Разработка высокотехнологичных лекарственных препаратов (ВТЛП) сопряжена с применением сложных биоинженерных платформ, включая гены и клеточные системы, моноклональные антитела, использование РНК-интерференционных подходов, рекомбинантные технологии и нанотехнологии, что принципиально отличает данный класс препаратов от традиционных лекарственных препаратов [1].

ВТЛП характеризуются выраженной биологической активностью, имеют сложную структуру, как правило, неустойчивы к физико-химическим воздействиям. Эти особенности определяют повышенные требования к качеству ВТЛП. Одним из критически значимых параметров является их стерильность, поскольку наличие даже единичных микроорганизмов может повлечь тяжелые последствия для пациента, особенно в условиях парентерального введения, иммуносупрессии или иммунодефицита — состояниях, при которых часто используются ВТЛП [2].

Контроль стерильности ВТЛП может быть сопряжен с рядом методологических трудностей. Компоненты препаратов (стабилизаторы, антибиотики, сурфактанты, консерванты и другие вспомогательные вещества) могут проявлять выраженное ингибирующее действие на рост микроорганизмов, детектируемых стандартными методиками контроля стерильности, что приводит к получению ложноотрицательных результатов и снижению достоверности контроля [3]. При использовании метода мембранной фильтрации возможна закупорка пор мембран и нарушение фильтрации в целом из-за высокой вязкости препарата, пенообразования, наличия белковых агрегатов. Кроме того, ВТЛП могут быть контаминированы специфическими микроорганизмами, что вызовет необходимость коррекции условий инкубации.

Состав ВТЛП (живые клетки, рекомбинантные белки, генно-инженерные конструкции и другие потенциально нестабильные компоненты) определяет ограничение срока их хранения1. Это, в свою очередь, требует сокращения времени проведения обязательных испытаний качества, в том числе подтверждения стерильности. Однако классическая фармакопейная методика, основанная на фиксации роста микроорганизмов, предусматривает инкубацию образцов не менее 14 сут [4], что делает невозможным быстрое принятие решений о выпуске серии и требует совершенствования подходов.

ВТЛП могут использоваться в рамках персонализированной терапии как препараты, предназначенные для индивидуального применения, в малых объемах [5]. Это означает, что количество доступного для испытаний материала строго ограничено, а потеря даже небольшого объема может критично сказаться на обеспечении пациента необходимой терапией2.

Одним из возможных решений описанных проблем является разработка альтернативных микробиологических методов, учитывающих специфику ВТЛП, позволяющих сократить сроки анализа по показателю «Стерильность», снизить необходимый объем исследуемой пробы и при этом сохранить высокую чувствительность и надежность микробиологического контроля3.

Цель работы — оптимизация методики контроля стерильности высокотехнологичных лекарственных препаратов методом колориметрического определения углекислого газа.

Задачами исследования являются:

Материалы. В качестве объекта исследования был использован экспериментальный образец генотерапевтического ВТЛП. Тест-штаммы микроорганизмов и условия инкубации приведены в таблице 1.

Питательные среды:

Методы. В соответствии с требованиями Европейской фармакопеи и Фармакопеи США5 при контроле стерильности ВТЛП наряду с классическими методами — прямым посевом и мембранной фильтрацией — допускается применение альтернативных методик, включая автоматизированные системы, обеспечивающие эквивалентную чувствительность и воспроизводимость. В настоящее время не существует универсального альтернативного подхода к оценке стерильности лекарственных средств, что обусловливает необходимость подбора альтернативного микробиологического метода с учетом специфики каждого анализируемого препарата6. При выборе метода учитывают физико-химические свойства исследуемого образца, возможность фильтрации, наличие антимикробного действия, а также другие свойства препарата, способные повлиять на достоверность и воспроизводимость результатов.

Проведена сравнительная оценка методов, применимых для контроля стерильности ВТЛП: классического фармакопейного метода прямого посева и альтернативной методики, основанной на колориметрическом определении углекислого газа (CO2), продуцируемого в процессе микробиального метаболизма [6].

Культуры микроорганизмов, инкубированные в течение 24 ч на скошенных агаризованных питательных средах, смывали стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Полученные суспензии стандартизировали с использованием международного стандарта мутности ВОЗ 10 МЕ. В работе использовали суспензии конидий плесневых грибов и спор Bacillus subtilis с заранее установленной концентрацией клеток.

