ВВЕДЕНИЕДепрессорные (гистаминоподобные) вещества — общее название широкого спектра соединений, вызывающих при внутрисосудистом введении понижение артериального давления. В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ)1 испытание на депрессорные вещества проводят для гепарина натрия, эноксапарина натрия, даунорубицина гидрохлорида, доксорубицина гидрохлорида, митомицина и канамицина сульфата кислого [1].
К депрессорным веществам, которые могут присутствовать в лекарственных средствах (ЛС), в том числе относят гистамин. Гистамин (2-(4-имидазолил)этиламин) — биогенный амин, участвующий в местных иммунных реакциях, а также в регуляции физиологического функционирования кишечника и действующий как нейромедиатор [2]. Существует два пути метаболизма гистамина в организме человека: окислительное дезаминирование под действием диаминоксидазы и кольцевое метилирование с помощью гистамин-N-метилтрансферазы [3]. Непереносимость гистамина возникает в результате нарушения равновесия между накопленным гистамином и способностью к его метаболизму. У здоровых людей гистамин может быстро нейтрализоваться аминооксидазами, в то время как люди с низкой активностью аминооксидаз подвержены риску возникновения зуда, головной боли, риноконъюнктивальных симптомов, гипотонии, аритмии, гиперемии, диареи и других состояний [4].
В организме человека гистамин является центральным медиатором аллергической реакции. Воздействие аллергена на пациентов с сенсибилизацией иммунной системы вызывает высвобождение гистамина в базофилах (тучных клетках) [5]. Гистамин также может образовываться в результате поступления веществ, инициирующих процесс его биосинтеза. Гистамин синтезируется из аминокислоты гистидин при участии фермента L-гистидиндекарбоксилазы, коферментом которого является пиридоксальфосфат:
https://cdn.elpub.ru/assets/journals/vedomostiregmed/2025/5/8gHZXYTJKjJbwnuSWrR4SY2Kt7nuWuX0S5pas2zU.jpeg
Возможен и экзогенный путь поступления данного амина, например, употребление богатой гистамином пищи или прием ЛС, загрязненных гистамином.
Существует несколько возможных путей загрязнения ЛС примесью гистамина. Основная причина загрязнения ЛС, получаемых из тканей и органов животных, — нарушение технологического процесса на этапе работы с сырьем. К таким ЛС относят, например, апротинин, который получают из органов крупного рогатого скота. Неправильное хранение или нарушение сроков обработки могут привести к загрязнению продукции как гистамином, так и другими вазоактивными соединениями [6].
Возможно также загрязнение гистамином ЛС, получаемых путем ферментации. Примером такой субстанции служит даунорубицина гидрохлорид, представляющий собой смесь компонентов, продуцируемых определенными штаммами микроорганизмов (Streptomyces coeruleorubidus, Streptomyces peucetius). В таком случае загрязнение гистамином может происходить в результате наличия в питательных средах пептона животного происхождения, богатого гистидином, например рыбного [1]. Избыток гистидина в питательной среде может привести к синтезу гистамина при использовании в производстве штаммов-продуцентов, способных декарбоксилировать гистидин (например, Escherichia coli, бактерий родов Lactobacillus, Staphylococcus) или при контаминации микроорганизмами с гистидин-декарбоксилазной активностью.
Помимо субстанций апротинина и даунорубицина гидрохлорида, Европейская фармакопея (Ph. Eur.) ранее устанавливала требования к контролю примеси гистамина в трипсине2 и химотрипсине3. Стандартная методика, изложенная в общей фармакопейной статье (ОФС) «Испытание на гистамин» ГФ РФ4, включает в себя регистрацию сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение растворов, содержащих известные концентрации гистамина дигидрохлорида и испытуемого раствора. Однако в условиях гармонизации с ведущими фармакопеями мира и реализации концепции 3R (Замена, Сокращение, Усовершенствование; Replacement, Reduction, Refinement) использование животных при проведении биологического испытания на гистамин неэтично. Кроме того, данное in vivo испытание требует большого количества времени, является неспецифичным и приводит к вариативным результатам [7].
