Анализ современных подходов к контролю содержания депрессорных веществ

ВВЕДЕНИЕ

Биологические испытания позволяют выявлять примеси, вызывающие нежелательные реакции организма, которые установить иными способами сложно. Одним из таких анализов является «Испытание на депрессорные вещества». Контроль по данному показателю особенно важен для безопасного применения лекарственных препаратов, получаемых с помощью микробиологического синтеза, например антибиотиков, ферментов, а также лекарственных средств (ЛС), которые получают из тканей и (или) органов животных. В случае нарушения технологии их производства или условий хранения сырья высок риск образования депрессорных примесей в субстанциях.

Депрессорные (гистаминоподобные) примеси — это вещества, способные в силу своих фармакологических свойств вызывать снижение артериального давления при внутрисосудистом введении. К ним относятся биологически активные вещества, имеющие разную химическую природу, в первую очередь — гистамин. В ЛС они присутствуют в незначительных количествах, но биологически активны даже в минимальных концентрациях.

С целью контроля содержания депрессорных веществ в ЛС в середине XX в. в ведущие фармакопеи мира был включен биологический метод для определения гистаминоподобных примесей на кошках. В настоящее время внедряемые в исследовательскую деятельность принципы гуманного использования животных в научных исследованиях (принципы 3R) предполагают поиск и разработку альтернативных методов контроля качества ЛС без использования животных.

Препятствием к исключению из Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) биологического показателя «Испытание на депрессорные вещества» является отсутствие полноценной замены методики контроля. Методика in vivo основывается на анализе реакции сердечно-сосудистой системы кошки, а именно изменения артериального давления в ответ на введение растворов гистамина в качестве стандарта и образцов испытуемого препарата. Данный вид животных обладает наиболее высокой чувствительностью к гистамину и подобным примесям по сравнению с другими видами [1][2]. Существующие физико-химические методы в настоящее время не позволяют обнаружить в рамках одного эксперимента весь спектр гистаминоподобных примесей, поэтому ведутся поиски разных методов, позволяющих произвести данную оценку. Для решения вопроса о применении или исключении биологического показателя необходимо всестороннее рассмотрение.

Цель работы — анализ российских и международных подходов к контролю содержания депрессорных веществ в биологических ЛС. Рассмотрение возможности применения инструментальных физико-химических методов определения гистаминоподобных примесей в качестве альтернативных биологическим методам с целью сокращения количества испытаний на животных.

В обзор включены публикации, доступные к прочтению на порталах PubMED, ScienceDirect, NCBI. Для проведенного информационного анализа были использованы российские и зарубежные нормативные источники и методические руководства по оценке безопасности ЛС¹.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Подходы к контролю гистаминоподобных веществ

В настоящее время единое мнение о необходимости выполнения биологического испытания на депрессорные вещества в мире отсутствует. Одни страны используют биологический метод как основной для контроля гистаминоподобных примесей, например Китай, Корея, Индия, Россия. Другие, такие как Япония, некоторые страны Европы, находятся на стадии его исключения и поиска альтернативных способов.

Так, в Китае, который является одним из лидеров по объемам производства фармацевтических субстанций биологических ЛС, в первую очередь гепаринов, исследование на наличие примесей, обладающих гипотензивным действием, проводят около 5000 испытаний на кошках в год [3]. В то же время Европейская фармакопейная комиссия в ноябре 2023 г. приняла решение о начале работ по исключению общих монографий для определения гистаминоподобных примесей — Histamine (2.6.10) и Depressor Substances (2.6.11) из Европейской фармакопеи (Ph. Eur.), а также о пересмотре частных статей, в которых есть ссылки на данные методы². Чтобы обеспечить контроль по данным показателям после исключения их из фармакопеи, в некоторых частных монографиях Европейской фармакопеи в разделе Production (Производство) появилось указание, что «для производства ЛС используются методы, позволяющие не допускать или снижать до минимума содержание депрессорных веществ»³. В монографии 04/2022:1468 Products of fermentation (Продукты ферментации) в разделе Down-stream processing (Последующая обработка) указано, что для очистки субстанций можно использовать различные процессы только в случае подтверждения, что выбранный способ позволяет исключить содержание гистамина и подобных веществ или минимизировать их. Взамен общих монографий 2.6.10 и 2.6.11 предполагается разработать раздел «Гистамин в активных веществах», в который будут включены физико-химические и иммунохимические методы идентификации гистамина⁴.

