Понятие трансляционного разрыва заключается в том, что интенсивное развитие фундаментальных биомедицинских исследований на рубеже ХХ и ХХI вв. до последнего времени не сопровождалось пропорциональным увеличением количества инновационных лекарственных препаратов, а также диагностических и лечебных технологий, нашедших применение в клинической практике. Своими мыслями о причинах трансляционного кризиса и путях выхода из него делится директор Института экспериментальной медицины ФГБУ «НМИЦ им. В.А.  Алмазова» Минздрава России доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Михаил Михайлович Галагудза.

ВВЕДЕНИЕ. В Евразийском экономическом союзе (ЕАЭС) в настоящее время отсутствуют руководства по ведению документооборота при доклинических исследованиях (ДКИ). При этом надлежащая регистрация первичных данных необходима для подтверждения качества полученных результатов исследования.

ЦЕЛЬ. Представление одного из возможных вариантов документированного сопровождения доклинического исследования от составления запроса на его выполнение до формирования итогового отчета с дальнейшим переносом данных в регистрационное досье на лекарственное средство.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использован информационно-аналитический метод исследования. Все рекомендации по документированию ДКИ даны в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики ЕАЭС в сфере обращения лекарственных средств, регламентирующими деятельность испытательных центров, выполняющих ДКИ с использованием экспериментальных животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Установлено, что общих рекомендаций ЕАЭС по проведению исследований с использованием экспериментальных животных недостаточно для проведения ДКИ надлежащего качества. Предложен один из возможных вариантов полного документирования ДКИ. Показано соответствие предложенных документов Правилам ЕАЭС по всем этапам исследования. Отмечено, что каждый испытательный центр в рамках собственной системы менеджмента качества должен учитывать особенности конкретного исследования при разработке необходимых форм и документов. Создание того или иного документа должно обеспечивать соблюдение принципов надлежащей лабораторной практики и гарантировать полноту и сохранность информации, полученной в исследовании.

ВЫВОДЫ. Предложенный вариант документооборота может быть использован испытательными центрами при планировании и проведении ДКИ в соответствии с регуляторными требованиями, предъявляемыми к деятельности руководителя исследования и к правилам проведения инспекций со стороны службы качества.

ВВЕДЕНИЕ. Токсикологические исследования лекарственных средств на лабораторных животных — обязательный этап оценки риска применения лекарственных средств, направленный на выявление токсических эффектов, их потенциальной обратимости и зависимости от дозы и (или) системной экспозиции. Основным количественным результатом токсикологических исследований является доза, не вызывающая видимых нежелательных эффектов (NOAEL). Ключевым практическим применением NOAEL является выбор стартовой дозы для ранних фаз клинических исследований. Для выбора NOAEL необходимо четко определить, какие именно изменения следует считать нежелательными. Дизайн токсикологического исследования является сложным и включает в себя широкий спектр оцениваемых параметров: физиологических, инструментальных, клинико-лабораторных, патоморфологических. По окончании эксперимента накапливается большой массив данных, который требуется проанализировать и дать научно обоснованную оценку обнаруженным изменениям.

ЦЕЛЬ. Разработка комплексного подхода к интерпретации данных токсикологических исследований лекарственных средств, направленного на повышение объективности при установлении дозы NOAEL.

ОБСУЖДЕНИЕ. Ввиду отсутствия терминологической строгости в описании дозы NOAEL в работе предпринята попытка по унификации этого термина. Отдельное внимание уделено вопросу биологической значимости наблюдаемых изменений, а также описанию критериев для определения их нежелательности. Разработанная схема интерпретации экспериментальных данных включает три последовательных этапа: анализ взаимосвязи между наблюдаемым эффектом и введением тестируемого объекта; оценка размера эффекта и (или) степени изменений; определение характера выявленных изменений с точки зрения их нежелательности, включая оценку их обратимости, фармакодинамической приемлемости, возможности развития адаптационной реакции и др. Ключевым элементом предложенной методологии является принцип весомости доказательств (Weight-of-Evidence), который позволяет ранжировать выявленные нежелательные эффекты по их значимости и интегрировать их в единую систему оценки.

