Моноклональные антитела: разработка платформенных методик оценки примесей высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений

ВВЕДЕНИЕ. Разработка унифицированных методик контроля качества лекарственных средств на основе моноклональных антител (МАТ) является одной из задач стандартизации МАТ.

ЦЕЛЬ. Разработка и анализ возможности применения платформенных (универсальных) методик для оценки содержания примесей высокомолекулярных соединений и фрагментов, негликозилированных молекул в различных МАТ методами эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Лекарственные препараты, содержащие МАТ, 28 различных международных непатентованных наименований российского и иностранного производства. Исследования методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭХ) проводили на приборах Agilent Technologies серии 1200, оснащенных детекторами поглощения в УФ-области. Обработку и анализ хроматограмм осуществляли с помощью программного обеспечения OpenLab. Капиллярный гель-электрофорез (КГЭ) проводили в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием системы PA 800 plus (Beckman Coulter), оснащенной диодно-матричным детектором с поглощением в УФ-области и программным обеспечением Beckman 32Karat.

РЕЗУЛЬТАТЫ. Подобраны универсальные условия пробоподготовки, хроматографического и электрофоретического разделения и определения содержания целевых соединений в препаратах МАТ, методики апробированы на 28 МАТ. Для каждого МАТ определены времена удерживания и времена миграции пиков целевых соединений. Проведено сравнение данных, полученных по разработанным методикам и по оригинальным методикам производителей МАТ. Проведена валидация методик определения содержания в образцах МАТ высокомолекулярных соединений методом ЭХ, фрагментов МАТ и негликозилированных молекул тяжелых цепей МАТ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях методом КГЭ. Правильность, воспроизводимость и чувствительность методик соответствуют установленным требованиям. Полученные результаты оценки валидационных 

характеристик методики ЭХ: прецизионность (RSD) площадей пиков составила для мономера не более 0,4%, для групп агрегатов до 8%, для общей площади пиков не более 0,4%, для относительной площади пика, соответствующего мономеру, — 0,02%. Линейность методики подтверждена в диапазоне концентраций 0,5–120%, правильность — в линейном диапазоне 99,1–102,1%, предел количественного определения (ПКО) — 0,1%. Валидационные характеристики методики КГЭ: прецизионность не более 1% для содержания основного пика иммуноглобулина или суммы пиков тяжелых и легких цепей и не более 1% для абсолютных времен миграции основных пиков. Линейность методик подтверждена в диапазоне концентраций от ПКО до 300%. Правильность для обеих методик составила 97,6–103,7%, ПКО — 0,5 и 0,75% соответственно.

ВЫВОДЫ. Разработанные методики оценки чистоты препаратов МАТ являются универсальными для неконъюгированных МАТ; по валидационным характеристикам специфичности, прецизионности, предела количественного определения, аналитической области, линейности, правильности соответствуют установленным критериям приемлемости и могут применяться на любом этапе жизненного цикла препаратов указанной группы.

1. Lu RM, Hwang YC, Liu IJ, Lee CC, Tsai HZ, Li HJ, et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci. 2020;27(1):1. https://doi.org/10.1186/s12929-019-0592-z

2. Carrara SC, Ulitzka M, Grzeschik J, Kornmann H, Hock B, Kolmar H. From cell line development to the formulated drug product: The art of manufacturing therapeutic monoclonal antibodies. Int J Pharm. 2021;594:120164. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.120164

3. Mou X, Yang X, Li H, Ambrogelly A, Pollard D. A high throughput ultra performance size exclusion chromatography assay for the analysis of aggregates and fragments of monoclonal antibodies. Pharm Bioprocess. 2014;2(2):141–56.

4. Hernández-Jiménez J, Martínez-Ortega A, Salmerón-García A, Cabeza J, Prados JC, Ortíz R, et al. Study of aggregation in therapeutic monoclonal antibodies subjected to stress and long-term stability tests by analyzing size exclusion liquid chromatographic profiles. Int J Biol Macromol. 2018;118(A):511–24. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.06.105

5. Kumar R, Guttman A, Rathore AS. Applications of capillary electrophoresis for biopharmaceutical product characterization. Electrophoresis. 2022;43(1–2):143–66. https://doi.org/10.1002/elps.202100182

6. Zhang J, Burman S, Gunturi S, Foley JP. Method development and validation of capillary sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis for the characterization of a monoclonal antibody. J Pharm Biomed Anal. 2010;53(5):1236–43. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.07.029

7. Kaur H, Beckman J, Zhang Y, Jian Li Z, Szigeti M, Guttman A. Capillary electrophoresis and the biopharmaceutical industry: Therapeutic protein analysis and characterization. TrAC Trend Anal Chem. 2021;144:116407. https://doi.org/10.1016/j.trac.2021.116407

8. Szabo M, Sarkozy D, Szigeti M, Farsang R, Kardos Z, Kozma A, et al. Introduction of a capillary gel electrophoresis-based workflow for biotherapeutics characterization: Size, charge, and N-Glycosylation variant analysis of bamlanivimab, an anti-SARS-CoV-2 product. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:839374. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.839374

9. Rauniyar N. Characterization of product related variants in therapeutic monoclonal antibodies. LCGC Int. 2024;1(6). https://doi.org/10.56530/lcgc.int.ap3874j8

10. Dadouch M, Ladner Y, Perrin C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: Sample preparation, separation and detection. Separations. 2021;8(1):4. https://doi.org/10.3390/separations8010004

11. Li M, Yu C, Wang W, Wu G, Wang L. Interlaboratory method validation of capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) methodology for analysis of mAbs. Electrophoresis. 2021;42(19):1900–13. https://doi.org/10.1002/elps.202170122

12. Alhazmi HA, Albratty M. Analytical techniques for the characterization and quantification of monoclonal antibodies. Pharmaceuticals. 2023;16(2):291. https://doi.org/10.3390/ph16020291