Путем последовательных разведений получали взвеси тест-штаммов с теоретической концентрацией 30 КОЕ/мл. Фактическое содержание клеток в суспензии подтверждали путем поверхностного посева на соответствующие агаризованные питательные среды (триптиказо-соевый агар и агар Сабуро с декстрозой и хлорамфениколом, HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия, кат. № M290-500G, M1067-500G). Отклонение фактического значения от теоретического составляло не более 8,3%.

При подтверждении оптимального количества ВТЛП и времени инкубации посевов для анализа стерильности в асептических условиях ламинарного шкафа Purifier Logic A2 (Labconco, США) в пробирки и флаконы с подходящими питательными средами вносили в двадцатикратной повторности по 0,1; 0,5 и 1,0 мл контаминированных тест-штаммами образцов ВТЛП, при этом концентрация клеток составляла ~3 КОЕ/мл. На данном этапе исследования использовали 5 видов аэробных и анаэробных бактерий (B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, C. sporogenes, C. acnes) и 2 вида дрожжевых и плесневых грибов (C. albicans, A. brasiliensis). Пробирки инкубировали в термостатах в течение 14 сут. Инокулированные флаконы помещали в инкубационный модуль прибора BacT/ALERT 3D Dual T и культивировали 7 сут. Наблюдение и учет результатов проводили ежедневно, просматривая пробирки в проходящем свете. При наличии помутнения питательной среды, образования пленки или появлении осадка фиксировали наличие роста микроорганизмов. Автоматический мониторинг с детекцией контаминированных флаконов и построением кривых роста микроорганизмов проводили с использованием системы BacT/ALERT 3D Dual T.

Правильность методики оценивали как долю обнаружения контаминированных образцов (К, %), выраженную в виде отношения числа положительных проб к истинному (фактическому) количеству инокулированных образцов. Правильность методики считали приемлемой, если доля обнаружения контаминированных образцов составляла не менее 70% от установленного фактического значения7.

Оценка и интерпретация ключевых валидационных характеристик методики, включая предел обнаружения (LOD50), правильность и прецизионность, отражающих возможность детектировать микроорганизмы с уровнем чувствительности и воспроизводимости, не уступающим фармакопейному методу прямого посева, были описаны ранее [6].

Применимость метода контроля стерильности лекарственных препаратов путем колориметрического определения СО2. Альтернативный метод определения стерильности представляет собой микробиологическую методику, предназначенную для выявления контаминантной микрофлоры в различных типах лекарственных препаратов, отличающуюся от классического фармакопейного подхода по ряду технологических и методологических параметров — включая способ проведения анализа, тип применяемого оборудования, используемые питательные среды, а также продолжительность исследования [7]. Такие методики разрабатываются с целью повышения чувствительности, специфичности, воспроизводимости и оперативности получения аналитических данных по сравнению с традиционными фармакопейными методами [7][8]. В ряде случаев альтернативные методики реализуются в автоматизированных форматах, что обеспечивает регистрацию, обработку и предоставление результатов в виде стандартизированного отчета по проведенному исследованию.

В 2000 г. Американской ассоциацией по парентеральным лекарственным средствам (Parenteral Drug Association, PDA) был выпущен первый официальный документ, регламентирующий принципы оценки, валидации и внедрения альтернативных микробиологических методик8. В 2006 г. Центром по оценке и исследованию биологических препаратов (Center for Drug Evaluation and Research, CDER) Управления по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (Food and Drug Administration, FDA) была опубликована статья, посвященная применению ускоренных микробиологических методов, в которой авторы продемонстрировали преимущества новых подходов по сравнению с фармакопейными — в первую очередь по скорости получения результата и точности при контроле качества лекарственных средств [9].

В Европейской фармакопее9 все альтернативные микробиологические методики разделены на 3 типа:

Некоторые альтернативные методики сочетают фармакопейные и альтернативные подходы к анализу стерильности.

