В схемы лечения немелкоклеточного рака легких на поздних стадиях включают лучевую терапию, применение которой часто сопряжено с развитием осложнений [1–3]. Существующие радиозащитные препараты характеризуются высокой токсичностью с риском развития тяжелых нежелательных реакций, коротким сроком фармакологического действия и недостаточной эффективностью. В связи с этим актуальной задачей радиобиологии является поиск новых биологически активных молекул, обладающих радиопротекторными свойствами [4–9].

В патогенезе лучевой болезни важную роль играет состояние оксидативного стресса, так как воздействие ионизирующего излучения на организм приводит к снижению количества естественных антиоксидантов в тканях организма. В связи с этим для коррекции лучевого синдрома могут быть использованы экзогенные антиоксиданты [1][9–10]. Генистеин (5,7-дигидрокси-3-(4-гидроксифенил)хромен-4-он относится к группе полифенольных соединений, проявляющих выраженную антиоксидантную и радиопротекторную активность [11–13]. Основываясь на механизме действия [12], можно предположить, что генистеин снижает экспрессию провоспалительных и профибротических медиаторов, вызванных воздействием ионизирующего излучения. Результатом включения генистеина в схему радиотерапии может быть снижение частоты возникновения радиационно-индуцированного пневмонита и фиброза [12][14].

Низкая растворимость генистеина в воде может быть одной из причин нелинейного фармакокинетического поведения генистеина и объясняет, почему увеличение дозы не улучшает его биодоступность за счет насыщения метаболических ферментов [15]. Для решения проблем, обусловленных низкой растворимостью действующего вещества, гидрофобные лекарственные средства могут производиться в виде дисперсии аморфных твердых веществ в матрице-носителе. Такой подход повышает растворимость лекарственного препарата в физиологических средах за счет разрушения кристаллической решетки и минимизации энергии, необходимой для его растворения [16].

Для включения генистеина в схемы профилактики и лечения радиационных поражений необходимо разработать проект фармакопейной статьи «Генистеин», содержащий перечень показателей качества и нормируемых значений, что обеспечит соответствующий уровень оценки качества данной фармацевтической субстанции.

В Санкт-Петербургском государственном химико-фармацевтическом университете (ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России) была разработана схема синтеза генистеина, позволяющая получать достаточно большое количество субстанции [17], а также методики фармакопейного анализа для оценки подлинности и количественного содержания потенциально активной фармацевтической субстанции генистеина [18][19]. Для количественного определения генистеина была предложена методика неводного титрования в среде диметилформамида с потенциометрическим контролем конечной точки титрования [19]. Однако неводное титрование не обеспечивает достаточную специфичность при количественной оценке активных фармацевтических субстанций в многокомпонентных смесях (например, в твердых дисперсиях). Для дальнейших контролируемых исследований по введению генистеина в состав таких смесей необходима разработка более специфичной методики количественного определения генистеина, обеспечивающей селективность анализа.

В литературе представлено большое количество методик высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием (ВЭЖХ–ДМД) для идентификации и количественного определения генистеина в составе растительных экстрактов (см., например, [20–22]). Описанные условия хроматографирования [20–22] позволяют разделять компоненты смеси и проводить одновременное детектирование компонентов во всем спектральном диапазоне, что увеличивает длительность анализа (~1 ч). Разработка экспрессной методики ВЭЖХ-ДМД для анализа генистеина позволит автоматизировать рутинный контроль качества и обеспечить высокую точность, селективность и высокую скорость исследования.

Цель работы — разработка методики идентификации и количественного определения потенциально активной фармацевтической субстанции генистеина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Исследование проводилось с помощью системы ВЭЖХ Prominence LC-20 Shimadzu (Япония) c детектором ультрафиолетового и видимого света. Температура в отсеке для колонки составляла 40 °C, объем инжекции 100 мкл, длина волны детекции 261 нм, колонка Shimadzu C18 (4,6 мм×250 см, размер частиц 5 мкм).

Реактивы, использованные в исследовании: вода очищенная, деионизированная, ацетонитрил (HPLC-gradient grade, J.T. Baker), кислота муравьиная 98,0–100% (Acros Organics, кат. № AC27048-0010). Генистеин был синтезирован на базе НОЦ ХТОС ФГБОУ ВО СПХФУ по «дезоксибензоиновой схеме» с использованием в качестве циклизующего агента смешанного муравьино-уксусного ангидрида [17]. В качестве стандартного образца использовали дважды перекристаллизованную из спирта этилового субстанцию, на хроматограмме ВЭЖХ-МС/МС которой отсутствовали сигналы, не относящиеся к молекуле генистеина. Подтверждение структуры субстанции генистеина проводили с применением методов ИК-, ЯМР-спектрометрии. Субстанция была оценена по показателям «Подлинность», «Чистота», «Количественное определение».

