зеленовато-синего. При применении фенотиазина или сульфантрола моча приобретает цвет от желтого до ярко-красного [12][13].

Для оценки помутнения мочи недостаточно ее визуальной оценки, необходимо проведение микроскопического исследования. Наиболее распространенной причиной помутнения мочи является кальциурия, которая в некоторой степени нормальна для грызунов. Другими причинами помутнения мочи могут быть лейкоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, бактерии и слизь.

Инструментальные методы оценки функций мочевыделительной системы

Методы ультразвуковых, рентгенологических исследований и магнитно-резонансная томография позволяют прижизненно получить детальную информацию о работе органа, выявить патологии и оценить влияние различных факторов на его строение и функцию. Использование данных методов параллельно с лабораторными дополняет информацию о структуре и функциональной активности органа, визуализируя его.

В рамках доклинических исследований наиболее доступным методом является ультразвуковое исследование (УЗИ) [43]. Метод позволяет оценить положение органов, их размеры, структуру, эхогенность, а также обнаружить различные аномалии и изменения в режиме реального времени. Посредством УЗИ возможно идентифицировать кисты, которые представляют собой структуры, заполненные жидкостью, и поэтому видны как черные круглые образования в ткани. Гидронефроз качественно распознается как растяжение и дилатация почечной лоханки. Опухолевые образования будут иметь оттенки серого, отличные от окружающих тканей, и, увеличиваясь, будут искажать правильную бобовидную форму почки [44].

Для проведения процедуры необходимо предварительно подготовить животное — ввести его в состояние наркоза и удалить шерстный покров с соответствующей части тела [45]. Для взрослых крыс при ультразвуковом исследовании почек (животное находится в положении лежа на спине), как правило, используют частоты 15–20 МГц, для половозрелых мышей — 30–40 МГц, а для визуализации их эмбрионов используют более высокие частоты — до 50 МГц [45].

У лабораторных кроликов изображения получают при помощи линейного преобразователя частотой 4–8,5 МГц. Для ультразвукового исследования мочевого пузыря и уретры предпочтительно использовать трансабдоминальный доступ, при этом животное должно находиться в положении лежа на спине. Следует отметить, что у кроликов из-за объемного желудочно-кишечного тракта невозможно проводить визуализацию ненаполненного мочевого пузыря, а визуализация почек невозможна в положении лежа на спине, поэтому животное располагается лежа на животе [46].

У кошек и собак мелких пород для исследования рекомендуется использовать высокочастотный датчик — 7,5 МГц и выше, тогда как для исследования почек у крупных собак необходим датчик с большей проникающей способностью (5 МГц и ниже). Исследование можно проводить в дорсальном, левом или правом боковом положении. Для ультразвукового исследования мочевого пузыря и уретры в области лонной кости предпочтительно проводить исследование, используя трансабдоминальный доступ, при этом животное должно находиться в положении лежа на спине [47].

Для проведения УЗИ у карликовых свиней потребуется линейный датчик с большей проникающей способностью (5 МГц и ниже). Для фиксации животное помещается в рестрейнер, лежа на спине. Анестезия используется при необходимости в случае повышенной эмоциональности. Хорошей визуализации поддается мочевой пузырь, а уретра у самцов — только у основания мочевого пузыря. Мочеточники визуализируются плохо [48].

Для исследования яванских макак рекомендуется использовать высокочастотный датчик 7,5 МГц. Исследование проводится под общей анестезией в положении лежа как на правом, так и на левом боку. Мочевой пузырь поддается хорошей визуализации, плохо визуализируется уретра. Мочеточник не виден ни при одном обследовании, даже когда мочевой пузырь полон [49].

Для обеспечения воспроизводимости и упрощения рабочего процесса рекомендуется сохранять настройки для всех режимов визуализации и приложений.

Следует отметить, что ультразвуковое исследование — это экономически доступная процедура, а сам прибор занимает незначительную площадь в лаборатории. Дополнительно возможно проведение компьютерной и магнитно-резонансной томографии, которые в большей степени являются подтверждающими и расширяющими информацию, полученную в ходе ультразвукового исследования.

Патоморфологические методы оценки

Согласно рекомендациям² в стандартный минимальный перечень органов и тканей, подлежащих гистопатологическому исследованию, входят почки и мочевой пузырь. При необходимости перечень может быть расширен за счет включения дополнительных органов-мишеней. В доклинических исследованиях токсичности наиболее надежным доказательством лекарственно-индуцированного поражения почек является выявление дозозависимых повреждений, для чего используют макроскопическое изучение органов, измерение их массы, и микроскопический анализ тканей [50].