Близкой к традиционным методам испытания является методика, основанная на способности микроорганизмов к росту с выделением СО2 и возможности его обнаружения в среде культивирования. Одним из ключевых достоинств этой методики является высокая чувствительность, что позволяет фиксировать минимальные концентрации СО2, выделяемого на ранних стадиях роста микроорганизмов. В отличие от фармакопейного метода, предполагающего визуальную оценку прозрачности среды, колориметрическая методика основана на регистрации изменений pH питательной среды вследствие растворения образовавшегося CO2, что сопровождается изменением цвета встроенного во флакон индикатора.

В результате метаболической активности аэробные и анаэробные микроорганизмы, включая дрожжевые и плесневые грибы, при инкубации в соответствующих жидких питательных средах выделяют CO2. Кумулятивная концентрация CO2 и изменение кислотности среды в герметично закрытых инкубационных флаконах коррелирует с уровнем микробной контаминации и может быть детектирована с использованием специализированных сенсорных систем [6]. Непрерывный автоматизированный мониторинг (с интервалом измерений около 10–15 мин) и автоматизация построения кривых роста микроорганизмов позволяют исключить влияние человеческого фактора. Еще одним важным преимуществом является существенное сокращение времени анализа — при использовании колориметрических систем регистрация сигнала возможна уже через 24–120 ч в зависимости от вида оборудования и типа микроорганизмов, в то время как фармакопейные методы требуют инкубации продолжительностью до 14 сут10.

Данный принцип реализован, в частности, в автоматизированной системе микробиологического контроля BacT/ALERT 3D Dual T (bioMerieux SA, Франция), позволяющей проводить непрерывный мониторинг роста микроорганизмов по уровню продуцируемого CO2. BacT/ALERT 3D Dual T представляет собой высокотехнологичную платформу, обеспечивающую инкубацию флаконов с тестируемыми образцами в специализированных модулях с одновременным их покачиванием, что способствует оптимизации условий для микробного роста. Одновременно осуществляется непрерывный мониторинг оптических изменений, регистрируемых цветоизменяющимися сенсорами, отражающими метаболическую активность микроорганизмов. Анализатор характеризуется высокой пропускной способностью: до 240 флаконов могут инкубироваться и анализироваться параллельно в автоматическом режиме. На территории Российской Федерации и в других странах данный прибор широко используется для контроля стерильности гемопрепаратов, а также других стерильных биологических жидкостей, включая ликвор, лимфу и синовиальную жидкость [10]. Результаты многих исследований подтверждают, что система позволяет выявить присутствие в том числе и медленнорастущих микроорганизмов в течение сравнительно короткого периода времени — от 24 до 72 ч [11]. В соответствии с требованиями Европейской фармакопеи инкубация флаконов с отсутствием признаков роста продолжается вплоть до 7 сут11, что обеспечивает необходимую чувствительность и соответствие нормативным стандартам.

В 2010 г. исследовательская группа под руководством C. Mastronardi выполнила комплексную валидационную оценку функциональных характеристик системы BacT/ALERT, в ходе которой было установлено, что все целенаправленно внесенные в образцы аэробные и анаэробные микроорганизмы были обнаружены в течение 28 ч, за исключением Propionibacterium acnes (Cutibacterium acnes), инкубация которых до момента выявления составила около 134 ч [12]. Авторами данной работы ранее было проведено валидационное исследование, подтвердившее применимость альтернативной методики, реализованной в системе BacT/ALERT 3D Dual T, для анализа стерильности различных групп лекарственных средств, включая субстанции, биотехнологические, биологические ЛП, биомедицинские клеточные продукты и высокотехнологичные лекарственные средства12 [13–15].

Питательные среды в контроле стерильности методом определения СО2. Фармакопейные методы определения стерильности традиционно основываются на применении двух стандартных жидких питательных сред — триптиказо-соевого бульона и жидкой тиогликолевой среды, обеспечивающих рост аэробных и анаэробных микроорганизмов соответственно13. Однако корректировка условий выполнения методик в части используемых питательных сред остается важным направлением микробиологической практики. Были созданы модифицированные среды, рецептурный состав которых изменен с целью их адаптации под специфические задачи (например, создание анаэробной среды и др.) и требования к чувствительности, селективности и воспроизводимости методики [15].