В результате предыдущих исследований была установлена возможность использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в различных модификациях для идентификации гистамина в конкретных ЛС [1][6]. В данной работе проведен более подробный анализ ВЭЖХ-методик, используемых для количественного определения примеси гистамина, а также оценена возможность использования иммунохимических методов анализа.
Цель работы — выбор перспективного in vitro метода количественного определения примеси гистамина в качестве альтернативы испытаниям in vivo.
Задачи исследования:
Исследование было проведено информационно-аналитическим методом. База источников литературы состоит из научных статей (1996–2024 гг.), доступных в РИНЦ и Scopus. Ключевые слова поиска: гистамин, примесь, количественное определение, биологические испытания, физико-химические методы, ВЭЖХ, иммуноферментный анализ (ИФА). Объектной базой исследования послужили фармакопеи: Ph. Eur., Фармакопея США (USP), Фармакопея Евразийского экономического союза (ЕАЭС) и ГФ РФ5.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬПодход к испытанию ЛС на содержание примеси гистамина различается в различных зарубежных фармакопеях. В настоящее время in vivo методика определения гистамина, изложенная в монографии Ph. Eur., аналогична методике, представленной в ГФ РФ. Стратегия Ph. Eur. направлена на переход от биологических методов испытаний к физико-химическим. В соответствии с утвержденным планом реализации проекта планируется исключение монографии 2.6.10 «Histamine»6 из Ph. Eur. 01.01.2026 после выпуска издания 12.1. Кроме того, заявлена разработка монографии 2.5.47 «Histamine in active substances», в которой будут описаны in vitro методы определения гистамина, в частности ВЭЖХ и ИФА7.
В документе Европейского директората по качеству ЛС и здравоохранения, помимо стратегии исключения биологических испытаний на гистамин и депрессорные вещества из Ph. Eur., описаны основные причины проведения испытаний на животных [7]. Авторы документа утверждают, что большинство in vivo методов возникли, когда:
1) не была широко распространена надлежащая производственная практика (GMP);
2) отсутствовали документы, описывающие требования к валидации методик, например, руководства Международного совета по гармонизации технических требований к ЛС для медицинского применения (ICH) Q2 (R2)8;
3) физико-химические и другие in vitro методы были малодоступны.
Развитие современных аналитических методов и внедрение GMP привели к пересмотру взглядов о проведении некоторых испытаний на животных. Например, уже в 1995 г. для ряда монографий Ph. Eur. требования к качеству ЛС по определению примесей гистамина и депрессорных веществ были перенесены в раздел «Производство» и, соответственно, перестали быть обязательными для каждой партии ЛС. Такое решение было принято после анализа данных, свидетельствующих о прохождении вышеперечисленных испытаний в течение значительного периода времени. Соответствующие разделы были оставлены в Ph. Eur. для того, чтобы производители при необходимости могли использовать эти испытания при разработке ЛС9.
В 2000 г. с целью сокращения количества испытаний на животных была введена монография «Products of fermentation» (1468)10. Хотя гистамин и депрессорные вещества не упоминались в этой версии общей монографии, в тексте было указано, что процесс обработки ЛС должен удалять нежелательные продукты трансформации субстратов и прекурсоров или сокращать их количество до минимума.
В 2017 г. сообщалось о нежелательных реакциях, вызванных использованием растворов гентамицина сульфата для инъекций. Было установлено загрязнение субстанции гентамицина сульфата гистамином. Расследование показало, что загрязнение связано с использованием в процессе ферментации сырья рыбного пептона низкого качества. Поскольку эта проблема актуальна для любых продуктов ферментации, общая монография «Products of fermentation» была пересмотрена в 2018 г. В подраздел «Исходное сырье» раздела «Производство» был добавлен следующий тезис: «Особое внимание следует уделять уровню свободного гистидина в рыбных пептонах, поскольку при определенных условиях его присутствие может приводить к образованию гистамина»11. Позднее, в 2020 г., раздел «Последующая обработка» был дополнен12: «Необходимо продемонстрировать, что выбранные процедуры сводят к минимуму или обеспечивают полное удаление гистамина и других биогенных аминов из рыбы и рыбопродуктов, используемых в качестве исходного сырья»13.