ВЫВОДЫ. Разработанный комплексный подход, основанный на многофакторном анализе данных (включая количественные и качественные показатели) и принципе оценки весомости доказательств, может повысить объективность оценки наблюдаемых эффектов и определении дозы, не вызывающей видимых нежелательных эффектов (NOAEL).

ВВЕДЕНИЕ. Кровь содержит наибольшее количество активных клеток организма и одновременно является основной мишенью для потенциально токсичных веществ. Перечень биохимических и гематологических параметров, обязательных для контроля у лабораторных животных в ходе доклинических исследований (ДКИ) токсичности, содержащийся в нормативных документах Российской Федерации и международных рекомендациях, недостаточен для прогноза и оценки механизма развития лекарственно-индуцированной гематотоксичности in vivo. Обзор новых данных по этому вопросу и обновление перечня биомаркеров позволит расширить возможности контроля за состоянием лабораторных животных, повысить чувствительность и специфичность оценки токсического воздействия на кроветворение в ДКИ, что будет способствовать повышению безопасности лекарственных средств и эффективности терапии. Обзор состоит из двух частей.

ЦЕЛЬ. Выявление различий органов кроветворения человека и лабораторных животных для разработки рекомендаций по включению показателей для оценки гематотоксичности при проведения доклинических исследований in vivo.

ОБСУЖДЕНИЕ. В первой части обзора охарактеризованы органы кроветворения теплокровных млекопитающих и показаны принципиальные их различия у лабораторных животных и человека. Выделены основные механизмы развития гематотоксичности лекарственных средств: цитотоксическое воздействие на гемопоэтические клетки-предшественники; прямое повреждение зрелых клеток; косвенное повреждение клеток крови или костного мозга вследствие нежелательных иммунных реакций и изменения активности рецепторов клеточной поверхности; изменение активности ферментных систем, необходимых для нормального функционирования клеток; приведены примеры гематотоксического действия лекарственных средств. Обобщены данные по показателям клинического анализа крови 8 видов лабораторных животных: грызунов (мышь, крыса, хомяк, морская свинка) и негрызунов (кролик, макака, карликовая свинья, хорек).

ВЫВОДЫ. Особенности строения и состава тканей и органов кроветворения лабораторных животных по сравнению с человеком могут привести к существенным отличиям токсикологического профиля лекарственного средства, полученного в ДКИ. Клинический анализ крови позволяет оценить значительное количество проявлений гематотоксичности лекарственных средств, оказывающих непосредственное влияние на клетки крови и их предшественников. Однако при косвенном влиянии лекарственного средства (через ферментные системы, воздействие на клетки-предшественники, появление антител и др.) этих данных недостаточно, и для повышения прогностической ценности ДКИ необходимо использование дополнительных биомаркеров.

ВВЕДЕНИЕ. Основной риск низкой транслируемости результатов доклинических исследований препаратов для лечения онкологических заболеваний в клиническую практику базируется на сложности моделирования клинических условий в эксперименте. Всего около 5% из общего числа препаратов-кандидатов оказываются эффективными в клинических условиях, поэтому поиск новых подходов для доклинической оценки эффективности противоопухолевых лекарственных препаратов является одним из актуальных направлений в медицине. ЦЕЛЬ. Анализ и систематизация методов, используемых в доклинических исследованиях эффективности противоопухолевых средств в условиях in vivo, для формирования методической поддержки при планировании экспериментальной работы с моделированием опухолевого процесса.