Методика приготовления 0,005% стандартного и рабочего растворов генистеина: ~0,0250 г (точная навеска) субстанции помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем раствора доводили до метки ацетонитрилом. Растворяли на ультразвуковой бане Stegler 3DT 10 мин при температуре 25 °C, 0,5 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, объем раствора доводили до метки тем же растворителем, перемешивали.

Для приготовления подвижной фазы в мерной колбе вместимостью 1000 мл смешивали 750 мл ацетонитрила с 250 мл воды деионизированной (75:25 об.:об.). Подвижные фазы с другим соотношением компонентов готовили аналогично. Далее полученную смесь фильтровали с помощью установки для вакуумной фильтрации LabTech VP30.

Разработанная методика ВЭЖХ-ДМД для идентификации и количественного определения генистеина была валидирована по параметрам: специфичность, линейность, точность, прецизионность, правильность и устойчивость в соответствии с нормативными документами1.

Подтверждение специфичности валидируемой методики ВЭЖХ-ДМД для оценки генистеина по показателю «Подлинность» проводили путем регистрации хроматограмм: 0,005% стандартного раствора генистеина и 0,005% рабочего раствора генистеина. Специфичность методики ВЭЖХ-ДМД для оценки генистеина по показателю «Количественное определение» подтверждалась дополнительно путем регистрации хроматограммы холостого раствора и сравнения с хроматограммой 0,005% стандартного раствора генистеина.

Для определения линейности путем последовательного разведения были приготовлены пять стандартных растворов с различными концентрациями в диапазоне 20–150% от концентрации рабочего раствора генистеина. Концентрацию генистеина рассчитывали по градуировочному графику с помощью Microsoft Office Excel 2010.

Правильность методики оценивали путем сравнения открываемости при 80, 100 и 120% содержания генистеина от концентрации рабочего раствора (в трехкратной повторности на каждом уровне). Также рассчитывали относительное стандартное отклонение (%RSD).

Для оценки внутридневной прецизионности в один и тот же день был проведен анализ для трех уровней концентрации генистеина (80, 100, 120% от концентрации рабочего раствора) по три повторения (n=3), для оценки междневной точности образцы анализировали аналогично в течение трех дней подряд. В ходе анализа регистрировали площадь пика с последующим расчетом %RSD.

Для демонстрации стабильности методики были целенаправленно изменены параметры хроматографической системы, в том числе состав подвижной фазы (содержание ацетонитрила ±10%), температура колонки (±3 °С (37 и 43 °С)), скорость потока (±10% (0,6 и 0,8 мл/мин)), длина волны детекции (±2 нм (259, 263 нм)).

Полученные экспериментальные данные обрабатывали согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации2.

Согласно данным литературы для идентификации, разделения и определения флавоноидов применяют обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ [20–22]. В качестве коммерчески доступных неподвижных фаз чаще всего используют силикагели с привитыми алкильными радикалами, как правило, С18. Колонка C18 менее полярна, чем другие применяемые в ВЭЖХ колонки (например, С4 и С8), ее рекомендуется использовать для разделения полярных и неполярных соединений, ускорения элюирования последних. Авторы [20–22] в качестве неполярной фазы рекомендуют использовать ацетонитрил, в качестве полярной фазы — воду очищенную или 0,1% раствор муравьиной кислоты. Выбранная для детектирования длина волны поглощения 261±2 нм соответствует максимуму поглощения генистеина [23][24]. Изократический режим подачи элюента был выбран из-за простоты применения, а также достаточной селективности и эффективности разделения.

Для повышения эффективности и улучшения хроматографических характеристик пика были оптимизированы содержание органического растворителя (ацетонитрила) в подвижной фазе и скорость потока (рис. 1, табл. 1); установлены оптимальные условия хроматографирования: подвижная фаза — ацетонитрил : вода деионизированная (75:25 об.:об.), скорость потока 0,7 мл/мин, температура 40 °С. Уменьшение рН (введение в раствор муравьиной кислоты) практически не повлияло на вид хроматограммы.

