Оценка возможности вычисления средней и минимальной смертельной дозы с помощью модифицированного скрипта для программной среды «R»

ВВЕДЕНИЕ

Средняя смертельная (LD₅₀) и минимальная смертельная доза (LD₁₀) являются важными характеристиками безопасности лекарственных средств (ЛС). LD₅₀ и LD₁₀ определяют при исследовании острой токсичности на основании данных о доле погибших животных при введении ЛС в различных дозах [1–3].

В Государственной фармакопее Российской Федерации описан метод, основанный на пробит-анализе (фармакопейный метод, далее ФМ)¹, позволяющий вычислить значение LD₅₀ и его доверительные границы, а также LD₁₀ без доверительных границ [4][5]. Достоинствами данного метода являются:

• возможность проведения вычислений с помощью электронных таблицбез использования специализированного программного обеспечения;
• отсутствие необходимости придерживаться равных интервалов между отдельными изучаемыми дозами;
• определение доверительных границ LD₅₀(P = 0,95), что позволяет достоверно сравнить и/или объединить результаты испытаний по определению LD₅₀ лекарственных средств.

В некоторых случаях результаты, рассчитанные фармакопейным методом, могут быть нерелевантными: вычисленное значение LD₁₀ может оказаться ниже самой низкой дозы препарата, введенной животным. В таких случаях оправдано использование альтернативных методов вычисления LD₅₀ и LD₁₀, например лицензионного программного обеспечения «CombiStats» [1]. Наиболее рациональным в текущих условиях является использование свободного программного обеспечения, в частности программной среды «R» [6][7].

Цель работы — оценка возможности использования скрипта программной среды «R» для вычисления LD₅₀ и LD₁₀ лекарственных средств.

Задачи работы:

• модификация ранее разработанного скрипта с целью оптимизации его использования (уменьшение количества данных, необходимых для ввода), расширение функционала скрипта (добавление возможности вычисления LD₁₀), оптимизация графического вывода результатов вычисления LD₅₀и LD₁₀;
• сравнение результатов применения фармакопейного метода и модифицированного варианта скрипта для вычисления LD₅₀и LD₁₀ при анализе экспериментальных данных по острой токсичности лекарственных средств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для вычислений по фармакопейному методу² использовали электронные таблицы MS Excel, выполнение модифицированного варианта скрипта (МВС) проводили в свободно распространяемой программной среде «R» (4.4.2 (2024-10-31 ucrt) — “Pile of Leaves”)³, предназначенной для статистических расчетов, а также первичного анализа данных и математического моделирования (далее — «R»).

При запуске «R» на экране появляется основное окно (рис. 1). Слева располагается консоль, в которую вводят команды или вставляют из буфера обмена текст скрипта (красный шрифт), а программное обеспечение выводит результаты (синий шрифт). При необходимости в ходе работы справа выводится графическое окно, в котором отображаются результаты обработки данных. Скрипт⁴ можно создавать и сохранять в любом текстовом редакторе, копировать в буфер обмена и вставлять в консоль «R» для выполнения. Данные, подлежащие обработке, могут входить в состав скрипта или находиться в отдельном файле. Разделитель разрядов в десятичных дробях — точка⁵.

В качестве первичных данных для вычисления LD₅₀ и LD₁₀ с помощью ФМ и МВС были использованы результаты испытаний 50 серий лекарственных средств, поступивших на контроль и экспертизу в лабораторию фармакологии Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств (ИЦЭКЛС) ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России с 2002 по 2023 г.

Проведена оценка правильности результатов вычисления LD₅₀ и LD₁₀ с использованием МВС в сравнении с ФМ согласно нормативным требованиям⁶. Результаты расчетов с использованием ФМ и МВС для одних и тех же данных, полученных в экспериментах по острой токсичности, проанализированы путем регрессионного анализа (функция lm()) в программной среде «R»⁷.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Модификация скрипта для программной среды «R»

Исходный вариант скрипта для вычисления LD₅₀ был предложен S. Young в 2017 г. в комментарии к сообщению Z. Huang⁸. Согласно исходному варианту, данные, полученные при испытании, вносят в электронные таблицы и сохраняют с расширением .csv. В графы "dose", "dead" и "alive" вносят значения доз, число погибших и выживших животных соответственно. Скрипт основан на стандартных функциях «R» и не требует установки пакетов в дополнение к обычному набору по умолчанию.

Текст исходного варианта скрипта представлен на рисунке 2. Первая строка представляет собой ссылку на файл с данными (пример см. на рис. 3с). В строку 21 (объект "xx") вносят дозы, в строку 23 (объект "xp") — интервал, который регулирует границы отображения кривой смертности (реализован в виде функции seq(), генерирующей арифметическую прогрессию, где аргумент .01 означает ее шаг (в данном случае 0,01).

Скрипт копируют в буфер обмена и вставляют в консоль «R». Результаты вычислений выводятся в графическом окне (рис. 3а).

В основе расчета LD₅₀ лежит функция максимального правдоподобия (минимальное значение информационного критерия Акаике (функция AIC()))⁹.