Стратегия ГФ РФ также направлена на сокращение биологических испытаний. Так, например, в тексте ОФС «Испытание на гистамин», утвержденной приказом Минздрава России14, указано, что описанный метод применяют при фармацевтической разработке ЛС, а также при оценке пригодности технологического процесса. Таким образом, как и в случае Ph. Eur., выполнение испытания не обязательно для каждой партии ЛС.
В КНР, в отличие от стран ЕС, не планирует отказ от биологических испытаний на гистамин. Монография «Испытание на гистамин» Фармакопеи КНР15 содержит более подробное описание методики испытания, чем аналогичные монографии ГФ РФ и Ph. Eur., в том числе указан диапазон концентраций гистамина двух стандартных растворов, а дополнительно специфицируется пол используемых для испытаний морских свинок.
Методики, описанные в Британской фармакопее, Индийской фармакопее и Фармакопее Бразилии16, полностью соответствуют методикам Ph. Eur. и ГФ РФ. Фармакопея Бразилии помимо испытаний на гистамин и депрессорные вещества содержит биологическое испытание на вазопрессорные вещества, проводимое на крысах. Однако такой подход не встречается в фармакопеях других стран. В Корейской фармакопее17 для определения содержания гистамина и других депрессорных веществ используют в качестве тест-моделей кошек. В 11 издании Международной фармакопеи18 монографии с требованиями испытаний на гистамин и депрессорные вещества были исключены, рассматриваемые монографии также отсутствуют в Японской фармакопее19 и Фармакопее Таиланда20.
Согласно требованиям Фармакопеи США21 контроль депрессорных веществ не предусмотрен, а испытание на гистамин представлено в формате общей главы <426> Histamine test method22, содержащей описание методики ВЭЖХ для определения гистамина в субстанции гентамицина сульфата. В тексте главы указано, что методика валидирована только для гентамицина сульфата, не является универсальной и должна быть валидирована для любых других субстанций. Биологические методы испытания на гистамин в Фармакопее США не представлены.
Анализ данных литературы позволил установить, что ВЭЖХ является наиболее часто используемым физико-химическими методом количественного определения примеси гистамина. Однако высокая полярность молекулы гистамина приводит к плохому удерживанию в типичных для обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ) условиях. Также гистамин не обладает необходимыми абсорбционными свойствами в видимом и ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, что затрудняет использование УФ-детектора для его обнаружения. По этим причинам перед ОФХ, как правило, проводят дериватизацию гистамина с использованием флуоресцентных или ион-парных реагентов. Примерами таких реагентов являются дансилхлорид и 9-фторенилметил хлорформиат [8][9]. Также могут быть использованы комбинации дериватизирующих агентов со стабилизаторами образующихся аддуктов, например о-фталевый альдегид с 3-меркаптопропионовой кислотой или с N-ацетил-L-цистеином [10][11].
Несмотря на преимущества, дериватизация не только требует много времени и средств, но и может привести к ряду дополнительных проблем. Так, для испытуемых растворов, содержащих несколько полярных функциональных групп, реакции дериватизации часто приводят к образованию побочных продуктов и не являются количественными. Еще один недостаток дериватизации заключается в том, что основным фактором удерживания будет присоединенная гидрофобная группа, поэтому близкородственные соединения после дериватизации будут разделяться хуже [12]. Добавление ион-парных реагентов может привести к снижению чувствительности при гидрировании на масс-спектрометре [13].
Примером методики, основанной на ОФХ и не требующей модификации гистамина, является упомянутая методика его определения в субстанции гентамицина сульфата. Еще один вариант реализации ВЭЖХ без предварительной дериватизации — проведение нормально-фазовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором [14]. Такой вариант был также использован для количественного определения примеси гистамина в гентамицина сульфате [15]. Промежуточная прецизионность методики составила 8,0%, повторяемость (в процентах относительно стандартного отклонения) — 10,8%, а предел количественного определения — 1,1 ppm.
Другой пример — разработанная белорусскими учеными методика определения гистамина, которая не только не требует масс-спектрометрического детектора (используется флуоресцентный детектор), но и основана на проведении ОФХ [16]. Для этой методики были продемонстрированы избирательность, повторяемость и правильность, а также определены линейность в диапазоне 20–200 мг/кг, предел обнаружения — 6,6 мг/кг и предел количественного определения — 20,0 мг/кг. Однако необходимо отметить, что данная методика разработана для определения гистамина в рыбе и рыбной продукции.