Визуально необходимо оценивать размеры, цвет, консистенцию почек, ее капсулу, на разрезе — состояние коркового и мозгового слоев, почечный сосочек, лоханку. Необходимо также принимать во внимание видовые особенности органов. Так, например, карликовым свиньям свойственна гладкая почка с несколькими почечными сосочками и чашечками, в отличие от большинства других лабораторных животных с гладкой однососочковой почкой. Следует отметить важность последующей подготовки материала для гистологического исследования — вырезки фрагментов тканей после фиксации. В микропрепаратах необходимо оценить все структуры почки, особенно почечного сосочка и лоханки, поэтому продольный срез более информативен ввиду увеличения доступной для анализа площади органа [51].

Для рутинного исследования мочеточников и мочевого пузыря производится поперечный срез, проходящий через все оболочки. Так же необходимо учитывать изменения, обнаруженные при макроскопическом исследовании.

Для правильной оценки нефротоксичности крайне важны данные о массе почек, изменение которой часто коррелирует с другими показателями. Множественные патологические процессы при их достаточной тяжести и (или) распространенности могут вызывать изменение массы почек. Например, увеличение массы почек, сопровождающееся отеком и бледностью при обследовании невооруженным глазом, было общепринятым признаком почечной токсичности в течение многих лет.

Масса почек у лабораторных животных, по-видимому, не имеет тесной взаимосвязи с массой тела, как у человека. В токсикологических исследованиях часто наблюдаются незначительные дозозависимые изменения массы почек без каких-либо четких гистопатологических свидетельств клеточных изменений. Во многих случаях это можно рассматривать как функциональные изменения или адаптивные реакции на серьезные физиологические изменения, вызванные введением высоких доз активных фармацевтических веществ, например ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента. Однако умеренное отклонение массы почек следует интерпретировать с осторожностью [50][52]. Именно поэтому гистопатологическая оценка остается важным методом исследования, поскольку незначительные изменения массы почек могут быть связаны с целым рядом различных патологических процессов, таких как дегенерация и некроз почечных канальцев, а также вакуолизация эпителия почечных канальцев, тубулоинтерстициальное воспаление, закупорка нефронов кристаллами [50]. Или, например, гипертрофия нефрона, которая может быть связана с повышенной функциональной нагрузкой, такой как усиление скорости клубочковой фильтрации и изменение потока жидкости в канальцах, что может возникать при диете с высоким содержанием белка, после односторонней нефрэктомии или на фоне приема диуретиков. При этом умеренные степени гипертрофии почечных канальцев может быть трудно распознать на обычных гистологических срезах [53].

Как правило, обычного окрашивания гематоксилин-эозином достаточно для определения места и типа почечного поражения, но в определенных ситуациях могут потребоваться специальные методы окрашивания, такие как импрегнация солями серебра или применение периодической кислоты Шиффа для диагностики небольших малозаметных изменений клубочков и базальных мембран. Для оценки выраженности фиброза используется трихромное окрашивание по Массону или по Ван Гизону, для выявления амилоида — Конго красный, для обнаружения депозитов гемосидерина — окраска по Перлсу, для выявления липидов — Oil Red O и др. [54]. Примеры поражений почек представлены на рисунке 1 «Примеры морфологического проявления нефротоксичности», опубликован на сайте журнала³.

Существует три основных типа патологии, связанной с лекарственно-индуцированной почечной недостаточностью:

• аллергическая дозозависимая реакция, приводящая к тубулоинтерстициальному нефриту;
• дозозависимый острый канальцевый некроз вследствие прямого токсического поражения;
• обструктивная нефропатия вследствие образования кристаллов ЛС или его метаболитов в дистальной части нефрона [55].

Различные полипептидные и белковые антигены могут быть использованы в качестве иммуноцитохимических маркеров при оценке повреждения почек. Одним из примеров является ренин, который присутствует в юкстагломерулярном аппарате и миоэпителиальных клетках почечных артерий и афферентных артериол. Белки Тамма—Хорсфолла (уромодулин), расположенные на поверхностной мембране толстого восходящего ответвления петли Генле, могут быть визуализированы с помощью иммуноцитохимии. Антитела к цитокератинам, десмину и виментину также используются для избирательного окрашивания сегментов нефрона и мезенхимальных клеток. Повреждение подоцитов, по-видимому, может отражаться в экспрессии десмина. Белок цитоскелета α-актин, специфичный для гладкой мускулатуры сосудов и перицитов, присутствует в активированных мезангиальных клетках. Иммуноцитохимические методы могут быть использованы для определения местоположения антигенных сайтов ферментов, включая цитохромы Р450 и γ-глутамилтранспептидазу.