TSB и FTM предназначены для выявления стандартного набора тест-штаммов, рекомендованных фармакопеями (например, S. aureus, B. subtilis, C. albicans и др.). Однако в случае медленнорастущих бактерий (например, Cutibacterium acnes), поврежденных микроорганизмов, дрожжевых и плесневых грибов с длительным периодом латентности может потребоваться до 9–14 сут инкубации при строгом анаэробиозе [16], что неприемлемо для потенциально нестабильных ВТЛП, требующих быстрого выпуска и применения.

Значимой проблемой при использовании автоматизированных систем является оценка возможности получения ложноотрицательных результатов [17]. Их недооценка может повлечь за собой искажение результатов испытаний. При использовании питательной среды SA для детекции плесневых грибов было зафиксировано от 13 до 70% ложноотрицательных результатов в зависимости от вида исследуемых микроорганизмов. На рисунке 1 видна локализованная микробиальная колонизация в пригорловом участке флаконов iLYM и одиночные микромицетные включения сферической формы, свободно плавающие в питательной среде SA. Это свидетельствует о том, что система не регистрировала рост, несмотря на его визуальное наличие во флаконах. В ходе оценки ростовых характеристик питательной среды iLYM было установлено, что кратковременная аэрация флакона с помощью стерильной полой иглы в течение 5–7 с позволяет существенно уменьшить частоту ложноотрицательных результатов (табл. 2).

При проведении испытаний с использованием питательных сред TSB и FTM случаев получения ложноотрицательных результатов не выявлено, так как детекцию микробного роста осуществляли визуально, а при возникновении сомнений в интерпретации признаков помутнения или осадка выполняли пересев исследуемых образцов на питательные среды, рекомендованные ведущими фармакопеями для выявления бактерий и дрожжевых и плесневых грибов. Применение данного подтверждающего этапа обеспечивало достоверность полученных результатов. Использование питательных сред SA и SN для выявления аэробных и анаэробных бактерий соответственно не сопровождалось получением ложноотрицательных результатов, что указывает на достаточную чувствительность и пригодность данных сред для контроля в соответствии с установленными требованиями [13]. При применении питательных сред SA и iLYM для выявления Candida albicans ложноотрицательные результаты не зафиксированы, различия во времени детекции между средами не достигали статистической значимости (p>0,05).

Продолжительность инкубации. Согласно предписаниям большинства ведущих фармакопей14, вне зависимости от применяемой методики (прямой посев, мембранная фильтрация) продолжительность инкубации при проведении анализа стерильности должна составлять не менее 14 сут. Исключение представляет Индийская фармакопея15, допускающая сокращение инкубационного периода до 7 сут в случае анализа лекарственных препаратов, подвергшихся финишной стерилизации. Кроме того, Европейская фармакопея предусматривает возможность сокращения срока инкубации до 7 сут для отдельных категорий лекарственных средств при применении альтернативных подходов к определению стерильности при условии демонстрации эквивалентной чувствительности метода и его соответствующей валидации16.

Современные требования Надлежащей производственной практики (Good Manufacturing Practice, GMP)17 и Управления рисками при обеспечении качества (Quality Risk Management, QRM, ICH Q9)18 предполагают соответствие применяемых аналитических стратегий уровню рисков, присущих конкретному продукту. Для ВТЛП, особенно нестабильных или используемых при неотложных состояниях пациентов, применение альтернативных валидированных методов микробиологического анализа с сокращенным временем получения результата — не только допустимая, но и рекомендованная практика, отражающая принцип «контроль, ориентированный на продукт».

Авторами было проведено сравнение времени детекции микроорганизмов, внесенных в ВТЛП, в рамках анализа их стерильности при использовании традиционной и альтернативной методик (рис. 2). Полный спектр контаминирующих ВТЛП микроорганизмов может быть обнаружен в течение 7 сут инкубации вне зависимости от используемого для анализа объема образца. При использовании автоматизированной системы BacT/ALERT 3D Dual T время выявления микробной контаминации (за исключением C. albicans) сокращается на 0,38–2,4 сут по сравнению с традиционным методом прямого посева, что согласуется с литературными данными [18]. При варьировании объемов ВТЛП время детекции контаминации альтернативной методикой не изменяется, различия между группами не достигают уровня статистической значимости (p>0,05).

