Количественное определение основных компонентов в лекарственных препаратах полимиксина В методом ЯМР-спектроскопии

ВВЕДЕНИЕ

Полимиксин В, входящий в группу природных полипептидных антибиотиков, продуцируемых штаммами Paenibacillus polymyxa, обладает широким спектром активности против многих грамотрицательных бактерий. В медицинской практике полимиксин В в виде сульфата используется с 60-х годов прошлого века, однако в 80-х годах данный антибиотик практически был выведен из медицинской практики из-за его высокой нефро- и нейротоксичности и в связи с появлением более безопасных и эффективных антибактериальных препаратов [1]. В последнее десятилетие врачи вновь вернулись к использованию полимиксина В из-за широкого распространения инфекций, вызванных полирезистентными грамотрицательными микроорганизмами (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii и др.), устойчивыми не только к цефалоспоринам, аминогликозидам и фторхинолонам, но и к карбапенемам. Данные микроорганизмы не обладают резистентностью к полимиксину В (возможно, из-за ограничения его применения): резистентность Pseudomonas aeruginosa составила 1,3%, Acinetobacter spp. — 2,1%, Citrobacter spp., Escherichia coli и Klebsiella spp. — менее 2% [2]. Помимо использования в качестве антибиотика его применяют при терапии сепсиса для сорбции эндотоксинов в крови [3].

Полимиксин В — смесь родственных соединений, из которых наиболее активными компонентами являются полимиксины В1, В2, В3 и В1-I. По химической структуре каждый из них представляет собой циклический гептапептид с трипептидным ациклическим заместителем, соединенным с ацильной алифатической цепью (рис. 1).

Согласно фармакопейным требованиям суммарное содержание полимиксинов В1, В2, В3 и В1-I в используемых в клинической практике препаратах полимиксина В сульфата должно быть не менее 80%, при этом содержание В3 и В1-I не должно превышать 6 и 15% соответственно¹. Индивидуальное содержание В1 и В2 не нормируется. Принято считать, что эти компоненты обладают одинаковой биоактивностью. Однако исследования последних лет показали, что соотношение компонентов В1 и В2 в полимиксине В существенно влияет на его фармакокинетику, фармакодинамику и токсикокинетику [4–6], на основании чего был сделан вывод о необходимости ужесточить стандартизацию основных компонентов полимиксиновых смесей, доступных в настоящее время для клинического применения, или разработать более безопасные однокомпонентные полимиксиновые липопептидные препараты с четкой фармакокинетикой [5][7].

Стандартизация полимиксина В сульфата по индивидуальному содержанию компонентов В1, В2, В3, B1-I невозможна без мониторинга компонентного состава различных образцов полимиксина В с последующим обобщением полученной информации. Как правило, определение компонентного состава полимиксина В сульфата проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ² или масс-детектором [1][8][9]. Из-за отсутствия стандартных образцов отдельных компонентов полимиксина В применяют метод внутренней нормализации. Следует отметить, что применение внутренней нормализации в методе ВЭЖХ не всегда корректно, так как интенсивность хроматографического сигнала зависит не только от концентрации компонента, но и от его сорбционных свойств. Актуально при оценке компонентного состава полимиксина В сульфата использовать метод, в котором свойства соединения не влияют на интенсивность его сигналов. Таким методом является метод ЯМР-спектроскопии³ [10][11]. Данный метод успешно применяется для определения состава природных многокомпонентных антибиотиков [12].

Цель работы — оценка индивидуального содержания нормируемых компонентов В1, В2, В3, B1-I в препаратах полимиксина В методом ЯМР-спектроскопии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовали стандартный образец полимиксина В сульфата для микробиологических исследований Европейской фармакопеи (EDQM СRS, кат. № Y0000355) (I), лекарственные препараты «Полимиксин В, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» (Jodas Expoim, (II)), «Полимиксин В, порошок для приготовления раствора для инъекций» (ПАО «КрасФарма») различных серий (III и IV).

Были использованы следующие реактивы: дейтерированные вода-D2 (Cambridge Isotope Laboratories, кат. № DLM-4-99.8-1000) и 3-(триметилсилил)-пропионат натрия-D4 (ТСП, Cambridge Isotope Laboratories, кат. № DLM-48-1), натрия сульфат (99,99% Merck, кат. № 1.06649-1000), ацетонитрил для ВЭЖХ (Thermo Fisher Scientific, кат. № A/0627/17), фосфорная кислота (85%, Sigma-Aldrich, кат. № 438081).