Исходный вариант скрипта S. Young был модифицирован с тем, чтобы добавить возможность вычисления значения LD₁₀, упростить использование и оптимизировать визуальное отображение результатов вычисления LD₅₀ и LD₁₀. В скрипт внесены следующие изменения и дополнения (рис. 4).

1. Добавлен объект "ld10" (строка 14), в который методом ручного подбора вносят значение LD₁₀. Это значение определяется как точка пересечения нижней горизонтальной пунктирной линии с линией смертности (см. пп. 3–5).

2. Модифицирован объект "xp" (строка 25). Внесенные изменения дают возможность автоматически устанавливать границы отображения кривой смертности. Если по результатам работы скрипта кривая не доходит до начальной или конечной точки и/или имеет ломаную форму (рис. 5a), то следует уменьшить шаг функции в 10 раз. Для этого в данной строке изменяют аргумент .01(добавляют по одному разряду), после чего пересчитывают результаты (1).

xp<-seq(log(min(xx)+xoff),log(max(xx)+xoff),.01) (1)

Эту операцию необходимо проводить до тех пор, пока не будут выполнены следующие условия (рис. 5b):

• начало и конец кривой, отображающейся в графическом окне, соответствуют минимальной и максимальной дозе;
• форма кривой сглаженная.

3. Добавлены строки 29 и 30 (функция abline()), отвечающие за вывод в графическом окне горизонтальных пунктирных линий, соответствующих LD₁₀и LD₅₀.

4. Строка 33 (функция points()) отвечает за отображение в графическом окне в виде нижнего символа ○ значения LD₁₀, введенного в объект "ld10" (см. п. 1). Значение в объекте "ld10" подбирают таким образом, чтобы нижний символ ○ оказался на пересечении линии смертности и нижней пунктирной линии (рис. 6).

Опционально в строке 33 (функция points()) после аргумента col="red" может быть добавлен аргумент pch=10. В этом случае точка LD₁₀ визуализируется как символ ⊕ (вместо ○), что позволяет более корректно «вручную» определять точку пересечения нижней пунктирной линии с кривой смертности (2).

points(log(ld10+xoff),.1,col="red",pch=10,cex=2) (2)

Включение в скрипт после строки 16 команды summary(m2) позволяет дополнительно вывести на консоль математические коэффициенты, характеризующие линию смертности, и значение критерия Акаике, в соответствии с которыми вычисляют значения LD₅₀ и LD₁₀. Эти данные при необходимости можно скопировать в буфер обмена и вставить в отчет.

5. Добавлен вывод значений LD₅₀(○) и LD₁₀ (⊕) в численном виде в консоль и на график (левый верхний угол): функции paste(), cat() и legend() (строки 34–42). Из консоли результаты можно скопировать через буфер обмена в электронные таблицы или текстовый редактор. С помощью аргумента digits функции round() (строки 36 и 38) можно регулировать число знаков после десятичного разделителя, до которого следует округлять результаты вычислений (3).

paste("LD50 (мг/кг) =",round(ld50, digits=2)),

paste(";"), (3)

paste("LD10 (мг/кг) =",round((ld10), digits=2)))

Рисунок 3b (графическое окно) иллюстрирует применение МВС к экспериментальным данным.

Для упрощения использования МВС в строке 1 вместо файла электронных таблиц в формате .csv использован текстовый файл с расширением .txt и, соответственно, функция read.table() как основная для считывания данных из таблиц¹⁰ (4).

cf<-read.table("data/LD50.txt", h=T) (4)

Структура текстового файла с данными и электронных таблиц одинакова, за исключением того, что столбцы в текстовом файле разделены знаками табуляции. Аргумент h=T (сокращение от h=TRUE) означает, что первая строка представляет собой названия столбцов таблицы. Запись "data/LD50.txt" (см. (4)) указывает на название файла с данными (ld50.txt) и местонахождение этого файла (папка "data") (команда меню Файл → Изменить папку)¹¹. Папку "data" обычно создают однократно после установки «R» и в дальнейшем используют ее для размещения файлов с данными, подлежащими обработке. Проверить место расположения папки "data" (путь к ней) можно с помощью команды getwd()¹².

Для удобства ввода данные можно сначала внести в электронные таблицы, затем скопировать в текстовый редактор, заменить запятые точками и сохранить файл в вышеуказанной папке с расширением .txt. Также можно скопировать данные из электронных таблиц в уже открытый текстовый файл и сохранить его.

Таким образом, основные отличия процедуры расчета с использованием МВС от исходного варианта скрипта следующие:

• исходные данные представлены в формате .txt, а не .csv(десятичный разделитель разрядов — точка, разделитель столбцов — табуляция);
• в МВС, в отличие от исходного скрипта, вводят значение LD₁₀в объект "ld10" (методом ручного подбора находят значение, при котором символ ⊕ наиболее точно совпадает с точкой пересечения нижней пунктирной линии и кривой смертности);
• отсутствует необходимость корректировки интервала функции seq(), в котором строится кривая смертности (за исключением шага функции);
• полученные значения LD₅₀и LD₁₀ отображаются в левом верхнем углу графика, а также выводятся в консоль, из которой их можно копировать в буфер обмена.