В таблице 1 представлены основные параметры методик определения гистамина методом ВЭЖХ.Из данных таблицы следует, что универсального подхода не существует, условия проведения хроматографического анализа будут зависеть от свойств и строения матрицы конкретной исследуемой субстанции. Для субстанций, обладающих отличными от гистамина строением и (или) свойствами, например для гепаринов, возможно проведение анализа методом ВЭЖХ. В этом варианте также допустимо проведение предколоночной дериватизации, так как при отсутствии близкородственных соединений дериватизирующий агент будет специфично присоединяться к гистамину.
Таблица 1. Основные параметры методик определения гистамина методом ВЭЖХ
Table 1. Main parameters of HPLC analytical procedures for histamine determination
Таблица составлена авторами / The table is prepared by the authors
Примечание. «–» — отсутствие стадии дериватизации.
Note. –, no derivatisation stage.
| Дериватизирующий агент
Derivatisation agent | Вариант хроматографии
HPLC type | Режим элюирования
Elution mode | Детектор
Detector |
| Дансилхлорид
Dansyl chloride | Обращенно-фазовая
Reverse-phase | Градиентный
Gradient | Квадрупольный масс-анализатор
Quadrupole mass analyser |
| Дансилхлорид
Dansyl chloride | Обращенно-фазовая
Reverse-phase | Изократический
Isocratic | Спектрофотометрический на диодной матрице
Diode array spectrophotometric detector |
| 9-Фторенилметил хлорформиат
9-Fluorenylmethyl chloroformate | Обращенно-фазовая
Reverse-phase | Изократический
Isocratic | Флуоресцентный
Fluorescence |
| орто-Фталевый альдегид и 3-меркаптопропионовая кислота / дитиотреитол / ацетилцистеин
o-Phthalaldehyde and 3-mercaptopropionic acid / dithiothreitol / acetylcysteine | Обращенно-фазовая
Reverse-phase | Градиентный
Gradient | Флуоресцентный или УФ
Fluorescence or UV |
| – | Нормально-фазовая
Normal-phase | Градиентный
Gradient | Квадрупольный масс-анализатор
Quadrupole mass analyser |
| – | Обращенно-фазовая
Reverse-phase | Градиентный
Gradient | Масс-анализатор
Mass analyser |
Кроме ВЭЖХ применяют другие физико-химические методы анализа. Например, несмотря на низкую летучесть гистамина, существует ряд методик его определения методом газовой хроматографии (ГХ). В статье [17] авторы используют N,O-бис(триметилсилил)ацетамид в качестве дериватизирующего агента, затем проводят парофазный анализ на капиллярной колонке и определяют гистамин количественно с помощью пламенно-ионизационного детектора и качественно с помощью масс-спектрометра. Газохроматографическая методика без использования дериватизирующих агентов была успешно применена для количественного определения примеси гистамина в рыбных продуктах и мясе креветок [18]. Также для определения гистамина используют тонкослойную хроматографию и капиллярный электрофорез [19][20].
Кроме физико-химических методов для количественного определения гистамина используют иммунохимические методы анализа. Существует множество коммерческих наборов (тест-систем), однако большинство из них разработано для определения гистамина как пищевого аллергена в продуктах питания23. Такие тест-системы, как правило, основаны на «сэндвич» (непрямом неконкурентном гетерогенном) варианте ИФА. Для определения гистамина в биологических объектах (в плазме, моче, цельной крови, супернатантах клеточных культур, экстрактах твердых биологических образцов и др.) используют принцип непрямого конкурентного гетерогенного ИФА. При этом существуют 2 способа проведения такого анализа:
1) с предварительной сорбцией антигена на планшете. В этом варианте антиген испытуемого образца конкурирует с иммобилизованным на планшете антигеном за связывание с определенным количеством меченого антитела;
2) с предварительной сорбцией антитела на планшете. В этом варианте меченый антиген и антиген испытуемого образца конкурируют за связывание с первичным антителом, иммобилизованным на лунки планшета.