Гибридизацию in situ также можно сочетать с иммуноцитохимией для изучения временных и пространственных взаимосвязей между экспрессией мРНК и белка в нормальной и пораженной почечной ткани. Зонды для определения лизоцима, ингибитора активатора плазминогена-1 (SERPINE1), фактора роста тромбоцитов (PRP), фибронектина, тромбоспадина и мРНК ренина использовались при изучении экспериментального гломерулонефрита и изменений, вызванных лекарственными препаратами. Пероксидаза и меченные флуоресценцией лектины, которые маркируют специфические группы сахаров или последовательности в почках млекопитающих, могут быть использованы для определения структурных компонентов почечной ткани в гистологических срезах, зафиксированных в формалине и залитых парафином. Часто наблюдаются согласованные паттерны окрашивания лектинами в различных сегментах нефрона, хотя они не идентичны у разных видов животных [56].

При гистологическом исследовании почек животных нефротоксичность может быть обнаружена в виде усиленного апоптоза, вакуолизации цитоплазмы эпителия почечных канальцев, дегенерации или дистрофии эпителия, отека, диапедезных кровоизлияний, острого канальцевого некроза (проксимальные канальцы), папиллярного некроза, некроза капсулы Боумена—Шумлянского, возникновения слепков и кристаллов в просвете канальцев, развития гломерулопатий с соответствующими изменениями, а также воспалительных и сосудистых реакций [53]. Развитие тех или иных морфологических изменений зависит от молекулярного механизма действия конкретного препарата. Например, гентамицин вызывает тубулярный некроз, вакуолизацию эпителия проксимальных канальцев, мезангиальную гиперцеллюлярность, пролиферацию гломерулярного эндотелия, отек интерстиция коркового слоя, расширение капилляров и застой крови в них. Ацетаминофен (парацетамол) инициирует развитие острого тубулярного некроза, острого интерстициального нефрита [57].

Хотя биопсия почек широко используется в клинической диагностике, ее редко применяют в экспериментальной работе на животных, особенно на мелких грызунах, поскольку проблемы хирургического повреждения почек и кровотечений в настоящее время являются нерешенными. Основные причины заключаются в том, что биопсию почек животных необходимо проводить при прямом воздействии на почки, объем которых у животных, особенно грызунов, невелик. Таким образом, количество возможных заборов тканей ограничено, а множественные биопсии легко вызывают остаточное повреждение функции почек. Хотя в настоящий момент ведутся работы по усовершенствованию данного метода в доклинических исследованиях и интегрированию его в исследовательскую практику, пока возможность применения биопсий для оценки работы почек лабораторных животных сильно ограничена [58].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен анализ методов оценки функции мочевыделительной системы, используемых в доклинических исследованиях, с точки зрения их информативности, приемлемости для мелких и крупных лабораторных животных, стоимости и сложности постановки. При изучении влияния фармакологически активных веществ на мочевыделительную систему животных необходим рациональный комплексный и поэтапный подход. Применяются различные инструментальные, лабораторные и патоморфологические методы оценки нефротоксичности, каждый из которых обладает как определенными преимуществами, так и ограничениями. Оценку нефротоксичности целесообразно начинать с малоинвазивных лабораторных и инструментальных методов (общий анализ мочи и микроскопия), что позволит определить наличие нарушения функции органа, еще не имеющего сопутствующего анатомического поражения. При более глубоком анализе следует использовать методы гистологического и иммуногистохимического исследований тканей органов мочевыделительной системы животных, а также проводить определение специфических маркеров почечного повреждения.

Дополнительная информация. На сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств» размещен рисунок 1.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-283-294-fig1

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: М.В. Мирошников — сбор, анализ и систематизация данных литературы, написание текста и оформление рукописи; К.Т. Султанова — анализ и обобщение данных литературы, оформление, редактирование и переработка текста рукописи; М.Н. Макарова — идея работы, критический пересмотр текста рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации; Н.М. Фаустова, С.О. Хан, Е.А. Лосева — сбор и систематизация данных литературы.

Additional information. Figure 1 is posted on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-283-294-fig1

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Mikhail V. Miroshnikov collected, analysed, and systematised literature data; drafted and designed the manuscript. Kira T. Sultanova analysed and summarised literature data; designed, edited, and revised the manuscript. Marina N. Makarova conceived the study idea, critically revised the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication. Natalia M. Faustova, Stanislav O. Khan, and Ekaterina A. Loseva collected and systematised literature data.