ОБСУЖДЕНИЕ. Рассмотрены этапы создания опухолевых моделей на животных, выбора клеточных линий, их тестирования на туморогенность и жизнеспособность. Показано, что использование систем визуализации, окраски витальными красителями, флуоресцентного и люминесцентного методов позволяет производить оценку эффективности противоопухолевых препаратов на моделях как солидных, так и гематологических опухолей. Основные разновидности опухолевых моделей на мышах представлены в виде схемы. Показано, что универсальной модели для экспериментального моделирования опухолевых заболеваний in vivo не существует. Особое внимание при выборе моделей и оценке их преимуществ и недостатков следует уделять сходству механизмов заболевания в модели и у человека на тканевом и молекулярном уровнях в зависимости от поставленных задач исследования.

ВЫВОДЫ. Результаты проведенного сравнительного анализа методов доклинической оценки эффективности противоопухолевых средств необходимы для планирования экспериментальных исследований и для обеспечения достоверности получаемых результатов. Правильный выбор метода исследований позволит повысить успех трансляции экспериментальных данных в клиническую практику.

ВВЕДЕНИЕ. Статья является продолжением цикла работ по исследованию фармакокинетики нового соединения для лечения открытоугольной глаукомы 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (TFISA). Распределение данного вещества и его метаболитов по органам и тканям ранее в доклинических исследованиях не изучалось.

ЦЕЛЬ. Валидация методик определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]- фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в биологических образцах. Оценка распределения и тканевой доступности 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в органах и тканях крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследование выполнено на 60 крысах-самцах линии Wistar. Введение TFISA проводили путем закапывания в каждый глаз 40 мкл 1% глазной суспензии (около 3,7 мг/кг). Отбор проб печени, почек, легких, мозга, сердца, селезенки, кожи, мышц, глаз осуществляли через 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 144, 216 ч после инстилляции. На каждую точку использовано по 6 особей. Образцы немедленно гомогенизировали с применением метанола и стабилизировали добавлением аскорбиновой кислоты. Количественное определение TFISA, N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (М1) и N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (М2) в образцах выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Полная валидация методик определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов была выполнена отдельно для тканей глаз и отдельно для других биологических объектов. Тканевая биодоступность (f_t) TFISA уменьшалась в следующей последовательности в диапазоне 13,0–0,7: ткани глаза (место введения и действия) > селезенка > легкие ≥ сердце > печень > почки > мозг > кожа ≥ мышцы. Величина f_t М1 снижалась с 52,0 до 2,5 в ряду селезенка ≥ легкие ≥ сердце ≥ печень > почки > мозг > мышцы ≥ ткани глаза > кожа. Значения f_t М2 были ниже, чем TFISA и M1, и уменьшались с 6,4 до 0,3 в ряду печень ≥ почки > сердце > легкие > ткани глаза > кожа > селезенка ≥ мышцы > мозг.

ВЫВОДЫ. Валидированные биоаналитические методики успешно применены для изучения распределения TFISA и его метаболитов на самцах крыс. Действующее вещество лучше всего проникает в глаза и органы животных с хорошей васкуляризацией. Высокая тканевая биодоступность М1 наблюдается в селезенке, сердце, легких; высокая тканевая биодоступность М2 — в печени и почках крыс.

ВВЕДЕНИЕ. Флавоноиды, содержащиеся во многих видах растений, ингибируют индукцию цитокинов и метаболитов арахидоновой кислоты, которые являются тканевыми медиаторами воспаления, проявляя, таким образом, противовоспалительное действие. Листья ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) и ольхи серой (Alnus incana (L.) Moench.) содержат флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества и могут быть рассмотрены как новый вид растительного лекарственного сырья, использующегося для производства противовоспалительных лекарственных средств.

ЦЕЛЬ. Оценка противовоспалительного действия отваров и гелей, содержащих извлечения из листьев ольхи черной и ольхи серой, на лабораторных животных с использованием различных моделей воспаления.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Противовоспалительную активность водных извлечений листьев ольхи черной и ольхи серой, а также гелей, содержащих их спиртовые извлечения, изучали на моделях генерализованного и локального воспаления, индуцированных введением крысам линии Wistar (самкам и самцам) раствора λ-каррагенана 1%. Оценку противовоспалительного действия при генерализованном воспалении проводили по биохимическим показателям крови (С-реактивный белок, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, γ-глутаматтрансфераза), при локальном воспалении — по изменению объема и масс лап крыс.

