Стандартизация метода определения остаточных органических растворителей (обзор)

ВВЕДЕНИЕ

Органические растворители применяют при синтезе широкого спектра фармацевтических субстанций, вспомогательных веществ или при производстве лекарственных препаратов. Присутствие растворителей в конечном продукте нежелательно, в основном из-за их токсичности, влияния на терапевтическую активность, запах и (или) вкус лекарственных средств. Для удаления органических растворителей используют различные технологические процессы. Однако даже после проведения таких процессов растворители в небольших количествах остаются в продуктах производства [1][2]. Все фармацевтические субстанции, вспомогательные вещества и лекарственные препараты, в производстве которых используются или образуются летучие вещества, не полностью удаляющиеся из конечного продукта, подлежат контролю на содержание остаточных органических растворителей (ООР).

Методы контроля примесей делят на две группы: биологические испытания и физико-химические методы. С помощью физико-химических методов определяют органические примеси, неорганические примеси и остаточные растворители. Для оценки фактического и (или) потенциального наличия органических примесей необходимо проводить объемные работы: изучение процессов синтеза, очистки и хранения; разработку аналитических и экспериментальных методик для определения содержания, токсичности и фармакологического действия. Токсичность неорганических примесей и большинства остаточных растворителей установлена, поэтому возможно использование как фармакопейных, так и нефармакопейных валидированных методик. Таким образом, в соответствии с предписаниями фармакопей производитель обязан разрабатывать и валидировать методики определения ООР.

Лекарственные средства не должны содержать ООР больше, чем это предусмотрено данными по безопасности¹. Традиционно для контроля токсичности лекарственных средств, в том числе обусловленной присутствием ООР, проводят in vivo испытание на аномальную токсичность. Количественный in vitro контроль примесей современными физико-химическими методами может позволить исключить неспецифические испытания на животных, такие как «Аномальная токсичность». Тренд на исключение показателя «Аномальная токсичность» обусловлен такими недостатками метода, как: высокая вероятность ложноположительных результатов, низкая для рутинного контроля качества лекарственных препаратов эффективность, несоответствие международным требованиям к валидации методик и испытаний, необходимость использования в рутинном контроле большого количества животных [3].

Первым аналитическим методом определения ООР, введенным в фармакопеи, был метод «Потеря в массе при высушивании». Данный метод прост в исполнении и проводится при нормальном давлении, однако имеет ряд недостатков, включая отсутствие специфичности, высокий предел обнаружения (около 0,1%), необходимость в относительно большом количестве образца для проведения анализа (около 1–2 г); изменения атмосферной влажности также могут исказить результаты анализа [4].

На текущий момент основным методом определения ООР является газовая хроматография (ГХ) с использованием насадочных и капиллярных хроматографических колонок. Чаще для контроля ООР применяют капиллярные колонки благодаря их высокой разделительной способности. Разработку и валидацию новых аналитических методик определения ООР методом ГХ в ряде лекарственных средств продолжают до сих пор² [5–7].

В случае использования в производстве лекарственных средств растворителей только третьего класса токсичности для контроля качества лекарственных средств может быть достаточно провести испытание «Потеря в массе при высушивании» или специфичное определение растворителя. Растворители первого и второго классов токсичности обычно определяют с применением ГХ.

В Государственную фармакопею Российской Федерации (ГФ РФ) включена ОФС.1.1.0008 «Остаточные органические растворители», которая не содержит описания хроматографических методик и нуждается в актуализации с учетом мировой фармакопейной практики.

Цель работы — анализ мировой фармакопейной практики и методологических подходов к контролю остаточных органических растворителей для подготовки проекта общей фармакопейной статьи «Остаточные органические растворители».

Задачи исследования:

• сравнительный анализ требований ведущих зарубежных фармакопей, Фармакопеи ЕАЭС и ГФ РФ к контролю ООР в лекарственных средствах и вспомогательных веществах;
• определение основных направлений разработки проекта ОФС «Остаточные органические растворители»;
• выявление требований к проведению хроматографического анализа содержания ООР, необходимых для включения в нормативные документы.

