Сахарный диабет (СД) — одно из наиболее широко распространенных хронических заболеваний, частота которого с каждым годом неуклонно растет. По данным Международной диабетической федерации, число пациентов в возрасте 20–79 лет с установленным диагнозом СД составляет около 537 млн [1]. По прогнозам, к 2030 г. их количество составит 643 млн, к 2045 — 783 млн. В России за 15 лет количество пациентов с СД увеличилось почти втрое, с 2 до 5,5 млн человек; подавляющее большинство из них — взрослые с СД 2 типа (5,1 млн) [2]. СД представляет собой социально значимое заболевание, сопровождающееся высоким риском смерти от осложнений и ведущее к ранней инвалидизации. Стратегия терапии СД требует комплексного подхода, и в первую очередь — контроля уровня глюкозы в крови [3][4].

Для коррекции гликемии при СД 2 типа используются препараты, относящиеся к 9 фармакотерапевтическим группам. В группе синтетических гипогликемических препаратов насчитывается 28 международных непатентованных наименований, однако в клинической практике бóльшая часть назначений приходится на глибенкламид, метформин и гликлазид [5][6].

Гликлазид — противодиабетический препарат сульфонилмочевины второго поколения. Механизм гипогликемического действия гликлазида заключается в увеличении секреции инсулина, опосредованном активацией рецепторов глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1Р). В рамках длительной монотерапии СД 2 типа гликлазид получают 26–30% пациентов старшей возрастной группы, а также 74% всех пациентов, получающих комбинированную терапию [8].

Несмотря на большое количество гипогликемических препаратов, представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации, разнообразие лекарственных форм (ЛФ) ограничено таблетками и растворами для подкожного введения (агонисты ГПП-1Р). Существование зарегистрированной пероральной пролонгированной формы гликлазида указывает на соответствующие биофармацевтические свойства субстанции, что делает разработку ее инъекционной пролонгированной ЛФ обоснованной и актуальной задачей.

Разработка пролонгированных форм, в том числе инъекционных, является одной из ключевых задач фармацевтической разработки, поскольку такие препараты обеспечивают комплаенс терапии. Имплантируемые инъекционные депо-системы имеют ряд преимуществ: обеспечивают контролируемое и непрерывное высвобождение лекарственных средств в течение длительного периода (от нескольких дней до нескольких недель/месяцев) без необходимости повторного введения [9].

Перечень существующих депо-систем включает такие виды, как: системы на масляной основе (растворы, суспензии); водные растворы и суспензии; полимерные микросферы; гелевые имплантаты, формирующиеся in situ; имплантаты. Тип депо-систем во многом определяется физико-химическими и биофармацевтическими свойствами активной фармацевтической субстанции [10–12].

Цель работы — разработка пролонгированной депо-системы гликлазида для парентерального введения. Задачи состояли в исследовании растворимости гликлазида в различных растворителях и их смесях с водой; биофармацевтической оценке высвобождения гликлазида in vitro; оценке гипогликемической активности суспензии гликлазида на модели аллоксан-индуцированного диабета.

Модели суспензионных систем для инъекционной доставки были получены на основе гликлазида (Ningbo Double Sun Phaгmaсeutiса Co. Ltd., Китай, серия 30222017, срок годности 03.2026).

Растворимость гликлазида оценивалась в следующих органических растворителях: пропиленгликоль-1,2 (ПГ‑1,2) (х.ч., ГК «ЭКОС-1»), полиэтиленгликоль-400 (ПЭГ‑400) (Acros Organics), диметилсульфоксид (ДМСО) (х.ч., ООО ТД «ХИММЕД»), изопропилмиристат (ИПМ) (96%, Acros Organics), глицерин (Гл) (ч.д.а., ГК «ЭКОС-1»), спирт этиловый 95%1, а также в воде очищенной2 (ВО) и воде для инъекций3 (ВИ).

Исследование специфической активности полученных суспензий гликлазида при инъекционном введении проводили на 50 самцах крыс линии Wistar массой 190±10 г, возрастом 7–8 нед. с аллоксановым диабетом [14][15]. Животные были получены из УНУ «Центр генетических ресурсов лабораторных животных (ЦГР)» ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск.