Методика определения гистамина, основанная на непрямом конкурентном гетерофазном ИФА, описана в статье L. Xu и соавт. [21]. Авторы продемонстрировали линейность методики в диапазоне от 100,0 нг/мл до 10,0 мкг/мл. Было показано, что методика позволяет количественно определять гистамин в рыбном пептоне, продуктах питания (креветки, соевый соус), а также в субстанциях антибиотиков (гентамицин, амикацин и пенициллин). Открываемость для образцов данных субстанций, загрязненных гистамином, составляла 76,8–120,0%, предел обнаружения — 89,0 нг/мл. Таким образом, методика позволяет количественно определить экзогенный гистамин в загрязненных примесью гистамина ЛС.
Согласно данной методике, на лунки планшета иммобилизуют конъюгат «гистамин — овальбумин» (Гис-Ова) или «гистамин — бычий сывороточный альбумин» (Гис-БСА). Иммобилизацию гистамина, как правило, проводят в составе конъюгата, так как гистамин является гаптеном (низкомолекулярным веществом, приобретающим необходимую антигенность при увеличении молекулярной массы). Свободные участки связывания белков блокируют 2% (м/о) раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере. После трехкратной промывки в соответствующие лунки вносят разведения стандартного образца (гистамина дигидрохлорида) и испытуемого образца, а затем моноклональные антитела к гистамину в фосфатном буфере. Инкубируют, проводят аналогичную промывку. Далее планшеты инкубируют с конъюгатом козьих поликлональных антител к иммуноглобулинам мыши с пероксидазой хрена. Планшеты промывают еще раз. Затем в планшеты добавляют субстрат — 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин и инкубируют. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 2 M H2SO4. Значения абсорбции измеряют при 450 нм с помощью планшетного спектрофотометра. Количество гистамина в испытуемых растворах рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям гистамина дигидрохлорида. Сигнал обратно пропорционален количеству антигена в разведениях испытуемого образца.
В другой методике, также включающей стадию предварительной сорбции конъюгатов Гис-Ова или Гис-БСА, конкурентный ИФА-метод используют для определения эндогенного гистамина в образцах сыворотки крови пациентов с аллергическими заболеваниями [22]. Основные этапы испытания аналогичны представленным в статье [21]. Специфичность методики была доказана добавлением в реакционную среду близкородственных гистамину соединений (серотонин, дофамин, β-эндорфин, дерморфин). Максимальное значение конкурентного ингибирования составило 2% при анализе образцов с серотонином, при этом максимальная чувствительность метода составила 2,50 нг/мл.
В другом варианте выполнения анализа предусмотрена предварительная иммобилизация на микропланшет специфичных к гистамину антител24. Производитель тест-системы заявляет об открываемости методики в интервале 111–131% при испытании образцов сыворотки крови. При этом предел количественного определения составляет 0,098 нг/мл, максимальное значение внутрилабораторной прецизионности — 8,5%, межлабораторной прецизионности — 11,8%. После стадии сорбции антител на планшет в лунки вносят разведения стандартного образца и испытуемого образца с немеченым гистамином. Далее вносят меченый гистамин (конъюгат гистамина с биотином) и проводят инкубацию. Осуществляют промывку, удаляя несвязанные конъюгаты. Во все лунки вносят раствор стрептавидина или авидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, и инкубируют. Планшет промывают для удаления избытка конъюгата. Субстрат 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин добавляют в лунки и инкубируют. Для остановки ферментативной реакции добавляют стоп-раствор. Интенсивность реакции определяют при длине волны 450 нм. Количество гистамина в исследуемых образцах рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям в разведениях стандартного образца гистамина.
Количественное определение примеси гистамина с использованием методики ИФА наиболее подходит для варианта, когда гистамин имеет схожие с исследуемой субстанцией строение и (или) свойства. В этом варианте влияние матрицы должно быть минимальным за счет высокой специфичности антител к гистамину. Такой способ может подойти, например, для определения гистамина в апротинине.
Отечественные тест-системы, основанные на ИФА, способны определять гистамин в продуктах питания. Однако доступные коммерческие наборы для количественного определения примеси гистамина в субстанциях для фармацевтического применения отсутствуют. Это обусловливает необходимость разработки собственных методик и тест-систем, в основе которых может быть использован принцип непрямого конкурентного гетерогенного ИФА.