Исследование было проведено информационно-аналитическим методом. Литературная база источников состоит из научных статей (2003–2024 гг.), доступных для поиска в РИНЦ и Scopus. Ключевые слова поиска: примеси, остаточные органические растворители, газовая хроматография, парофазный анализ, дериватизация, методики контроля качества. Объектной базой исследования послужили фармакопеи: Европейская фармакопея (Ph. Eur.), Фармакопея США (USP), Фармакопея Евразийского экономического союза (ЕАЭС) и ГФ РФ³.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Ph. Eur., USP, Фармакопея ЕАЭС и ГФ РФ содержат информацию о классификации ООР по степени риска, пределах содержания ООР и методах их установления, допустимых суточных дозах и методах их установления. Оценка допустимого содержания ООР основана на максимальной суточной дозе действующего вещества. Также в фармакопеях (за исключением ГФ РФ) описаны методики и хроматографические системы, используемые для проведения идентификации, установления предельного содержания и количественного определения ООР. Монографии Фармакопеи ЕАЭС и Ph. Eur.⁴ гармонизированы между собой, между монографиями Ph. Eur. и USP⁵ существует ряд отличий.

1. Согласно Ph. Eur. оценка пригодности хроматографической системы А или хроматографических систем А и Б всегда проходит на этапе идентификации ООР классов 1 и 2. Для системы А отношение «сигнал/шум» для пика 1,1,1-трихлорэтана должно быть не менее 5, а разрешение между пиками ацетонитрила и дихлорметана не менее 1,0. Для системы Б отношение «сигнал/шум» для пика бензола должно быть не менее 5, а разрешение между пиками ацетонитрила и 1,1,2-трихлорэтилена не менее 1,0. В USP для проведения испытаний на предельное содержание, когда ООР уже идентифицированы, предложены другие критерии пригодности хроматографической системы. Для системы А в случае отсутствия 1,1,1-трихлорэтана отношение «сигнал/шум» для любого другого растворителя должно быть не менее 3. Если используют более одного растворителя, разрешение между интересующим пиком и любым соседним пиком должно быть не менее 1,0. Для системы Б в случае отсутствия бензола отношение «сигнал/шум» для любого другого растворителя должно быть не менее 3. Если используют более одного растворителя, разрешение между интересующим пиком и любым соседним пиком должно быть не менее 1,0.
2. Стандартный образец (СО) для растворителей класса токсичности 2 в Ph. Eur. отсутствует, поэтому для приготовления стандартного раствора предлагают взять «соответствующие количества растворителей класса 2». На типичной хроматограмме такого стандартного раствора представлены пики 25 ООР. Согласно методике, представленной в монографии USP, используют два СО: смесь А (смесь 17 ООР класса 2 в диметилсульфоксиде (ДМСО))⁶ и смесь B (смесь 8 ООР класса 2 в ДМСО)⁷, получая в итоге две хроматограммы. При этом в соответствии с USP для испытаний на предельное содержание ООР в случае, если заранее известен возможный состав растворителей, при приготовлении стандартных растворов используют только СО этих растворителей.
3. В USP приведены методики количественного определения растворимых и не растворимых в воде ООР, также представлены формулы для вычисления содержания ООР (в ppm). В Ph. Eur. отсутствуют методики количественного определения ООР, но указана возможность использования метода стандартных добавок, если содержание ООР классов токсичности 2 или 3 составляет 0,1% и более.
4. В USP в перечне ООР класса токсичности 2 отсутствуют циклопентилметиловый эфир и трет-бутиловый спирт, а в перечне ООР класса токсичности 3 — 2-метилтетрагидрофуран. Данные растворители были включены в Ph. Eur. изд. 10.7 с целью приведения монографии в соответствие с руководством Международного совета по гармонизации технических требований к лекарственным средствам для медицинского применения (ICH) Q3C (R8)⁸.
5. Несколько различаются предлагаемые рабочие параметры статического парофазного анализа. Температура линии подачи газовой пробы для методики пробоподготовки испытуемых образцов, в которых известно или предполагается присутствие N,N-диметилацетамида и (или) N,N-диметилформамида, по Ph. Eur. составляет 105 ºС, по USP — 80–90 ºС; время пребывания под давлением — по Ph. Eur. 30 с, по USP — не менее 60 с.