Эксперимент одобрен биоэтической комиссией по работе с животными при локальном этическом комитете ФГБОУ ВО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, протокол № 4 от 29.11.2024. Содержание животных и уход за ними осуществляли согласно Директиве № 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского союза «О защите животных, использующихся для научных целей» и ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Оценка растворимости гликлазида. Для получения ЛФ для парентерального введения в составе комплексных растворителей могут использоваться органические растворители4. Оценка растворимости гликлазида проводилась в ПГ‑1,2, ПЭГ‑400, ДМСО, ИПМ, Гл, спирте этиловом 95%, а также их бинарных смесях с ВО с целью получения модельных суспензионных депо-форм. Определение растворимости в выбранных органических растворителях и бинарных смесях проводили согласно фармакопейной методике5 в 6 параллельных испытаниях. Зависимость растворимости гликлазида от температуры в выбранных растворителях и бинарных смесях определяли при нагревании (40–100 °С). Гликлазид считали растворившимся, если в растворе при наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества, и частично растворившимся, если смесь содержала растворенный и нерастворенный компоненты.

Биофармацевтические исследования in vitro. Суспензию гликлазида в ВИ и выбранных органических растворителях получали в асептических условиях методом диспергирования при 4000 об./мин в лабораторном гомогенизаторе ULAB US-4025D (ULAB, Китай).

Биофармацевтические исследования in vitro проводили методом диализа по Крувчинскому через целлофановую мембрану марки «Купрофан» [13]. Навеску модельной водной суспензии (1,0 г), содержащей 0,06 г гликлазида, помещали на целлофановую мембрану диализатора, погружали на глубину 0,5 мм в диализную среду (250 мл спирта этилового 70%) и выдерживали в термостате при температуре 37±1 °C. Пробы диализатов отбирали по 3 мл через 15, 30, 45, 60, 90, 120 мин и далее (с интервалом 60 мин) до выхода на кинетическое плато. Объем отобранной пробы восполняли равнозначным объемом диализной среды (37 °C). Оптическую плотность отобранных проб определяли на спектрофотометре Helios Omega (Thermo Fisher Scientific, США) в кварцевой кювете толщиной 10 мм при длине волны λ=230 нм.

Степень высвобождения (%) гликлазида (Х) в диализную среду рассчитывали по формуле (1).

(1)

где Ax — оптическая плотность исследуемого раствора; A0 — оптическая плотность раствора образца сравнения (ОС) гликлазида; M — масса стандартного образца гликлазида, г; 0,06 — масса гликлазида в модельной суспензии, г.

Для приготовления ОС раствора гликлазида к точной навеске субстанции гликлазида (0,03 г) добавляли 200 мл спирта этилового 70% и растворяли, тщательно перемешивая в течение 20 мин, помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводили до метки спиртом этиловым 70% и снова перемешивали. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 3 мл полученного раствора, доводили до метки спиртом этиловым 70%, перемешивали. Оптическую плотность полученного ОС измеряли при λ=230 нм.

Получение модели аллоксан-индуцированного сахарного диабета. СД индуцировали последовательным внутрибрюшинным введением крысам 5% раствора никотинамида в дозе 230 мг/кг и 5% раствора аллоксана6 в дозе 150 мг/кг [14][15], исходная концентрация глюкозы в крови животных составляла 7,2±0,8 ммоль/л.

Оценка гипогликемической активности суспензии гликлазида. Для определения антидиабетической активности на модели аллоксанового СД были подготовлены экспериментальные образцы суспензии гликлазида в ВИ, смеси ВИ с ПГ‑1,2 (в объемном соотношении 1 к 1), и ДМСО:ПГ‑1,2 (1:1). Разовая доза гликлазида выбрана с учетом рекомендованных доз для перорального приема (60 мг) с учетом межвидового коэффициента пересчета (6,5)7 и массы животных. В качестве препарата сравнения использовались эквивалентные дозы субстанции гликлазида внутрижелудочно.

