Одним из вопросов, стоящих перед фармацевтической промышленностью в связи с необходимостью импортозамещения, является поиск местных источников лекарственного растительного сырья (ЛРС). Трава золотарника канадского (Solidago canadensis L.), сорного и инвазивного растения на территориях Республики Беларусь и Российской Федерации [1], может оказаться перспективным сырьем для разработки лекарственных растительных препаратов, содержащих флавоноиды и обладающих противовоспалительными и диуретическими свойствами [2–5].

Большую долю готовых лекарственных форм фитопрепаратов занимают настойки, сиропы, твердые лекарственные формы, которые получают из сухих экстрактов [6]. Одним из вариантов повышения эффективности использования ЛРС и выхода биологически активных веществ (БАВ) при получении экстракционных лекарственных форм (в том числе из сухих экстрактов) является предварительная обработка ЛРС термическим воздействием, обезжириванием и путем их комбинаций [7]. В связи с этим целесообразно разработать технологию получения экстракционных лекарственных форм (настоек, экстрактов), включающую предварительную обработку золотарника канадского травы.

Цель работы — разработка технологии получения экстракционных лекарственных форм (настойка, экстракт) из золотарника канадского травы (Solidago canadensis L.), включающей этап предварительной обработки, позволяющей увеличить содержание флавоноидов.

Объектом исследования являлась золотарника канадского трава, заготовленная от дикорастущих форм в фазу массового цветения в августе-сентябре 2018–2022 гг. в местах естественного произрастания в Беларуси в окрестностях д. Новое поле (Минский р‑н), д. Ольгово (Витебский р‑н), д. Заречье (Бобруйский р‑н) и высушенная воздушно-теневым способом (потеря в массе при высушивании не превышала 8–10%).

Настойки. Настойки получали методами мацерации; бис- и ремацерации; мацерации и последующей ультразвуковой экстракции; мацерации и последующим механическим перемешиванием.

При получении настоек методом мацерации изучали влияние на выход флавоноидов: объемной доли этанола (50, 60 и 70%) [8]; длительности настаивания (1–14 сут); соотношения сырье (г) : водный раствор этанола (мл) (1:5, 1:10, 1:25, 1:50 и 1:100); степени измельчения сырья (размер частиц сырья, который проходит сквозь ячейки сита соответствующего размера: 2000, 1000 и 500 мкм); длительности отстаивания первичной вытяжки (1–14 сут). Настойку фильтровали через фильтр «белая лента», отжимали сырье, вытяжку оставляли при температуре не выше 10 ºС и после отстаивания фильтровали в емкость из темного стекла.

Интенсификация мацерации: комбинирование мацерации с последующим воздействием ультразвука в течение 45 мин (ультразвуковая экстракция) в экстракторе модели НО-455.00 ПС (ООО «Александра-плюс»); комбинирование мацерации с последующим механическим перемешиванием в течение 60 мин; бисмацерация и ремацерация.

Сухие экстракты. В процессе получения густого экстракта изучали влияние на содержание флавоноидов относительного объема отгонки экстрагента (90, 75, 67 и 50%). Отгонку экстрагента проводили до получения мягкого продукта (содержание влаги не более 25%).

Сухие экстракты получали при минимальном1 и заданном времени полной отгонки экстрагента при температурах 40–180 ºС c шагом 20 ºС. Отгонку экстрагента проводили из выпарительной чаши до потери в массе при высушивании не более 5%. Определяли зависимость содержания флавоноидов в экстракте от объема отгоняемой первичной вытяжки (2, 6, 10 и 13 мл). Также изучали влияние продолжительности отстаивания первичной вытяжки (1–4 сут) на содержание БАВ в жидкой фазе.

Предобработка сырья. Настойки и сухие экстракты получали из ЛРС, обработанного путем обезжиривания (обезжиривающий агент — толуол; продолжительность — 1 ч; соотношение сырье (г) : агент (мл) — 1:5; кратность — однократное), термической обработки (температура в упаковке — 120 ºС; продолжительность — 1 ч; толщина слоя обрабатываемого порошка сырья — 2–3 см) и комбинации в двух вариантах обезжиривания и термической обработки:

1) обезжиривание золотарника канадского травы, затем, после естественного улетучивания агента, термическая обработка сырья в упаковке (фольге);

2) термическая обработка золотарника канадского травы в упаковке (фольге), затем обезжиривание с последующим естественным улетучиванием обезжиривающего агента.