РЕЗУЛЬТАТЫ. На модели генерализованного каррагенанового воспаления оценку эффективности водных извлечений листьев ольхи черной и серой проводили на 4 и 7 сутки после введения извлечений. Установлено, что статистически значимо происходило снижение уровня С-реактивного белка у животных, получавших настой листьев ольхи черной и ольхи серой внутрижелудочно. На моделях локального каррагенанового воспаления установлено, что под действием настоев и гелей, содержащих биологически активные вещества листьев ольхи черной и серой, происходило статистически значимое снижение прироста массы и диаметров лап по сравнению с контрольными группами. Индекс ингибирования отека (рассчитанный по массе лап) гелем, содержащим настойку листьев ольхи черной на спирте этиловом 60%, составил 57,95% у самок и 56,53% у самцов; для геля, содержащего настойку листьев ольхи серой на 70% спирте этиловом, — 56,78% у самцов, 52,02% у самок.

ВЫВОДЫ. Доказана противовоспалительная активность водных и спиртовых извлечений из листьев ольхи черной и ольхи серой на моделях генерализованного и локального воспаления. Лекарственные формы (гели), содержащие спиртовые извлечения из листьев ольхи черной и ольхи серой, также обладают противовоспалительным действием в условиях индуцированного локального воспаления.

ВВЕДЕНИЕ. Современные методы определения размеров частиц с необходимой достоверностью позволяют изучить гранулометрический состав лекарственных средств и оценить потенциальные риски при медицинском применении лекарственных препаратов в случае наличия невидимых частиц, особенно это необходимо по отношению к инъекционным, ингаляционным, офтальмологическим формам лекарственных средств. Каждый из известных методов имеет свои особенности и сферу применения.

ЦЕЛЬ. Систематизация методов определения размеров невидимых частиц в лекарственных средствах.

ОБСУЖДЕНИЕ. В работе рассмотрены наиболее часто используемые методы определения размеров частиц и распределения частиц по размерам. Метод лазерной дифракции используется для определения общего количества частиц в образце и распределения частиц по размерам как по общему объему всех частиц, так и по общему количеству всех частиц. Метод динамического рассеяния света — для оценки размеров невидимых диспергированных частиц, взвешенных в растворе. Оба метода основаны на использовании лазерного излучения, рассеянного частицами испытуемого образца, при этом принципы работы оборудования различны. Для определения невидимых частиц, наличие которых нежелательно в лекарственных средствах, предусмотрены счетно-фотометрический метод и метод микроскопии. Метод микроскопии, основанный на подсчете невидимых частиц на поверхности высушенного мембранного фильтра после пропускания через мембрану растворов лекарственных препаратов, используется для определения посторонних невидимых частиц в случае невозможности применения счетно-фотометрического метода. Микроскопический метод с визуализацией потока и метод сканирующей электронной микроскопии не используются для рутинного контроля лекарственных средств, а являются важными дополнительными инструментами для определения особенностей гранулометрического состава и выявления нежелательной контаминации посторонними частицами в лекарственных средствах.

ВЫВОДЫ. Выбор метода зависит от задачи и объекта исследования. При применении каждого из рассмотренных методов следует учитывать тип и размер частиц, технологию лекарственного средства, физико-химические свойства испытуемого образца, скорость анализа, требования к точности метода, наличие оборудования и программного обеспечения, компетенцию персонала. В ряде случаев требуется комбинирование разных методов для получения наиболее достоверных результатов или применение наиболее универсальных способов, в частности микроскопического метода с визуализацией потока, который позволит определить размер, форму, природу невидимых частиц и содержание частиц конкретного размера в общем количестве.

ВВЕДЕНИЕ. Разработка унифицированных методик контроля качества лекарственных средств на основе моноклональных антител (МАТ) является одной из задач стандартизации МАТ.