Контроль пригодности хроматографической системы проводили путем оценки относительного стандартного отклонения времени удерживания (%RSD=0,013), относительного стандартного отклонения площади пика (%RSD=0,001), числа теоретических тарелок (ЧТТ=6664) и фактора асимметрии (AS=1,01). По результатам контроля хроматографическая система считается пригодной для анализа, так как все оцениваемые показатели соответствуют критериям приемлемости3.

Критерий приемлемости при оценке специфичности методики для испытания «Подлинность» — равенство времен удерживания генистеина при анализе стандартного и испытуемого образцов (~4,4 мин) — соблюдается (рис. 2). На хроматограмме холостого раствора отсутствуют посторонние пики в сравнении с хроматограммой раствора стандартного образца генистеина, что позволяет утверждать, что разработанная методика является специфичной. Методика валидна по показателю линейность в диапазоне концентраций генистеина 0,001–0,01%, коэффициент корреляции уравнения регрессии зависимости хроматографического пика от концентрации генистеина r=0,997 отвечает условию |r|>0,994.

Для оценки правильности методики были рассчитаны среднее значение открываемости и относительное стандартное отклонение для каждого уровня концентрации (табл. 2 «Результаты оценки правильности ВЭЖХ-методики идентификации и количественной оценки субстанции генистеина». Опубликована на сайте журнала5). Полученные данные свидетельствуют о том, что данная методика соответствует фармакопейным требованиям6 по показателю «Правильность».

Повторяемость была оценена на одном уровне концентрации генистеина (0,05 мг/мл) в 6 повторностях (табл. 3 «Результаты оценки повторяемости ВЭЖХ-методики идентификации и количественной оценки субстанции генистеина». Опубликована на сайте журнала7). Относительное стандартное отклонение (%RSD) количественного определения составляет 0,43, что удовлетворяет фармакопейным требованиям (%RSD<1)8.

Для оценки прецизионности методики ВЭЖХ-ДМД были рассчитаны относительные стандартные отклонения площади пика при междневном (0,33–0,67) и внутридневном (0,57–0,87) анализе, что удовлетворяет критериям приемлемости <2%9 и свидетельствует о валидности по показателю «Прецизионность».

Результаты оценки устойчивости разработанной методики ВЭЖХ-ДМД представлены в таблице 4 «Результаты оценки робастности ВЭЖХ-методики идентификации и количественной оценки субстанции генистеина» (опубликована на сайте журнала10). Время удерживания, фактор асимметрии и эффективность оставались стабильными при всех измененных условиях проведения анализа, следовательно, валидируемая методика ВЭЖХ-ДМД является робастной.

В ходе проведенного исследования была разработана, оптимизирована и валидирована методика идентификации и количественного определения потенциально активной субстанции генистеина методом ВЭЖХ-ДМД. Установлено, что разработанная методика соответствует критериям приемлемости по показателям: специфичность, линейность (в диапазоне концентраций генистеина 0,001–0,01%), правильность, воспроизводимость, прецизионность, робастность.

Данная методика предназначена для идентификации и количественного определения генистеина и будет предложена для включения в проект фармакопейной статьи «Генистеин». Методика также может быть применима для анализа генистеина при разработке технологии получения его растворимых форм, при проведении теста «Растворение» и исследований сравнительной кинетики растворения растворимых лекарственных форм препарата.

Дополнительная информация. Таблицы 2–4 размещены на сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств».

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-664-671-annex

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Л.Д. Игнатова — разработка и валидация методики ВЭЖХ-ДМД, проведение статистической обработки данных, написание текста рукописи; О.Ю. Стрелова — разработка методики эксперимента; В.В. Тихонова — написание текста рукописи. Все авторы приняли участие в обсуждении результатов и написании статьи.

Additional information. Tables 2–4 are published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-664-671-annex

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Lada D. Ignatova developed and validated HPLC method, processed statistical data, and drafted the manuscript. Olga Yu. Strelova designed and developed the experiment. Viktoria V. Tihonova drafted the manuscript. All the authors participated in the discussion of the results and manuscript drafting.

1. ОФС.1.1.0012 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.: 2023.Решение коллегии ЕЭК от 17.07.2018 № 113 «Об утверждении Руководства по валидации аналитических методик проведения испытаний лекарственных средств». 2. ОФС.1.1.0013 Статистическая обработка результатов химического эксперимента. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 3. ОФС.1.1.0012 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 4. Там же. 5. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-664-671-annex 6. ОФС.1.1.0012 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 7. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-664-671-annex 8. ОФС.1.1.0012 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 9. Там же. 10. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2025-15-6-664-671-annex