Методом парных аналогов8 животных с уровнем гликемии более 20 ммоль/л разделили на 3 экспериментальные группы, группу сравнения и контрольную группу (по 7 животных в каждой группе). Дополнительно была сформирована группа из 7 интактных животных для мониторинга физиологического уровня гликемии.

Модельные суспензии, препарат сравнения и плацебо вводили животным согласно дизайну:

Уровень глюкозы в крови экспериментальных животных измеряли с помощью глюкометра Accu-Chek® Performa Nano (Roche Diagnostics, Швейцария) через 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 ч после однократного введения исследуемых модельных суспензий.

Статистические методы. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel (2016), методами описательной статистики c использованием T-критерия Уилкоксона (с выбранным уровнем значимости (p) меньше 0,05) и T-критерия Стьюдента (p<0,05).

Гликлазид характеризуется плохой растворимостью в воде, но легко проходит через биологические мембраны и относится к соединениям II класса согласно биофармацевтической классификации [16]. Низкая скорость растворения и слабая смачиваемость гликлазида водой приводит к снижению скорости его абсорбции при пероральном приеме и приводит к значительной внутри- и межиндивидуальной вариабельности фармакокинетических параметров [17]. Фармакокинетические параметры являются ключевыми для разработки лекарственной формы и напрямую зависят от растворимости действующего вещества.

Растворимость гликлазида зависит от полярности растворителя и температуры среды, некоторый вклад вносят такие факторы, как вязкость, стерические эффекты, межмолекулярные взаимодействия и способность растворителя образовывать водородные связи [18][19]. По данным исследования S. Yu с соавт. [18], растворимость гликлазида в спиртах при нагревании повышается в следующем порядке: метанол > этанол > н‑пропанол > н‑бутанол > изобутанол > изопропанол. В исследовании Z. Wang и соавт. [19] растворимость гликлазида снижается в ряду: N,N-диметилацетамид > ДМСО > 1,2‑дихлорэтан > 1,4-диоксан > 2‑бутанон, 2‑метоксиэтанол > н‑пропилацетат > н‑бутилацетат > пентилацетат > изопропилацетат.

Гликлазид легко растворим в ДМСО и мало растворим в спирте этиловом 95%. В стандартных условиях гликлазид практически нерастворим в ПЭГ‑400, ПГ‑1,2, ИПМ, Гл (табл. 1). Растворимость гликлазида при повышении температуры улучшается в ПГ‑1,2 и ПЭГ‑400, что можно объяснить снижением вязкости растворителей при нагревании и интенсификацией диффузии (табл. 1). При этом в растворах, охлажденных до температуры 25 °С (что соответствует условиям испытания «Растворимость»), выпадение осадка гликлазида не наблюдалось.

Результаты проведенного исследования S. Yu с соавт. [20] показывают положительную корреляцию между повышением растворимости гликлазида в бинарных растворителях с повышением температуры и увеличением мольной доли неполярного растворителя в бинарных смесях. Соотношение растворителей в бинарных смесях (1:1) было выбрано на основании ранее проведенных исследований. Показано, что бинарные смеси в соотношении компонентов 1:1 обладают лучшими фармакокинетическими параметрами при пероральном введении [21].

Среди бинарных растворителей наилучшие результаты получены для ПГ‑1,2:ДМСО. В бинарных смесях ПГ‑1,2, ПЭГ‑400 и ДМСО с ВО растворимость гликлазида повышалась по сравнению с ВО (количество осадка уменьшалось) и оставалась неизменной при 25 °С. В смесях Гл и ВО осадок сохранялся вследствие плохой смачиваемости частиц; в других бинарных растворителях происходило оседание частиц.

Полученные результаты растворимости гликлазида как в моно-, так и в бинарных растворителях соответствуют широкому диапазону объемных единиц растворителя (1:100; 1:1000). Такие показатели растворимости не позволяют получить гомогенную жидкую дисперсную форму для парентерального введения, учитывая стандартный объем подкожной инъекции (1–5 мл)9 и терапевтическую дозу препарата (30–120 мг)10, на основании чего для проведения дальнейшего исследования была выбрала лекарственная форма «суспензия».