Согласно Фармакопее США (USP) используют метод определения содержания гистамина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)⁵. Методика была разработана для гентамицина сульфата, при внутривенном введении которого начиная с 2015 г. был зафиксирован рост нежелательных реакций [4]. Этот антибиотик получают путем ферментации Micromonospora purpurea, в качестве питательной среды используется субстрат с добавлением рыбного пептона — источника аминокислот и, в частности, гистидина. С одной стороны, такой богатый белком субстрат способствует активному росту микроорганизмов, что важно для промышленной ферментации, с другой стороны — при возможных нарушениях в технологическом процессе, например стерильных условий, из аминокислоты гистидин в результате реакции декарбоксилирования под действием L-гистидиндекарбоксилазы образуется гистамин [5]. Наличие свободного гистамина в ЛС опасно и приводит к спазму гладких мышц (включая мышцы бронхов и сосудов), расширению капилляров и понижению артериального давления, застою крови в капиллярах и увеличению проницаемости их стенок, выделению адреналина и учащению сердечных сокращений, вызывает отек окружающих тканей и сгущение крови⁶.

Помимо ВЭЖХ используют ЯМР-спектроскопию, которая позволяет сравнивать структурные особенности исследуемых образцов со стандартным образцом, например для идентификации субстанций эноксапарина и далтепарина [4].

На территории России первым шагом по сокращению применения биологического теста было утверждение ОФС «Испытание на гистамин» в ГФ РФ, где в качестве тест-объекта используют фрагмент подвздошной кишки морской свинки. Затем при пересмотре ОФС «Испытание на депрессорные вещества» в ОФС 1.2.4.0008.18 проведение испытания было регламентировано только для лекарственных препаратов, предназначенных для внутрисосудистого введения, и субстанций, из которых их производят, с целью контроля содержания гистамина в ЛС. В результате пересмотра ОФС «Испытание на депрессорные вещества» в 2018 г. (ГФ РФ XIV изд.) была опубликована новая редакция ОФС 1.2.4.0008.18, где проведение испытания было регламентировано только для лекарственных препаратов, предназначенных для внутрисосудистого введения, и субстанций, из которых их производят. Одним из этапов сокращения количества применений теста стало решение об отмене испытания для готовой лекарственной формы, если тест «Испытание на депрессорные вещества» входит в перечень показателей нормативной документации для контроля субстанции. Требования по-прежнему распространяются на субстанции природного происхождения, используемые для изготовления лекарственных форм для внутрисосудистого введения, которые в своем составе могут иметь или получать в процессе производства примеси, обладающие депрессорным действием (субстанции микробиологического или животного происхождения)⁷.

В ГФ РФ XV изд. включены частные фармакопейные статьи на семь субстанций, содержащие показатель «Испытание на депрессорные вещества»: ФС.2.3.0007 Гепарин натрия, ФС.2.1.0404 Даунорубицина гидрохлорид, ФС.2.1.0674 Доксициклина гиклат, ФС.2.1.0417 Доксорубицина гидрохлорид, ФС.2.1.0429 Канамицина сульфат кислый, ФС.2.1.05.07 Митомицин, ФС.2.3.0002 Эноксапарин натрия.

В настоящее время экспертами ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России выполняется научно-исследовательская работа по теме «Гармонизация подходов к стандартизации лекарственных средств с требованиями современных этических норм GLP и обоснование перехода от биологических и неселективных методик к высокоспецифичным инструментальным аналитическим методам», которая, в частности, направлена на разработку аналитических методик определения содержания депрессорных примесей в лекарственных формах. Параллельно с этим ведется теоретический анализ результатов испытаний образцов, прошедших экспертизу по показателю «Испытание на депрессорные вещества», за последние 10 лет с целью оценки необходимости и актуальности внедрения испытания для каждого конкретного ЛС.

