Совершенствование микробиологических методик анализа качества нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием

ВВЕДЕНИЕ

Инциденты, связанные с контаминацией лекарственных средств (ЛС) микроорганизмами, были зафиксированы еще в 60-х годах ХХ века и, к сожалению, продолжаются до наших дней¹, что требует от производителей фармацевтической продукции, экспертов и представителей контрольных органов особого внимания к микробиологическому качеству ЛС. В 2024 г. в Федеральный закон Российской Федерации «Об обращении лекарственных средств» были внесены изменения, согласно которым была обозначена необходимость определения микробиологических характеристик лекарственных средств, в том числе фармацевтических субстанций².

Методики оценки микробиологических показателей качества ЛС (стерильность и микробиологическая чистота) утверждены в Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ) и Фармакопее Евразийского экономического союза (ФЕАЭС)³, микробиологические методики для анализа конкретных лекарственных препаратов (ЛП) в случае необходимости описываются в нормативной документации и, как правило, обосновываются валидационными (верификационными) исследованиями, представленными в регистрационных досье на ЛП. В соответствии с положениями фармакопей⁴ первым этапом испытания ЛС, в том числе высокотехнологичных лекарственных препаратов, по показателям «Стерильность» или «Микробиологическая чистота» является оценка влияния непосредственно ЛП на рост минимального количества определенных микроорганизмов с целью доказательства применимости методики анализа. Выявленное влияние определяется как антимикробное действие ЛС, которое может быть одной из основных возможных причин получения ложноотрицательных результатов анализа качества ЛС [1] и отражает особенности используемых субстанций, вспомогательных веществ, а также технологический процесс производства [2].

Ранее вопросы, связанные с изучением антибактериального и противогрибкового действия ЛС и с различными способами его нейтрализации, уже обсуждались [3][4], однако в связи с развитием фармацевтической микробиологии необходимы пересмотр и модификация методик анализа с целью повышения точности и достоверности результатов анализа.

Цель работы — разработка методического подхода к определению микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств, обладающих антимикробным действием, повышение точности и надежности существующих методик микробиологического анализа.

Задачи исследования:

• определение антимикробного действия некоторых ЛС;
• определение подходов к совершенствованию испытания в отношении содержания аэробных микроорганизмов и дрожжевых и плесневых грибов и модификация условий методик определения микробиологического качества;
• модификация методики выделения Escherichia coliиз ЛС, обладающих антибактериальным действием в отношении указанного микроорганизма;
• оценка применимости различных разбавителей ЛС в качестве неспецифических инактиваторов для нейтрализации антимикробного действия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лекарственные средства. В работе использовали ЛС 12 международных непатентованных наименований: безопрокт, мазь для ректального и наружного применения; протаргол (серебра протеинат), порошок для приготовления раствора для местного применения; вегадерм, мазь для наружного применения 0,5+1,0+10,0 мг/г (бетаметазон+гентамицин+ клотримазол); уксусная кислота, субстанция-раствор; формагель, гель для наружного применения 3,7%; амлодипин, таблетки 10 мг; хлоропирамин, таблетки 25 мг; дротаверина гидрохлорид, субстанция-порошок; альфа-липоевая кислота, субстанция-порошок; периндоприл+амлодипин 10 мг+10 мг, таблетки; эстриол, крем вагинальный 1 мг/г; итраконазол, капсулы 100 мг.

Тест-штаммы микроорганизмов. Escherichia coli ATCC 8739; Bacillus subtilis ATCC 6633; Staphylococcus aureus АТСС 6538; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; Candida albicans ATCC 10231; Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

В работе использовали микробиологические питательные среды, в том числе триптиказо-соевый агар (TSA); агар Сабуро (SDCA); триптиказо-соевый бульон (ТSB); маннитно-солевой агар; цетримидный агар; агар Эндо-ГРМ для выявления энтеробактерий; разбавители: раствор натрия хлорида 0,9%⁵, фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном (рН 7,0) (ФБР)⁶ с полисорбатом-80 (1 или 5%), нейтрализующая жидкость⁷.