Для оценки эффективности высвобождения гликлазида из выбранной ЛФ были проведены биофармацевтические исследования in vitro кинетики диффузного высвобождения гликлазида из суспензии через полупроницаемую мембрану. Результаты представлены в таблице 2.

Максимальное значение высвобождения гликлазида из водной суспензии установлено через 2 ч от начала эксперимента — 15,69±0,49%. Спустя 3 ч статистически значимое изменение концентрации гликлазида в диализной среде не наблюдалось (p>0,05). При проведении диализа наблюдалось всплытие частиц гликлазида и, как следствие, низкий контакт с поверхностью диализной мембраны.

Таким образом, прототипом для разработки инъекционной депо-формы гликлазида может являться суспензия на основе смесей органических растворителей (в качестве сорастворителей и сурфактантов) и ВИ.

Зависимость антидиабетической активности модельных суспензий гликлазида от дисперсионной среды представлена на рисунке 1.

Средние значения уровня гликемии у животных с аллоксановым СД варьировались в диапазоне 21,4–22,5 ммоль/л; концентрация глюкозы в крови интактных животных составляла 7,2±0,7 ммоль/л. Уровень гликемии в контрольной группе животных был более 20 ммоль/л на протяжении всего эксперимента. Снижение концентрации глюкозы в крови наблюдалось через 2 ч после введения исследуемых суспензий (p<0,05). Максимальное уменьшение концентрации глюкозы в крови животных в группе 1 (ВИ) составило 11,1±0,6 ммоль/л, что на 48,6% меньше, чем у животных контрольной группы (p<0,05). При этом снижение концентрации глюкозы в крови животных группы 1 до уровня гликемии интактных животных не отмечено.

Более выраженное снижение концентрации глюкозы наблюдали в крови животных группы 2 (ВИ:ПГ‑1,2) и группы 3 (ДМСО:ПГ‑1,2), получавших образцы суспензионной формы гликлазида на основе бинарных дисперсных сред; значимое снижение концентрации глюкозы отмечали в течение первых 12 ч (p<0,05). Через 8 ч после введения модельной суспензии гликлазида на основе ВИ:ПГ‑1,2 уровень гликемии составлял 7,9±0,6 ммоль/л, что сопоставимо с физиологическим уровнем гликемии интактных животных (7,3±0,8 ммоль/л). Эффект сохранялся в течение следующих 4 ч. Максимальный гипогликемический эффект у животных группы 2 наблюдался через 10 ч (6,7±0,7 ммоль/л) от начала эксперимента, что на 69% меньше, чем у животных контрольной группы (p<0,05).

Введение суспензии гликлазида на основе ДМСО:ПГ‑1,2 приводило к снижению концентрации глюкозы в крови в течение первых 8 ч (p<0,05), значения гликемии, сопоставимые с физиологическими, отмечали через 8 ч (7,2±0,4 ммоль/л) после введения препарата; физиологическая концентрация сохранялась в течение следующих 4 ч. Максимальное снижение уровня глюкозы регистрировалось спустя 10 ч от начала эксперимента и составляло 6,9±0,3 ммоль/л, что на 68% меньше таковой у животных контрольной группы 5 (p<0,05).

Концентрация глюкозы через 24 ч в группах 2 и 3 была ниже на 47,8 и 44,2% (11,8±0,9 и 12,6±2,0 ммоль/л соответственно) относительно контрольной (22,6±1,3 ммоль/л); результаты были статистически значимыми (p<0,05). У животных группы 1 через 24 ч после начала эксперимента наблюдали уровень гликемии, сопоставимый с таковым для контрольной группы.

У животных группы сравнения, получавших препарат внутрижелудочно, через 6 ч от начала эксперимента регистрировали пиковый уровень снижения концентрации глюкозы (7,3±0,8 ммоль/л), что сопоставимо с физиологическими значениями у интактных животных; значения гликемии были на 65,9% ниже, чем у животных контрольной группы (p<0,05). Этот гипогликемический эффект наблюдался непродолжительно; через 8 ч от начала эксперимента было выявлено значимое повышение концентрации глюкозы в крови животных на 24% (p<0,05). Спустя 24 ч тенденция сохранялась; концентрация глюкозы была сопоставима с таковой у животных контрольной группы. Межгрупповой сравнительный анализ данных антидиабетической активности суспензионных депо-моделей гликлазида с учетом дисперсионных сред представлен в таблице 3.