Объем образца. Одним из ключевых факторов, влияющих на получение достоверных результатов анализа стерильности, является объем исследуемого образца. Снижение объема пробы ВТЛП при проведении испытаний — это критически важный аспект, имеющий большое практическое значение. Большинство ВТЛП производятся малыми партиями, часто в условиях персонализированной или экспериментальной терапии. Объем готовой продукции может быть ограничен миллилитрами, а стоимость — достигать миллионов рублей за дозу [19]. Поэтому отбор даже нескольких миллилитров, необходимых для классического микробиологического исследования, может существенно повлиять на доступность терапии для пациента.

ВТЛП часто выпускают в режиме «точно в срок» строго для лечения конкретного пациента. Повторный отбор той же серии невозможен из-за нестабильности действующего вещества, биологических ограничений (модифицированные клетки теряют жизнеспособность), индивидуального характера терапии (например, аутологичный клеточный продукт). Соответственно, снижение объема пробы для анализа критично для обеспечения сохранности терапевтической дозы.

В связи с вышесказанным было проведено исследование, позволяющее экспериментально установить минимальное количество ВТЛП, которое позволяет обнаружить микроорганизмы в исследуемом образце (табл. 3).

Оптимальный объем пробы ВТЛП, обеспечивающий надежную детекцию микроорганизмов при использовании фармакопейных питательных сред, составляет 1,0 мл на каждую среду. В то же время при применении автоматизированной системы BacT/ALERT 3D Dual T эффективным для посева объемом образца на каждую из сред является 0,5 мл (табл. 3). Данные результаты демонстрируют высокую чувствительность и эффективность автоматизированной системы при меньшем расходе исследуемого образца, что особенно актуально при контроле качества дорогостоящих и ограниченных по объему ВТЛП.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: М.В. Рощина — работа с источниками литературы, выполнение эксперимента, написание текста рукописи; Н.Г. Сахно — проведение эксперимента, обработка первичных данных и проведение вычислений; О.В. Гунар — концепция исследования, редактирование, критический пересмотр и утверждение окончательной версии рукописи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contribution were as follows. Marina V. Roshchina analysed literature, performed experiments, and composed the manuscript. Nadezhda G. Sakhno performed the experiments, processed primary data, and provided basic calculations. Olga V. Gunar conceptualised the research, edited the manuscript, and critically reviewed the text.

1. 2.6.27. Microbiological examination of cell-based preparations. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021. 2. Федеральный закон от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств». 3. 2.6.27. Microbiological examination of cell-based preparations. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021. 4. ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018. 5. 2.6.27. Microbiological examination of cell-based preparations. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021.〈1046〉 Cell-based advanced therapies and tissue-based products. United State Pharmacopeia. 47–NF42. 2024. 6. 5.1.6. Alternative methods for control of microbiological quality. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021.〈1223〉 Validation of alternative microbiological methods. United State Pharmacopeia. 47–NF42. 2024. 7. ОФС.1.1.0021.18 Валидация микробиологических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018. 8. Validation of growth-based rapid microbiological methods for sterility testing of cellular and gene therapy products. Guidance for industry. FDA, CDER; 2008. 9. 5.1.6. Alternative methods for control of microbiological quality. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021. 10. ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018. 11. 5.1.6. Alternative methods for control of microbiological quality. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021. 12. Рощина МВ. Применение альтернативных микробиологических методов для испытания стерильности лекарственных препаратов: автореф. дис. … канд. фарм. наук. М.; 2018. 13. ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018. 14. ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018. 2.6.1. Sterility. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021.〈71〉 Sterility Tests. United State Pharmacopeia. 47–NF42. 2024. 4.06. Sterility Test. Japanese Pharmacopoeia. XVIII ed. V. 1. Tokyo; 2021. 15. 2.6.1. Test for Sterility. Indian Pharmacopoeia. V. 1. New Delhi; 2021. 16. 2.6.27. Microbiological examination of cell-based preparations. European Pharmacopoeia. 11.0 ed. Strasbourg: EDQM; 2021. 17. Current Good Manufacturing Practice (CGMP) Regulations. FDA; 2013. 18. ICH guideline Q9 on quality risk management. EMA; 2015.