Используемое оборудование. Инкубаторы BD-240 и КB-115 (Binder); ламинарный шкаф (Labconco); счетчик колоний Scan 100 (Interscience); микроскоп стереоскопический Olympus BX41; весы лабораторные электронные Сартогосм СЕ 623-С (ООО «Сартогосм»).

Методы исследования. Экспериментальное исследование проводили по методикам определения антимикробного действия и микробиологической чистоты, указанным в ОФС.1.2.4.0002.18 «Микробиологическая чистота» ГФ РФ XIV изд., ОФС 2.1.6.6 «Микробиологические испытания нестерильных лекарственных средств: общее количество аэробных микроорганизмов» Фармакопеи ЕАЭС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рассмотрим случай, когда установленное противогрибковое действие нестерильных ЛС нейтрализуется дополнительным разведением образца в 100 раз, а применять такое разведение для посева 1 мл в стандартные чашки Петри диаметром 90 мм нецелесообразно, так как нормативные требования в отношении количества дрожжевых и плесневых грибов составляют не более 10 КОЕ/г (мл).

Для получения достоверного значения содержания дрожжевых и плесневых грибов использовали стерильные чашки Петри увеличенного размера (150 мм в диаметре), в каждую из которых вносили по 10 мл образца из разведения 1:100, что по количеству анализируемого вещества соответствовало стандартному объему 1 мл из разведения 1:10. Дополнительное разведение 1:100 нейтрализовало выявленное противогрибковое действие рассматриваемых ЛС, а внесение в каждую чашку Петри по 10 мл образца позволило получить достоверный результат, соответствующий в пересчете 1 г ЛС. Согласно методике испытания для роста возможных грибов-контаминантов использовали агар Сабуро в количестве 50 мл на каждую чашку Петри при посеве, а затем выполняли инкубацию в стандартных условиях.

На основании полученных значений количества дрожжеподобных и плесневых грибов рассчитывали коэффициенты прорастания микроорганизмов (К_пр) по формуле (1) (табл. 1). Коэффициенты прорастания Candida albicans составляли 76–101%, Aspergillus brasiliensis — 82–128%, что является допустимым согласно ФЕАЭС⁸.

(1)

где N и N₀ — средние арифметические числа колоний на чашках Петри с исследуемым и с контрольным образцом соответственно.

Рассмотренный в настоящем исследовании подход может быть реализован в тех случаях, когда антибактериальное действие ЛС сохраняется в разведении 1:1000 при допустимом пределе содержания аэробных микроорганизмов 1000 КОЕ/г. При отсутствии роста после внесения 10 мл из разведения 1:10000 на чашку Петри диаметром 150 мм можно дать заключение следующего содержания: в 1 г испытуемого ЛС — менее 1000 КОЕ микроорганизмов, что соответствует требуемым нормативам.

В некоторых случаях при оценке показателя «Микробиологическая чистота», согласно нормативным требованиям⁹, необходимо установить отсутствие E. coli в образце ЛС. Этот микроорганизм, относящийся к семейству энтеробактерий, является санитарно-показательным, может служить критерием соблюдения правил надлежащей производственной практики при фармацевтическом производстве. E. coli необходимо выделять:

• из твердых (неводных) и жидких препаратов для приема внутрь (категория 3А);
• из ЛП природного происхождения, уровень микробной загрязненности которого невозможно снизить в процессе предварительной обработки (категория 3Б);
• из готовых смесей для лечебных кормов, применяемых в ветеринарии, с использованием наполнителей природного происхождения, для которых противомикробная обработка невозможна (категория 3В);
• из фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ синтетического и природного происхождения для производства нестерильных ЛП (категории 3.2 и 2.2).