ЦЕЛЬ. Разработка и анализ возможности применения платформенных (универсальных) методик для оценки содержания примесей высокомолекулярных соединений и фрагментов, негликозилированных молекул в различных МАТ методами эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Лекарственные препараты, содержащие МАТ, 28 различных международных непатентованных наименований российского и иностранного производства. Исследования методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭХ) проводили на приборах Agilent Technologies серии 1200, оснащенных детекторами поглощения в УФ-области. Обработку и анализ хроматограмм осуществляли с помощью программного обеспечения OpenLab. Капиллярный гель-электрофорез (КГЭ) проводили в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием системы PA 800 plus (Beckman Coulter), оснащенной диодно-матричным детектором с поглощением в УФ-области и программным обеспечением Beckman 32Karat.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Подобраны универсальные условия пробоподготовки, хроматографического и электрофоретического разделения и определения содержания целевых соединений в препаратах МАТ, методики апробированы на 28 МАТ. Для каждого МАТ определены времена удерживания и времена миграции пиков целевых соединений. Проведено сравнение данных, полученных по разработанным методикам и по оригинальным методикам производителей МАТ. Проведена валидация методик определения содержания в образцах МАТ высокомолекулярных соединений методом ЭХ, фрагментов МАТ и негликозилированных молекул тяжелых цепей МАТ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях методом КГЭ. Правильность, воспроизводимость и чувствительность методик соответствуют установленным требованиям. Полученные результаты оценки валидационных 

характеристик методики ЭХ: прецизионность (RSD) площадей пиков составила для мономера не более 0,4%, для групп агрегатов до 8%, для общей площади пиков не более 0,4%, для относительной площади пика, соответствующего мономеру, — 0,02%. Линейность методики подтверждена в диапазоне концентраций 0,5–120%, правильность — в линейном диапазоне 99,1–102,1%, предел количественного определения (ПКО) — 0,1%. Валидационные характеристики методики КГЭ: прецизионность не более 1% для содержания основного пика иммуноглобулина или суммы пиков тяжелых и легких цепей и не более 1% для абсолютных времен миграции основных пиков. Линейность методик подтверждена в диапазоне концентраций от ПКО до 300%. Правильность для обеих методик составила 97,6–103,7%, ПКО — 0,5 и 0,75% соответственно.

ВЫВОДЫ. Разработанные методики оценки чистоты препаратов МАТ являются универсальными для неконъюгированных МАТ; по валидационным характеристикам специфичности, прецизионности, предела количественного определения, аналитической области, линейности, правильности соответствуют установленным критериям приемлемости и могут применяться на любом этапе жизненного цикла препаратов указанной группы.

ВВЕДЕНИЕ. Отсутствие пирогенных загрязнений относится к критическим показателям качества лекарственных средств, гарантирующим сохранение жизни и здоровья пациентов. С целью контроля подобных веществ в середине ХХ века в практику был внедрен биологический показатель «Пирогенность», в основе которого лежит оценка реакции кроликов на введение испытуемого образца. Следуя концепции 3R в 2009 г. в Европейскую фармакопею помимо испытания на кроликах включена монография альтернативного метода in vitro — тест активации моноцитов. В отечественную фармакопею данный тест включен в 2018 г. (ОФС.1.2.4.0016.18 «Тест активации моноцитов»). Однако на сегодняшний день метод не получил широкого применения среди производителей ни в России, ни за рубежом ввиду особенностей проведения теста, связанных с потребностью значительного количества человеческой крови для получения моноцитов, с ограниченным выбором наборов реактивов и др. Испытание «Пирогенность» по-прежнему остается востребованным в области определения пирогенных примесей любой природы (бактериальных эндотоксинов и неэндотоксиновых пирогенов). Для более полной гармонизации с европейскими требованиями, реализации концепции 3R, связанной с гуманным отношением к животным, внедрение теста активации моноцитов является одной из приоритетных задач развития системы контроля качества лекарственных средств.