Предварительную обработку проводили согласно условиям, подобранным ранее [9][10]. Количественное определение флавоноидов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [11]. Содержание остаточных количеств обезжиривателя и экстрагента определяли методом газовой хроматографии [7].

Статистическую обработку результатов проводили при помощи компьютерной программы Microsoft Office Exсel 2016 (пакет «Анализ данных»). Каждое испытание выполняли три раза (n=3; Р=0,95). Результаты представляли в виде X±∆X, где X — среднее значение; ∆X — полуширина доверительного интервала среднего значения. Сравнение двух групп значений проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Значения статистически значимо различались при p-value р<0,05.

При экстракции 50, 60 и 70% этанолом содержание флавоноидов составило 4,92±0,12; 5,80±0,15 и 6,00±0,18% соответственно, т.е. при получении настоек методом мацерации наибольшее содержание флавоноидов золотарника канадского травы отмечено при экстракции 70% этанолом. Однако различия между экстракцией 70 и 60% этанолом не были статистически значимыми (р=0,15), поэтому с целью экономии материальных ресурсов для получения настойки золотарника можно рекомендовать использовать 60% этанол.

В течение 6, 3 и 1 сут (р = 0,28, 0,56 и 0,10) настаивания содержание флавоноидов оставалось практически одинаковым (рис. 1). В течение первых 2 сут (р=0,0031) и с 4 по 7 сут (р=0,0040) наблюдали статистически значимые колебания содержания, что предположительно связано с распределением БАВ в объеме экстрагента в течение 2 сут мацерации и последующим (спустя 3 сут) установлением равновесия между агликонами и гликозидами флавоноидов ввиду их первичного гидролиза в жидкой среде. В связи с этим выбрана продолжительность мацерации 3 сут.

При соотношении сырье (г) : экстрагент (мл) 1:10 содержание флавоноидов золотарника канадского травы на 38,7% (отн.) больше (p=0,0063), чем при 1:5, и значимо не отличалось (р=0,096) — 8,9% (отн.) от такового при соотношении 1:25 (рис. 1). С учетом выхода объема (при соотношении 1:10 из 10 г сырья получали 100 мл настойки, 1:25 — 250 мл, что в 2,5 раза больше) настойки целесообразно использовать соотношение 1:25.

Содержание флавоноидов при получении настоек из ЛРС со степенью измельчения 500, 1000 и 2000 мкм составило 2,92±0,10; 3,04±0,25 и 3,78±0,13% соответственно, т.е. при степени измельчения 2000 мкм содержание на 24,3% (отн.) значимо больше (р=0,014) по сравнению с 1000 мкм.

Содержание флавоноидов в исходной вытяжке составило 5,79±0,59%, после 1 сут отстаивания — 5,05±0,67%, что, по сравнению с исходным, статистически незначимо меньше на 14,6% (отн.) (р=0,084). При отстаивании в течение 1–4 сут содержание флавоноидов золотарника незначимо (р=0,35) уменьшалось с 5,21±0,90 до 5,01±0,74%.