Оценка микробиологического качества ЛС, обладающих антимикробным действием в отношении E. coli, затруднена. Для решения этой задачи нами был предложен подход, состоящий в нейтрализации антимикробного действия препарата путем увеличения объема анализируемого образца ЛС до 50 мл в разведении 1:50, при котором нейтрализуется антимикробное действие. Увеличенный объем (50 мл) образца лекарственного препарата вносили в 450 мл питательной среды (триптиказо-соевого бульона). Результаты, полученные при апробации данной методики на примере пяти ЛС (амлодипин, таблетки; периндоприл+амлодипин, таблетки; хлоропирамин, таблетки; дротаверин, субстанция; липоевая кислота, субстанция), обобщены в таблице 2 и демонстрируют целесообразность увеличения объема разведения образца (например, до 50 или 100 мл) и объема питательной среды (до 450 или 900 мл) пропорционально количеству образца, которое должно составлять не менее 1 г (мл). Условия методик определения микробиологического качества лекарственных средств, обладающих и не обладающих антимикробным действием, приведены в таблице 3.

Нами было проведено сравнение пяти различных разбавителей с целью оценки их применимости в качестве неспецифических инактиваторов для нейтрализации антимикробного действия. Так, для нейтрализации бактериостатического действия экстриола, крем вагинальный, и фунгистатического действия итраконазола, капсулы 100 мг, были апробированы два разбавителя без инактиваторов (ФБР и TSB) и три разбавителя, содержащие в составе неспецифические инактиваторы: полисорбат-80 (1 или 5%), яичный (или соевый) лецитин (0,3% в составе нейтрализующей жидкости), гистидина гидрохлорид (0,1% в составе нейтрализующей жидкости). Полученные результаты представлены в таблице 4 «Результаты нейтрализации антимикробного действия лекарственных препаратов эстриол, крем вагинальный, и итраконазол, капсулы 100 мг, с использованием различных разбавителей», опубликованной на сайте журнала¹⁰.

Разведения от 1:10 до 1:50 препарата эстриол, крем вагинальный, в ФБР, ФБР с 1% полисорбатом-80 и TSB не могут быть применены для выявления грамположительных (B. subtilis и S. aureus) и грамотрицательных (E. coli) бактерий. К_пр составляет 0–48%. При добавлении в разбавитель полисорба-80 в количестве 5% или применении нейтрализующей жидкости, в состав которой согласно нормативным актам¹¹ входит 3% полисорбата-80, К_пр возрастает до 88%. Применение разбавителя, содержащего 1 или 5% полисорбата-80, для нейтрализации противогрибкового действия итраконазола, капсул, положительно сказывается на К_пр дрожжевых и плесневых грибов. Использование фосфатного буферного раствора и триптиказо-соевого бульона в качестве разбавителя не позволяет выявить A. brasiliensis.

ВЫВОДЫ

1. Предложен методический подход к определению микробиологической чистоты ЛС, основанный на том, что результаты определения анализа следует считать достоверными только с учетом антимикробного действия испытуемого образца.
2. На примере различных лекарственных форм (мазь, гель, порошок и др.), обладающих антимикробным действием в минимально возможном разведении (1:10), показана целесообразность увеличения количества образца до 10 мл из разведения, в котором антимикробное действие отсутствует (1:50). Для посева рекомендовано использовать чашки Петри диаметром 150 мм и 50 мл соответствующей агаризованной питательной среды.
3. Показана применимость следующих условий оценки микробиологической чистоты:

• использование разведения, при котором антимикробное действие отсутствует;
• увеличение количества образца пропорционально вносимому в питательную среду до регламентированного фармакопеями количества — не меньше 1 г (мл).

4. Рекомендовано использование разбавителей, содержащих в составе до 5% полисорбата-80, для инактивации бактериостатического и фунгистатического действия.

Дополнительная информация. Таблица 4 размещена на сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств».

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-362-369-tabl

Вклад авторов. Авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Г.М. Булгакова — экспериментальное выполнение исследования, участие в обсуждении результатов и редактировании текста рукописи; О.В. Гунар — идея выполнения исследования, участие в обсуждении результатов, написание и редактирование текста рукописи.

Additional information. Table 4 is posted on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-362-369-tabl

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Galina M. Bulgakova conducted experiments, participated in the discussion of the study results and editing of the manuscript. Olga V. Gunar conceived the idea of the study and participated in the discussion of the study results and drafting and editing of the manuscript.