В действующей ОФС.1.1.0008 «Остаточные органические растворители» ГФ РФ, в отличие от аналогичных монографий зарубежных фармакопей, отсутствуют методики идентификации, установления предельного содержания и количественного определения ООР. Отсутствие методик не позволяет унифицировать подходы к контролю ООР. Поэтому, ориентируясь на положения монографии Ph. Eur.⁹, в проект ОФС «Остаточные органические растворители» были включены хроматографические методики контроля ООР, в том числе указаны параметры хроматографических систем: температура и время уравновешивания, температура линии передачи, время достижения требуемого давления, объем пробы. Для введения пробы предусмотрен метод статической парофазной экстракции (headspace), который имеет ряд преимуществ по сравнению с вводом жидкой пробы [8][9].

Статический парофазный анализ состоит из нескольких этапов. Исходный образец помещают в виалу, которую термостатируют при определенной температуре. Летучие соединения переходят из образца в газовую фазу над ним в соответствии со значениями коэффициентов распределения в системе «пар — конденсированная фаза» для каждого конкретного соединения. Через некоторое время система переходит в состояние равновесия, при котором концентрация летучего аналита в газовой фазе остается постоянной. Затем аликвота газовой фазы с потоком газа-носителя попадает в хроматографическую колонку, где и происходит разделение. Такой подход позволяет минимизировать влияние матрицы, а также понизить предел обнаружения летучих соединений в составе исследуемого образца [10][11].

Определяющими условиями проведения статического парофазного анализа являются растворитель испытуемого образца и способ переноса пробы. Растворитель влияет на чувствительность, температуру и время уравновешивания. Наиболее часто используемыми растворителями при анализе газохроматографическим методом являются вода, ДМСО и их смесь. Использование смеси вода–ДМСО позволяет увеличить растворимость многих соединений, а также повышает чувствительность метода за счет концентрирования целевых компонентов [12].

Перенос пробы в колонку может быть осуществлен вручную; с помощью газоплотного шприца; автоматически путем нагнетания давления во флакон с пробой и контролируемого по времени или объему переноса аликвоты в инжектор. Могут быть также использованы твердофазная микроэкстракция или дополнительные адсорбционные ловушки, служащие для очистки летучих аналитов от избытка газа-носителя перед прохождением пробы через ГХ-колонку [13].

Упомянутые в тексте статьи хроматографические системы и режимы парофазного анализа будут приведены в проекте ОФС и могут быть использованы:

1) для идентификации большинства ООР классов токсичности 1 и 2, если ООР неизвестны;

2) для проведения испытания на предельное содержание ООР класса 1 и класса 2;

3) для количественного определения ООР класса 2, если их предельные значения превышают 1000 ppm;

4) для количественного определения ООР класса 3, если их содержание превышает 0,5%.

В проекте ОФС будут представлены две хроматографические системы с делением потока: система А и система Б. Для каждой системы будут даны подробные характеристики хроматографической колонки и неподвижной фазы, указаны соотношение деления потоков, линейная скорость, газ-носитель, тип используемого детектора, а также температурные режимы колонки, инжектора и детектора соответственно. В конце раздела, посвященного аналитическим методикам, будет представлен алгоритм процедуры определения ООР и оценки соответствия их содержания допустимым пределам.

При валидации методик хроматографии необходимо провести оценку их устойчивости (робастности) — способности аналитической методики быть устойчивой к влиянию небольших задаваемых изменений в условиях проведения испытания, которая указывает на ее надежность при обычном (стандартном) использовании.

В соответствии с ГФ РФ, Фармакопеей ЕАЭС, руководством по валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств и USP¹⁰ типичными параметрами вариации для газовой хроматографии являются различные колонки (разные серии и поставщики); температура; скорость газа-носителя.