Опыт применения физико-химических методов для определения депрессорных веществ

Основным инструментом, который позволяет сократить количество примесей, является надлежащее качество производства и наличие строгого контроля всех стадий, особенно тех, где высок потенциальный риск появления загрязнений. Для изучения качества, состава и подлинности лекарственных препаратов в лабораториях и на производстве применяют метод ВЭЖХ, который позволяет идентифицировать не только активное вещество, но и возможные известные примеси. Главной задачей при разработке хроматографической методики является выбор условий анализа для каждого определяемого соединения индивидуально. Преимуществом использования данного метода является отсутствие лабораторных животных в качестве тест-системы, использование минимального количества образца, получение результатов через короткий промежуток времени⁸. За счет высокой чувствительности и специфичности именно данный метод рассматривается как основной метод определения примесей гистамина и ему подобных веществ в качестве альтернативы биологическому.

Рассмотрим опыт применения физико-химических методов на примере препаратов гепарина для внутрисосудистого введения, так как они относятся к самой большой группе ЛС животного происхождения. Впервые в чистом виде препарат был получен в 1922 г. из печени (hepar)⁹. На сегодняшний день гепарины производят из легких крупного рогатого скота или слизистой кишечника свиней, что представляет риск наличия гистаминоподобных примесей, связанный с особенностями производства. В тучных клетках соединительной ткани животных всегда содержатся и обновляются медиаторы — гликозаминогликаны, такие как гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат А и С, а также биогенные амины гистамин, серотонин и другие биологически активные соединения, участвующие в синтезе и секреции медиаторов [5]. Риск потенциального загрязнения гистаминоподобными веществами происходит на стадии ферментативного гидролиза. Учитывая медицинские области применения — хирургия и кардиология, наличие такого побочного эффекта, как депрессорное действие, недопустимо. В программу контроля качества данных препаратов входит обязательное испытание на депрессорные вещества.

Осенью 2007 г. в результате применения партии нефракционированного гепарина, изготовленного из субстанции, загрязненной неизвестной примесью, погибло более 200 человек, в основном жителей США и Германии. У пациентов на фоне проведения гемодиализа наблюдалась резкая гипотония, явившаяся причиной летального исхода. Перед тем как гепарин поступил на рынок, он прошел стандартный контроль по всем показателям качества (биологические загрязнители, включая белки, липиды, ДНК; идентификация, тяжелые металлы и т.п.) [6][7]. Несмотря на проведенный анализ, выполненный в соответствии с нормативной документацией, не было обнаружено никаких отклонений от других партий гепарина. При дальнейшем изучении с привлечением ряда современных физико-химических методов удалось установить, что причина трагедии заключалась в присутствии в препаратах примеси — сверхсульфатированного хондроитинсульфата, который получают синтетическим путем сверхсульфатирования природного хондроитинсульфата А. Поскольку сверхсульфатированный хондроитинсульфат проявляет антикоагуляционную активность, загрязненные образцы гепарина прошли скрининг коагуляции цельной крови, проводимый производителем [8]. Механизм действия данной примеси отличается от традиционного гистаминоподобного, основанного на связывании с гистаминовыми рецепторами. Сверхсульфатированный хондроитинсульфат активирует кинин-калликреиновую систему, которая приводит к выработке брадикинина, обладающего депрессорным действием, вследствие чего происходит расширение сосудов и резкое падение давления. Кроме того, хондроитинсульфат индуцирует образование белков комплемента (C) C3a и C5a — мощных анафилатоксинов [8]. Согласно литературным источникам, примесь была добавлена к уже готовой субстанции с умышленной целью фальсификации продукции [9][10]. В течение нескольких месяцев проводились дополнительные исследования партий гепарина, обладающих нежелательными депрессорными реакциями, и с помощью спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопии) удалось обнаружить и идентифицировать примесь [7].

Параллельно с изучением аналитическими методами (капиллярным электрофорезом, методом оптического вращения, ЯМР, ВЭЖХ) проводили исследования in vivo на свиньях, которым вводили чистый гепарин и загрязненный сверхсульфатированным хондроитинcульфатом [8]. Было показано, что у половины животных, которым вводили загрязненный гепарин, наблюдалось снижение артериального давления на 30% в течение первых 30 мин после инфузии, причем одно животное оставалось в гипотензивном состоянии более 15 мин. В группе, которой вводили контрольный препарат (чистый гепарин), снижения артериального давления не наблюдали. Дополнительно исследовали реакцию животных на введение чистого сверхсульфатированного хондроитинасульфата, которая оказалась более выраженной со стороны снижения не только артериального давления, но и частоты сердечных сокращений [8].