Измерения методом ЯМР. Около 20 мг полимиксина В сульфата (точная навеска не обязательна) растворяли в 0,5 мл дейтерированной воды с добавлением следовых количеств ТСП и переносили в ЯМР-ампулы. Регистрацию спектров проводили на ЯМР-спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 (США) с 5-мм мультиядерным датчиком, оснащенным градиентной катушкой, используя программное обеспечение VNMRJ, версия 4.2. Параметры 1D экспериментов: температура — 27 °С, ширина спектра — 6009,6 Гц (¹Н) и 37878,8 Гц (¹³С), угол поворота намагниченности — 45°, время задержки между импульсными последовательностями — 5 с (¹Н), 3 с (¹³С), количество накоплений сигнала спада свободной индукции — 8 (¹Н) и 16000 (¹³С), число точек аналого-цифрового преобразования — 64 К, экспоненциальный коэффициент аподизации по Лоренсу — 0,3 Гц (¹Н) и 2 Гц (¹³С), дополнение нулями 64 К, автоматическая коррекция базовой линии спектра, ручная настройка фазы, калибровка шкалы химических сдвигов (δ) под сигнал триметилсилильной группы ТСП (δ=0,00 м.д.). Цифровое разрешение на ядре ¹Н 0,09 Гц. Регистрацию двумерных спектров ¹H-¹Н gCOSY, ¹H-¹Н TOCSY, ¹H-¹³C gHSQC, ¹H-¹³C gHMBC проводили с применением стандартных параметров. Мольные доли полимиксинов В1, В2, В3, B1-I в анализируемых образцах определены методом нормализации интегральных интенсивностей сигналов соответствующих структурных фрагментов их молекул. Нормализованные интегральные интенсивности измеряли в пяти повторностях.

Измерения методом ВЭЖХ проводили по фармакопейной методике⁴ (методики, приведенные в Фармакопее США и Европейской фармакопее, одинаковы), используя ВЭЖХ-хроматограф Agilent 1200 с диодно-матричным детектором на колонках ACE 3 C18-HL (150×4,6 мм, размер частиц 3,5 мкм). Для приготовления испытуемых образцов 50 мг полимиксина В растворяли в 100 мл деионизованной воды. Для исключения возможной разницы в поглощении разных компонентов полимиксина В сульфата анализ проводили как при длине волны детектирования 215 нм (указана в фармакопейной методике⁵), так и при 200, 205, 210, 220, 225 и 230 нм с усреднением результатов анализа для всех длин волн. Для каждого раствора полимиксина В получали не менее трех хроматограмм. Мольное соотношение содержания основных компонентов раствора полимиксина В рассчитывали как долю площади каждого пика в сумме площадей 4 пиков, выраженную в процентах.

Статистическую обработку результатов, полученных методами ЯМР и ВЭЖХ, осуществляли с помощью программы Microsoft Office Excel 2010 с установленным пакетом «Анализ данных».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Количественное определение компонентного состава сложной смеси методом ЯМР невозможно без предварительной структурной идентификации одномерных спектров (¹Н, ¹³С) анализируемого образца и выбора для каждого компонента характеристических сигналов, которые не пересекаются с другими сигналами в спектре. Нормализованные интегральные интенсивности характеристических сигналов компонентов соответствуют мольной доле каждого компонента в анализируемом образце.

Структурное соотнесение сигналов спектров ¹Н и ¹³С образцов I–IV проводили на основе комплексного анализа результатов двумерных экспериментов (¹H-¹Н gCOSY, ¹H-¹Н TOCSY, ¹H-¹³C gHSQC, ¹H-¹³C gHMBC). В таблице 1 «Спектральные характеристики полимиксина В1» (опубликована на сайте журнала)⁶ представлено структурное соотнесение сигналов спектров ¹Н и ¹³С полимиксина В1, содержание которого в анализируемых образцах максимально.