Ни в одной из рассмотренных фармакопей не определены четкие критерии критически важных изменений и изменений, не требующих контроля. Например, в разделе «Представление результатов валидации» ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» ГФ РФ указано, что протокол валидации должен содержать полное описание методики, достаточное для воспроизведения и отражающее все условия, необходимые для выполнения анализа. В USP¹¹ указано, что типичным параметром вариации в том числе является использование различного оборудования. Такие формулировки не позволяют однозначно определить, какое описание оборудования, используемого в ГХ, будет необходимым и достаточным для воспроизведения и отражения всех условий выполнения анализа. Это может приводить к отказу производителя от исследования робастности на нескольких типах оборудования и обобщению вывода о воспроизводимости методики независимо от использованного оборудования.

Некорректный выбор оборудования, например типа системы ввода, может привести к изменению чувствительности и селективности методики и, как следствие, получению недостоверных результатов [14]. Таким образом, применение в испытательных лабораториях различных систем ввода пробы, отличающихся от тех, которые использовались производителем, может привести к трудностям при воспроизведении методики, основанной на применении метода headspace.

При разработке методик определения ООР, основанных на применении метода headspace, необходимо, по возможности, учитывать свойства определяемых компонентов и использовать способы пробоподготовки, позволяющие их нивелировать. Одним из таких способов, позволяющих улучшить воспроизводимость методик определения ООР методом ГХ, является дериватизация. Можно выделить несколько основных целей использования дериватизации в ГХ:

• снижение температуры кипения вещества. Замена активных (полярных) атомов водорода в анализируемом веществе может приводить к снижению его полярности и увеличению летучести;
• увеличение разрешения. В некоторых случаях дериватизированные аналиты, полученные добавлением специфических соединений к близким по химической природе веществам, могут существенно отличаться друг от друга по свойствам, что позволяет проводить разделение. Также дериватизация может создавать более существенные различия между аналитами и компонентами матрицы. Данный прием часто используют для разделения хиральных молекул [15][16];
• улучшение формы пика аналита за счет минимизации вторичных взаимодействий хроматографической колонки с частью молекул аналита;
• повышение стабильности соединения путем защиты определенных групп в анализируемом веществе.

Химические реакции, используемые в дериватизации, могут быть классифицированы следующим образом:

(1) реакции с образованием алкильных или арильных производных;

(2) реакции силилирования;

(3) реакции с образованием ацильных производных;

(4) реакции присоединения к углерод-гетерократным связям;

(5) реакции с образованием циклических соединений;

(6) другие реакции, специфичные для определенного анализа.

Следует, однако, отметить, что все дополнительные операции, проводимые с испытуемым образцом или аналитом, в том числе и дериватизация, могут стать источником ошибок.

В фармацевтическом анализе дериватизацию при проведении ГХ обычно используют для повышения летучести анализируемых компонентов, например жирных кислот, однако также ее можно использовать для улучшения воспроизводимости методик определения некоторых ООР методом ГХ. Так, например, определяют муравьиную кислоту в виде этилформиата, получаемого методом предколоночной дериватизации этанолом в присутствии паратолуолсульфокислоты [17].

ВЫВОДЫ

1. Установлена необходимость включения в ГФ РФ методик определения ООР методом ГХ.
2. Установлено, что монографии ЕАЭС и Ph. Eur. гармонизированы между собой, а между монографиями Ph. Eur. и USP существует ряд отличий. Предложено для разработки положений ГФ РФ в части методик контроля ООР, в том числе описания хроматографических систем, исходить из положений соответствующей монографии Фармакопеи ЕАЭС.
3. При разработке методик определения ООР необходимо предусмотреть учет влияния конфигурации системы ввода проб на воспроизводимость. Предложено включение дериватизации пробы в качестве одного из способов улучшения воспроизводимости методик определения некоторых ООР.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: О.Г. Корнилова — концепция работы, редактирование текста рукописи; Е.А. Смирягин — написание текста рукописи, формулировка выводов и поиск литературных источников; В.Л. Багирова — утверждение окончательной версии рукописи для публикации; М.А. Сумцов — критический пересмотр текста рукописи, утверждение окончательной версии рукописи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Olga G. Kornilova conceptualised the study and edited the manuscripT. Egor  A. Smiryagin drafted the manuscript, formulated the conclusions, and conducted literature search. Valeria L. Bagirova approved the final version of the manuscript for publication. Mikhail A. Sumtsov critically revised the manuscript and approved the final version of the manuscript for publication.