Этот случай наглядно показал, что в настоящее время отсутствует физико-химический метод, который способен полностью заменить биологическое испытание с использованием животных. Примесь не была обнаружена, поскольку выходной контроль проводился лишь физико-химическими методами, которые не подходят для определения неизвестной неожидаемой примеси. Принцип биологической методики состоит в системном действии испытуемых образцов на организм млекопитающего животного, метаболизм которого схож с человеческим. Поэтому метод in vivo является неспецифичным и, следовательно, больше подходит для качественного анализа обнаружения гистаминоподобных примесей.

Для обеспечения безопасности цепочки поставок гепарина Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств США (Food and Drug Administration, FDA) рекомендовало дальнейшую разработку дополнительных физико-химических методик для анализа чистоты гепарина [11]. С 2013 г. Министерством здравоохранения США совместно с FDA опубликованы несколько руководств для производителей ЛС гепаринов, в которых описаны рекомендации по контролю качества в соответствии с фармакопейными требованиями и стандартами¹⁰.

Производственные процессы, включающие стадию ферментации, менее контролируемы, следовательно, при исключении показателя «Испытание на депрессорные вещества» необходимо подтверждать качество ЛС по содержанию этих веществ иными аналитическими методами¹¹. Принимая во внимание увеличение числа новых производственных площадок, а также появление большого количества воспроизводимых препаратов, необходимо обеспечить безопасность применения выпускаемой продукции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ показал, что, несмотря на разное отношение стран к использованию животных в испытаниях, контроль гистаминоподобных примесей востребован и необходим. Основываясь на опыте стран, не применяющих испытание на кошках, в Российской Федерации приступили к разработке физико-химических методик контроля депрессорных примесей. Однако о полном исключении биологического метода из ГФ РФ говорить преждевременно.

В настоящее время для сокращения проведения контроля качества с использованием теста «Испытание на депрессорные вещества» применяется индивидуальный подход:

• в случае контроля активной фармацевтической субстанции по данному показателю выполнение контрольного теста для готовой лекарственной формы не требуется, так как эти примеси могут образовываться только в субстанции;
• в случае доказательства отсутствия иных примесей, кроме гистамина, для его идентификации возможно использование метода ВЭЖХ в различных модификациях, разработанного для конкретного ЛС. В настоящее время проводятся исследования по разработке методики определения гистамина в препаратах гепарина.

Высокотехнологичный контроль с помощью чувствительных физико-химических методов, а также развитие и внедрение надлежащей производственной практики (GMP), которое способствует выпуску ЛС более высокого качества, позволят обоснованно говорить о полном отказе от использования биологической методики.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.О. Чечетова — сбор, анализ и систематизация литературных данных; анализ международных требований к тесту «Испытание на депрессорные вещества», формулировка выводов, редактирование текста рукописи; Т.А. Батуашвили — сбор и анализ экспериментальных данных, участие в формулировании выводов; критическое обсуждение и редактирование текста рукописи; Н.П. Неугодова — основная идея работы, редактирование текста рукописи, критическое обсуждение и утверждение окончательного варианта статьи для публикации.

Благодарности. Коллектив авторов благодарит О.В. Ваганову и Д.Н. Королева за ценные консультации при обсуждении результатов работ.

Authors’ contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Ekaterina O. Chechetova collected, analysed, and collated literature data; analysed international requirements for the test for depressor substances; formulated conclusions; and edited the manuscript. Tamara A. Batuashvili acquired and analysed experimental data, formulated conclusions, and critically discussed and edited the manuscript. Natalia P. Neugodova conceived the main idea of the study, critically discussed and edited the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication.

Acknowledgements. The team of authors thanks Olga V. Vaganova and Dmitry N. Korolev for valuable advice in the discussion of the results of this work.