Содержание флавоноидов при получении настоек методом мацерации с последующей ультразвуковой экстракцией, мацерации с последующим механическим перемешиванием, бис- и ремацерации составило 1,89±0,11, 2,01±0,15, 6,54±0,33 и 13,1±0,9% соответственно. При получении настоек из обработанного ультразвуком сырья содержание флавоноидов составило 3,62±0,14%, что в 1,9 раза больше, чем при комбинировании мацерации с последующей ультразвуковой экстракцией. Максимального содержания флавоноидов удается достичь при получении настойки золотарника методом ремацерации (в 2 раза (р=2,8×10-4) больше, чем при бисмацерации). При проведении дисперсионного анализа установлено, что продолжительность мацерации (р=2,8×10-4), соотношение сырье (г) : экстрагент (мл) (р=5,6×10-4), степень измельчения сырья (р=2,8×10-3) и способ получения (р=1,8×10-6) статистически значимо (p<0,05) влияли, а продолжительность отстаивания (р=0,52) статистически значимо не влияла на содержание флавоноидов в настойке золотарника. Настойки, полученные из ЛРС, предобработанного любым апробированным способом, содержали больше флавоноидов (от 39,0% (отн.) (р=3,4×10-4; 4,48±0,39%) до 112% (отн.) (р=3,4×10-7; 6,32±0,32%)) по сравнению с настойками, полученными из нативного сырья (2,92±0,38%). Наибольший выход в настойку золотарника флавоноидов наблюдали при термической обработке сырья (6,32±0,59%).

Таким образом, можно предложить следующую технологию получения настойки золотарника канадского травы (рис. 2). Рассчитанный объем 60% этанола (с учетом коэффициента спиртопоглощения) при соотношении сырье (г) : экстрагент (мл) 1:25 делят на три равные части. Сырье после предварительной термообработки [9] также разделяют на 3 равные части. Первую часть золотарника канадского травы, измельченной до частиц размера 2000 мкм (сырье № 1), заливают первой порцией 60% этанола (этанол № 1) и оставляют для настаивания на 3 сут. Извлечение сливают (вытяжка № 1), сырье отжимают (шрот № 1), заливают второй порцией 60% этанола (этанол № 2) и настаивают в течение 3 сут. Вытяжку после первого настаивания (вытяжку № 1) прибавляют ко второй части сырья (сырье № 2), настаивают 3 сут. После этого вытяжку сливают (вытяжка № 2) и прибавляют к третьей части сырья (сырье № 3), настаивают 3 сут. Сырье (шрот № 2) после настаивания отжимают, к нему прибавляют вытяжку, слитую с первой части сырья (вытяжка № 1). К первой части сырья (сырье № 1) прибавляют третью порцию 60% этанола (этанол № 3), настаивают 3 сут. Так последовательно повторяют до того момента, пока не получают последнюю вытяжку из третьей части сырья (вытяжка № 3). Все полученные в ходе ремацерации вытяжки объединяют, фильтруют, объединенную вытяжку оставляют для отстаивания при температуре не выше 10 ºС не более 4 сут, после чего фильтруют.

Содержание флавоноидов при отгонке 90, 75 и 67% экстрагента от первоначального объема составило 22,9±0,8; 16,3±1,3 и 14,5±2,0%; при этом содержание при отгонке 90% статистически значимо больше на 40,5% (отн.) (р=0,0023) и 57,9% (отн.) (р=0,0015), чем при отгонке 75 и 67% соответственно.

При отгонке экстрагента за минимальное время (5 мин — 2 ч в зависимости от температуры) содержание флавоноидов золотарника максимально при 100 и 120 ºС (р=0,26); при 100 ºС на 8,4% (отн.) и 9,0% (отн.) больше (р=0,073 и 0,080), чем при 80 и 60 ºС соответственно (рис. 3). При этом время отгонки при 100 и 80 ºС отличается незначительно (на 11,2% (отн.), р=0,083) в отличие от 60 ºС (разница в два раза), поэтому в дальнейшем для экономии энерго- и временных ресурсов можно рекомендовать температуру отгонки 80 ºС.

При заданном промежутке времени в 1,5 ч (показатель «потеря в массе при высушивании» при всех изученных температурах составлял менее 5%) содержание флавоноидов максимально при 80 ºС, что на 6,4% (отн.) и 8,7% (отн.) больше (р=0,14 и 0,15 соответственно), чем при 60 ºС и 40 ºС (рис. 3). При минимальном времени отгонки содержание флавоноидов в целом выше, чем при заданном времени (Fкрит=4,61; F=120; р=1,34×10-8). При отгонке экстрагента из 6 мл (23,4±1,2%) первичной вытяжки содержание флавоноидов золотарника в два раза больше по сравнению с отгонкой из остальных изученных объемов (от 9,21±0,28% до 10,2±0,7%). При отстаивании первичной вытяжки в течение 1–4 сут наблюдали незначительное снижение содержания (с 9,50±0,38 до 9,12±0,29%; р=0,15). Температура отгонки при минимальном от 5 мин (при 140–180 ºС) до 2 ч (при 40 ºС) (р=2,7×10-4) и заданном в 1,5 ч времени (р=1,5×10-4), толщина отгоняемого слоя (р=2,1×10-5) статистически значимо (p<0,05) влияли, а продолжительность отстаивания вытяжки (р=0,49) значимо (p>0,05) не влияла на содержание флавоноидов сухого экстракта золотарника.

