Современные методы определения размеров частиц (мельчайших фрагментов вещества с определенными физическими границами) с необходимой достоверностью позволяют определить гранулометрический состав лекарственных средств и оценить потенциальные риски при медицинском применении лекарственных препаратов в связи с наличием невидимых частиц, особенно это необходимо применительно к инъекционным, ингаляционным, офтальмологическим формам лекарственных средств1. Выделяют два подхода к оценке качества лекарственных средств по количеству частиц: определение фракционного состава (распределение частиц по размеру) активных ингредиентов, гранул и капель, суспензий как физической характеристики, которая влияет на такие параметры, как эффективность доставки (ингаляторы), биодоступность активного вещества, прочность, текучесть, стабильность эмульсии или суспензии, вязкость (назальные спреи), безопасность применения, однородность содержимого дозы, седиментационная устойчивость суспензий и их стабильность2 [1], и оценка содержания посторонних частиц, содержание которых регламентируется в зависимости от их размеров. Контаминация посторонними невидимыми частицами лекарственных препаратов может приводить к негативным последствиям при их применении, выражающимся в нежелательных реакциях, вплоть до патологических изменений в организме больного человека, при попадании в кровяное русло способствует нарушению кровотока, вызывая гранулемы и тромбозы [2–6]. В ведущих фармакопеях представлен ряд монографий, в которых регламентируются содержание и распределение по размерам невидимых частиц (не более 100 мкм) в лекарственных средствах и приводятся методы определения этих параметров3.

Невидимые частицы разделяют на внешние посторонние, внутренние (специфические) включения и включения, связанные с физическими свойствами лекарственного средства, например в препаратах белковой природы (феномен ассоциации белков)4.

Цель работы — систематизация методов определения размеров невидимых частиц в лекарственных формах.

Наиболее часто используемыми методами оценки лекарственных средств по содержанию частиц и их распределению являются метод лазерной дифракции (ЛД), метод динамического рассеяния света (ДРС), оптическая микроскопия в разных модификациях (ММ) и метод светоблокировки (счетно-фотометрический метод, СФМ). Все перечисленные методы фармакопейные и включаются в спецификации, если это предусмотрено стандартом качества для конкретного лекарственного средства.

Методы ЛД и ДРС в основном используются для определения среднего размера частиц, оценки распределения частиц по размерам, что позволяет оценить гранулометрический состав как готовой лекарственной формы, так и ингредиентов, в том числе фармацевтических субстанций5. Оба метода основаны на использовании лазерного света, рассеянного частицами испытуемого образца, однако физико-химические принципы, на которых они основаны, различны, что подразумевает использование разного оборудования [7].

ЛД — это статистический метод, который определяет размер не каждой отдельной частицы, а совокупности всех частиц в пробе, основанный на определении зависимости угла дифракции от размера частиц при воздействии лазерного облучения на диспергированный образец. Угол дифракции и интенсивность рассеянного света зависят от размера частиц. Более мелкие частицы рассеивают лазерный свет под большими углами со слабой интенсивностью, а более крупные — под малыми углами с более сильной интенсивностью. В результате анализа получают интегральное распределение частиц по размерам. Для преобразования используются математические модели, которые должны быть указаны в методиках, наиболее часто используемыми из них являются аппроксимация Фраунгофера и теория Ми. Аппроксимация Фраунгофера в основном подходит для непрозрачных и крупных частиц более 25 мкм6 [8]. Теория Ми позволяет получать более точные результаты для частиц различных размеров (от мм до нм), помимо самой дифракции учитывает еще рассеяние и поглощение, что делает результаты исследования зависимыми от значения комплексного показателя преломления исследуемых частиц и среды диспергирования, которые должны быть указаны в нормативных документах7. На основании полученных данных строится кумулятивная кривая, что позволяет получить общее распределение, способ графического оформления результатов описан в документе International Council for Harmonisation (ICH)8.

В нормативных документах, как правило, результаты измерений представляют в виде процентильных значений, которые принято обозначать буквой D или Х. Обычно указываются значения D10, D50 и D90. D50 является медианным диаметром и обозначает, какой диаметр имеют не менее 50% всех частиц в исследуемом образце. D10 и D90 — размер частиц, соответствующий объемной доле частиц 10 и 90% соответственно. Промышленными приборами предусмотрены два способа оценки распределения частиц по размерам: от общего объема всех частиц и от общего количества всех частиц. В нормативных документах в основном нормируется объемное распределение частиц по размерам9.