Сравнение результатов применения различных методов определения LD₅₀ и LD₁₀

В испытаниях по определению LD₅₀ и LD₁₀ 50 серий разных ЛС, проведенных ранее с использованием ФМ, значения LD₅₀ варьируют от 0,17 до 15633,05 мг/кг. Во всех случаях значения LD₅₀, вычисленные с использованием МВС, находятся внутри доверительных границ результатов, полученных с помощью ФМ (P = 0,95), что свидетельствует о правильности результатов МВС¹³ (рис. 6).

Регрессионный анализ значений LD₅₀, полученных обоими методами (рис. 7a), показал статистически незначимую систематическую погрешность (6,658420 мг/кг), значимое значение коэффициента регрессии 0,938235 (P = 0,999) и высокий коэффициент детерминации R² = 0,9988. Незначимость систематической погрешности означает, что при одинаковом масштабе осей угол наклона графика практически не отклоняется от 45°, что говорит о незначимости различий между результатами двух методов ввиду отсутствия систематического отклонения¹⁴.

Соответствие значений LD₅₀, полученных с помощью МВС, значениям, полученным с применением ФМ, с учетом доверительных границ, а также результаты регрессионного анализа свидетельствуют о правомерности использования МВС для вычисления LD₅₀ (рис. 7a). Во всех случаях его применение позволяет получить «правильные, то есть свободные от систематической ошибки результаты»¹⁵.

В тех случаях, когда обоими способами были получены корректные значения LD₁₀ (37 испытаний), результаты вычисления LD₁₀ были проанализированы аналогичным образом с помощью регрессионного анализа (рис. 7b).

Выводы принципиально не отличаются от таковых в случае LD₅₀: статистически незначимая систематическая погрешность составила 23,18996 мг/кг, значимое значение коэффициента регрессии 1,19120 (P = 0,999), высокое значение исправленного коэффициента детерминации (R²) 0,9873. Все это свидетельствует о возможности и корректности вычисления LD₁₀ с помощью МВС и получения «правильных, то есть свободных от систематической ошибки результатов»¹⁶.

В нескольких случаях (далее — «сложные случаи») с помощью ФМ были получены значения LD₁₀ ниже самой низкой дозы в испытании (что заведомо некорректно). Эти случаи также отличались экстремальным (наиболее низким или, наоборот, высоким) наклоном кривой смертности по сравнению с другими испытаниями. В этих случаях корректно рассчитать значения данного показателя можно с использованием МВС (рис. 8. «Результаты испытания ряда лекарственных средств, обработанные с помощью электронных таблиц и модифицированного скрипта», опубликован на сайте журнала¹⁷).

Если значение LD₁₀ с помощью ФМ рассчитано некорректно («сложные случаи»), разность между значениями LD₅₀, вычисленными с применением ФМ и МВС по результатам одного и того же испытания, резко возрастает и может достигать 27%, тогда как в обычных случаях она не превышает 8%.

Таким образом, в «сложных» случаях можно рекомендовать руководствоваться значениями LD₅₀ и LD₁₀, полученными с помощью МВС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показана возможность использования модифицированного варианта скрипта для программной среды «R» при вычислении LD₅₀ и LD₁₀ лекарственных средств. Правильность результатов, полученных с помощью МВС для «R» в широком диапазоне доз ЛС, подтверждена отсутствием статистически значимой разности между результатами, полученными с помощью ФМ и МВС, а также линейностью зависимости между результатами, полученными обоими методами.

МВС, основанный на информационном критерии Акаике, можно использовать для получения значений LD₅₀ лекарственных средств (без доверительных границ), а также для вычисления LD₁₀. В частности, МВС можно рекомендовать к использованию в случаях, когда фармакопейный пробит-метод не позволяет получить релевантные результаты LD₁₀ (полученное значение меньше самой низкой из использованных в испытании дозы).

Дальнейшим направлением работы может быть совершенствование алгоритма вычисления LD₁₀ путем замены ручного подбора на автоматическое вычисление этого значения.

Дополнительная информация. Рисунок 8 размещен на сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств».

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-2-213-221-fig8

Вклад авторов. Автор подтверждает соответствие своего авторства критериям ICMJE.

Благодарности. Автор благодарит канд. биол. наук Н.П. Неугодову, канд. биол. наук Т.А. Батуашвили и Е.О. Чечетову за ценные консультации при обсуждении полученных результатов.

Additional information. Figure 8 is published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-2-213-221-fig8

Author’s contributions. The author confirms that he meets the ICMJE criteria for authorship.

Acknowledgements. The author thanks Natalia P. Neugodova, Cand. Sci. (Biol.), Tamara A. Batuashvili, Cand. Sci. (Biol.), and Ekaterina O. Chechetova for valuable consultations during the discussion of the results of the work.