Сухие экстракты золотарника, полученные при всех изученных способах предобработки сырья, содержали значимо больше флавоноидов (от 25,3% (отн.) (р=0,020; 17,1±1,0%) до 95,2% (отн.) (р=0,00074; 28,2±2,1%)) с максимумом при обезжиривании сырья (28,2±2,1%), что на 6,8% (отн.) больше (р=0,095), чем при термической обработке (26,4±0,9%).

Для удаления жирного масла из конечного продукта на разных стадиях его технологического процесса проводили обезжиривание. Обезжиривание первичной вытяжки (14,0±1,0%), густого (19,6±1,5%) и сухого (19,0±1,2%) экстрактов приводило к снижению содержания флавоноидов золотарника в 1,5–2 раза по сравнению с обезжириванием самого ЛРС.

Содержание остаточных количеств толуола и этанола в сухом экстракте золотарника составило 0,0096% (фармакопейная норма — не более 0,089%2) и 0,0054% (предел 0,5%) соответственно.

Таким образом, может быть предложена следующая технология получения сухого экстракта золотарника канадского травы (рис. 2). Первичную вытяжку фильтруют, отжимают сырье, оставляют вытяжку для отстаивания при температуре не выше 10 ºС в течение не более 4 сут, после чего фильтруют. Фильтрат в объеме около 6 мл помещают в выпарительную чашу и проводят отгонку экстрагента при 80 ºС в течение не более 40 мин. При этом сухой экстракт, полученный после обезжиривания, растворяется в эквивалентном объеме экстрагента полностью, в отличие от сухого экстракта, полученного из ЛРС, не подвергнутого обезжириванию.

При получении сухого экстракта по методике авторов [2] содержание флавоноидов более чем в 5 раз меньше, чем при разработанном способе с предварительным обезжириванием сырья.

Определены условия получения настоек и экстрактов, позволяющие повысить эффективность экстракции флавоноидов из золотарника канадского травы (Solidago canadensis herba). В случае получения настоек: объемная доля этанола — 60%; соотношение сырье (г) : экстрагент (мл) — 1:25; метод получения — ремацерация; степень измельчения сырья — 2000 мкм; время отстаивания первичной вытяжки — не более 4 сут; способ предварительной обработки — термообработка. В случае получения экстрактов: относительный объем отгонки — 90%; температура отгонки — 80 °С; минимальное время отгонки — в течение 40 мин; отгоняемый объем — 6 мл; время отстаивания первичной вытяжки — не более 4 сут; способ предобработки — обезжиривание исходного ЛРС.

Разработанная технология экстракционных лекарственных форм золотарника канадского травы с повышенным содержанием флавоноидов может быть предложена для масштабирования и трансфера в фармацевтическое производство.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Р.И. Лукашов — выполнение эксперимента, проведение статистической обработки и оформление результатов; Н.С. Гурина — разработка дизайна эксперимента; М.Н. Повыдыш — участие в обработке, обсуждении результатов и формулировании выводов.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Raman I. Lukashou performed the experiment, carried out statistical processing and presented the results. Natalia S. Gurina developed the design of the experiment. Maria N. Povydysh participated in the processing, discussion of results and formulation of conclusions.

1. Минимальное время — наименьшая продолжительность процесса (ч), при которой образуется сухой экстракт при заданной температуре отгонки экстрагента. 2. Фармакопейная статья 01/2013:РБ50400. Остаточные количества органических растворителей. Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2-е изд. Т. 1. Молодечно; 2012.