Следует отметить, что в спектре ¹Н практически все сигналы анализируемых компонентов полностью или частично перекрываются, также наблюдается наложение сигналов различных структурных фрагментов, входящих в состав индивидуальных соединений, по этой причине в таблице 1⁷ не приведены мультиплетность и значения констант спин-спинового взаимодействия сигналов протонов. Сигналы олигопептидного остова компонентов В2, В3 и B1-I практически совпадают с таковыми в В1 за исключением изолейцинового фрагмента в B1-I (табл. 2 «Спектральные характеристики изолейцинового фрагмента в полимиксине В1-I», опубликована на сайте журнала⁸).

Все химические сдвиги сигналов алифатической ациламидной цепи в В1 и В1-I совпадают, кроме сигналов ¹³С метиленового фрагмента С(3)Н₂ (28,40 и 28,32 для В1 и В1-I соответственно). Для В2 и В3 наблюдаются небольшие различия в спектральных характеристиках 6-метилгептамидного (В2) и октамидного (В3) фрагментов (табл. 3 «Спектральные характеристики ациламидного фрагмента в полимиксинах В2 и В3», опубликована на сайте журнала⁹).

В спектре ¹³С выявлены характеристические сигналы, присущие каждому из полимиксинов В1, В2, В3 и B1-I, которые могут служить спектральными маркерами их присутствия в анализируемом образце (рис. 2):

В1, δ, м.д.: 28,40 (C(3)H₂);

В2, δ, м.д.: 28,90 (C(3)H₂), 40,66 (C(5)H₂), 29,94 (C(6)H), 24,72 (C(7)H₃ и R¹);

В3, δ, м.д.: 28,09 (C(3)H₂), 26,84 (C(5)H₂), 33,76 (C(6)H₂), 16,22 (R¹);

В1-I, δ, м.д.: 28,32 (C(3)H₂), 17,68 (R⁴), 13,37 (С(41)Н₃).

Следует отметить, что оценку мольных долей нормируемых компонентов полимиксина В необходимо выполнять по характеристическим сигналам, принадлежащим к однотипным углеводородным фрагментам молекул компонентов, так как интенсивность сигналов ¹³C, полученных с развязкой от протонов, зависит не только от концентрации вещества, но и от числа водородных заместителей при углеродном атоме. В данной работе мы ограничились нормируемыми интегральными интенсивностями сигналов С(3): 28,40 (B1), 28,90 (В2), 28,09 (В3), 28,32 (B1-I).

Результаты определения содержания полимиксинов В1, B2, B3, B1-I в образцах методами ЯМР и ВЭЖХ представлены в таблице 4. Значения содержания нормируемых компонентов в образцах полимиксина В, определенные методами ЯМР и ВЭЖХ, практически совпадают с учетом доверительных интервалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований показали возможность использования ¹³С ЯМР-спектроскопии для идентификации нормируемых компонентов полимиксина В и определения их количественного содержания в препаратах полимиксина В сульфата без использования стандартных образцов. Совпадение результатов определения мольных долей полимиксина В1, В2, В3 и В1-I методами ЯМР-спектроскопии и ВЭЖХ доказывает отсутствие различий в сорбционных свойствах компонентов полимиксина В и корректность применения метода внутренней нормализации при определении нестехиометрического состава полимиксина В методом ВЭЖХ.

Дополнительная информация. На сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств» размещены таблицы 1–3.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-744-table

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Н.Е. Кузьмина — идея, планирование исследования, анализ данных литературы, систематизация и обобщение экспериментальных данных, подготовка и оформление текста рукописи; С.В. Моисеев — пробоподготовка образцов, проведение экспериментальных исследований методом ЯМР, систематизация и обобщение экспериментальных данных, редактирование текста рукописи; И.Ю. Якупов — проведение экспериментальных исследований методом ВЭЖХ; С.И. Кулешова — ответственность за все аспекты работы, включая надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с достоверностью данных и целостностью всех частей статьи.

Additional information. Tables 1–3 are published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-744-table

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Nataliya E. Kuz’mina conceived the study idea, designed the study, analysed literature data, systemised and interpreted the experimental data obtained, and drafted and formatted the manuscript. Sergey V. Moiseev prepared samples, conducted the NMR experiments, systemised and interpreted the experimental data obtained, and edited the manuscript. Ilya Yu. Yakupov conducted the HPLC experiments. Svetlana I. Kuleshova agreed to be accountable for all aspects of the work and for ensuring that all questions related to data reliability and article integrity are appropriately investigated and resolved.