Таким образом, суспензии гликлазида в бинарных растворителях проявляют бóльшую антидиабетическую активность по сравнению с водной суспензией, что подтверждается статистически значимыми различиями через 2 и 4 ч от начала эксперимента в соответствующих группах животных; такая лекарственная форма способствует более длительному поддержанию физиологического уровня гликемии. Среди бинарных растворителей комбинация ПГ‑1,2 и ДМСО вызывают наиболее выраженное снижение концентрации уровня глюкозы в крови, а наименьшая гипогликемическая активность гликлазида была показана в группе 1. Физиологический уровень гликемии в группах 2 и 3 был выявлен спустя 8 ч после начала эксперимента.

Через 24 ч после введения исследуемых суспензий концентрация глюкозы у животных групп 2 и 3 не имела статистически значимых различий (p>0,05), но при этом была значимо ниже по сравнению с концентрацией глюкозы животных группы 1.

Таким образом, подкожное введение модельных депо-систем на основе бинарных смесей обеспечивает более равномерное и длительное снижение глюкозы в крови лабораторных животных и пролонгацию действия гликлазида по сравнению с внутрижелудочным введением.

Проведено исследование растворимости гликлазида в безопасных и наиболее часто используемых при производстве препаратов органических растворителях, а также их бинарных смесях. В качестве дисперсных сред для получения суспензий выбраны вода, пропиленгликоль-1,2, полиэтиленгликоль-400 и диметилсульфоксид.

Проведена биофармацевтическая оценка водной суспензии гликлазида; сделан вывод о необходимости введения сокомпонентов, способных повысить высвобождение гликлазида из выбранной лекарственной формы.

Проведено исследование антидиабетической активности инъекционных депо-форм гликлазида на модели аллоксанового диабета у самцов крыс. Установлена зависимость между составом дисперсионной среды и гипогликемической активностью гликлазида. Суспензии, содержащие бинарные смеси растворителей (вода для инъекций : пропиленгликоль-1,2; диметилсульфоксид : пропиленгликоль-1,2), снижают уровень глюкозы крови у модельных животных до физиологических значений и обеспечивают пролонгацию гипогликемического эффекта.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.Е. Стороженко — выполнение эксперимента, проведение статистической обработки и оформление результатов, написание текста рукописи, формулирование выводов; Э.Ф. Степанова — идея публикации, написание текста рукописи, утверждение окончательной версии рукописи для публикации; Е.М. Лупитько — написание текста рукописи.

Соответствие принципам этики. Исследование было одобрено на заседании биоэтической комиссии по работе с животными при локальном этическом комитете ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, протокол № 4 от 29.11.2024.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Sergey E. Storozhenko conducted the experiment, participated in drafting the manuscript and formulating conclusions. Eleonora F. Stepanova conceptualized the study, drafted the manuscript, formulated conclusions, and approved the final version of the manuscript for publication. Elena M. Lupitko participated in drafting the manuscript.

Ethics approval. The study was approved at a meeting of a bioethics commission for animal use at the local Ethics committee of Prof. V.F. Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Meeting Minutes No. 4 dated November 29, 2024).

1. ФС.2.1.0036 Спирт этиловый 95%, 96%. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 2. ФС.2.2.0020 Вода очищенная. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 3. ФС.2.2.0019 Вода для инъекций. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 4. ОФС.1.2.1.0005 Растворимость. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 5. Там же. 6. Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М.: Гриф и К; 2012. 7. Там же. 8. Там же. 9. ГОСТ Р 52623.4–2015. Технологии выполнения простых медицинских услуг инвазивных вмешательств. 10. https://grls.minzdrav.gov.ru/GRLS.aspx?isfs=0&regtype=1%2c6&pageSize=10&order=Registered&orderType=desc&MnnR=%d0%93%d0%bb%d0%b8%d0%ba%d0%bb%d0%b0%d0%b7%d0%b8%d0%b4&pageNum=1&token=76950146-79ff-45b7-b604-f0a15ff56d8f