ЦЕЛЬ. Оценка возможности применения теста активации моноцитов в качестве основного для определения неэндотоксиновых пирогенов.

ОБСУЖДЕНИЕ. В статье описаны фармакопейные методы определения пирогенных веществ, детально проанализирован метод определения пирогенов с использованием клеток крови человека — моноцитов. В настоящее время испытание на активацию моноцитов — единственный тест in vitro, позволяющий определять наличие пирогенов любой природы (бактериальные эндотоксины и пирогены неэндотоксиновой природы). Тест является достойным примером реализации стратегии замены испытаний на животных, позволяет определять примеси в случаях, когда контроль с помощью иных методик вызывает сложности или его невозможно выполнить. Главным недостатком, который затрудняет внедрение теста в рутинный контроль, является ограниченная доступность человеческой крови в качестве источника моноцитов. Обсуждены возможные источники моноцитов, которые могут быть применены при определении пирогенности, в том числе клетки крови животных. В соответствии с тенденцией к замене испытания in vivo — «Пирогенность» на альтернативный метод in vitro показана необходимость освоения применения метода при контроле качества биологических и иммунобиологических лекарственных средств.

ВЫВОДЫ. По итогам проведенного теоретического анализа возможности применения метода in vitro в качестве основного для определения в первую очередь неэндотоксиновых пирогенов установлено, что мировое сообщество серьезно настроено на отказ от использования животных. Тест активации моноцитов включен в большинство фармакопей мира, а также в отечественную фармакопею, и рекомендован для выполнения в качестве основного контроля содержания пирогенов в лекарственных средствах.

ВВЕДЕНИЕ. Расширение номенклатуры лекарственного растительного сырья (ЛРС) и разработка стандартов его качества позволяет обеспечить российскую фармацевтическую промышленность новыми источниками биологически активных веществ для создания на их основе эффективных лекарственных препаратов с благоприятным профилем безопасности.

ЦЕЛЬ. Оценка изменений в номенклатуре и требованиях, предъявляемых к качеству ЛРС в Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ).

ОБСУЖДЕНИЕ. ЛРС широко представлено как в зарубежных, так и в российской фармакопеях. Количество фармакопейных статей (ФС) на новые виды ЛРС, а также актуализированных ФС, ранее включенных в Государственную фармакопею (ГФ РФ), растет. Так, в ГФ СССР X изд. входило 45 ФС на ЛРС, ГФ СССР XI изд. – 83 ФС, ГФ РФ XV изд. – 118. Начиная с ГФ РФ XIII изд., были актуализированы 106 ФС и включены 12 ФС на новые виды ЛРС. Для включения нового стандарта качества в ГФ РФ необходим всесторонний анализ ЛРС, начиная с оценки сырьевой базы и заканчивая доказательством терапевтической эффективности и безопасности лекарственных препаратов на его основе и методик контроля качества. Требования, предъявляемые к качеству ЛРС, претерпели изменения: для подтверждения подлинности и в количественном определении все чаще используется анализ биологически активных веществ, обладающих терапевтической активностью; качественные реакции преимущественно заменены инструментальными методами анализа, в первую очередь хроматографическими методами с использованием стандартных образцов действующих веществ или маркеров (активных или аналитических). Для некоторых видов ЛРС проводится идентификация примесей (в том числе недопустимых). Введены предельные нормы содержания токсичных веществ (тяжелые металлы, мышьяк, радионуклиды, остаточные пестициды).

ВЫВОДЫ. Включение в ГФ РФ новых видов ЛРС сопровождается значительным изменением требований к качеству и их актуализацией для видов ЛРС, ранее включенных в фармакопею. Контроль качества ЛРС с использованием новых показателей позволит обеспечить подлинность сырья и повысить безопасность его применения, что в свою очередь позволит расширить номенклатуру эффективных и безопасных лекарственных растительных препаратов.