Преимущества метода ЛД — точное определение широкого диапазона размеров частиц от нм до мм, универсальность, высокая пропускная способность в сочетании с достаточно коротким временным промежутком анализа одной пробы. Ограничение метода обусловлено особенностями работы приборов, конструкция которых предусматривает, что все частицы обладают сферической формой, поэтому если исследуемый образец имеет игольчатую форму, частица будет интерпретироваться либо как «крупная», либо как «мелкая» в зависимости от ориентации частицы, проходящей через лазерный луч10.

Метод ДРС используется для определения размеров частиц, диспергированных в растворе, которые в процессе броуновского движения взаимодействуют с лазерным лучом. Стандарт ISO 22412:2017 для определения среднего гидродинамического размера частиц и распределения по размерам частиц преимущественно субмикронных, эмульсий или мелких пузырьков, диспергированных в жидкостях, рекомендует применение метода динамического рассеяния света (ДРС)11. Частицы дисперсных систем (до ~2 мкм) подвержены постоянному хаотическому движению. Броуновское движение вызывает колебания интенсивности дифрагированного света. Возникающие колебания интенсивности измеряются под заданным углом при помощи детектора, который связывает их с размером частиц; более крупные частицы движутся медленнее мелких частиц, поэтому интенсивность рассеянного света в этом случае меняется с большей периодичностью12. Метод ДРС в качестве основного используется для определения размера липидных капель в липидных инъекционных эмульсиях, для которых размер капель имеет решающее значение, так как капли размером свыше 5 мкм могут задерживаться в легких из-за механической фильтрации13. Настройки прибора и подготовка образцов для испытания зависят от концентраций суспензий14. Путем математических преобразований оценивается средний размер частиц в пробе и индекс полидисперсности, который характеризует диапазон распределения частиц. Результаты могут быть также выражены в процентильных значениях. Диапазон измерений методами ДРС и ЛД отчасти перекрывается, однако для анализа мельчайших частиц размером до 0,3 нм метод ДРС предпочтительнее, при этом концентрации испытуемых растворов могут быть от единиц ppm до 40 об.%. Преимуществом этого метода является возможность измерения непосредственно в исследуемом образце и дополнительного учета дзета-потенциала15. Интерпретация результатов ДРС может осложняться, если в образце присутствуют конгломераты [9].

При использовании методов ЛД и ДРС для оценки качества лекарственного средства нормативные требования приводятся в спецификациях на конкретную лекарственную форму или анализируемый ингредиент, используемый при производстве препарата.

Метод светоблокировки (счетно-фотометрический метод, СФМ) основан на освещении участка детектора при прохождении разреженного потока частиц в жидкой суспензии между источником света и детектором. Например, в приборе HIAC (Beckman Coulter) для подсчета частиц в жидкостях источником света является лазерный диод, который освещает отдельные частицы в потоке для получения тени или блокировки освещения участка детектора16. Считается, что этот метод применим только для суспензий в концентрациях, позволяющих в один момент времени проходить через поток освещения (лазерный луч) только одной частице, коэффициент уменьшения интенсивности проходящего луча (Q) составляет ~2. Такое значение Q наблюдается для сферических частиц диаметра ~10 мкм, коэффициент преломления которых отличается от коэффициента преломления матричной жидкости более чем на 0,1 [10]. Метод СФМ используется в основном для определения посторонних невидимых частиц в инъекционных препаратах, в лекарственных формах, предназначенных для имплантации, в офтальмологических растворах17. Объем проб, используемых в эксперименте, может варьировать от 0,1 до 25 мл [11]. В фармацевтической практике этот метод используется для определения количества невидимых посторонних частиц, размер которых находится в заданном диапазоне (как правило, 5, 10 и 25 мкм) и не предназначен для оценки распределения частиц по размерам. Преимуществами метода являются возможность проведения эксперимента в течение короткого промежутка времени, минимальное участие оператора-экспериментатора, в большинстве случаев не требуются дополнительные химические реактивы. Недостатком данного метода является невозможность проведения испытания лекарственных средств в виде эмульсий, коллоидных и липосомальных препаратов, препаратов, при растворении которых образуются обильные воздушные или газовые пузырьки18.

Размер частиц, которые могут быть определены методом микроскопии (ММ), зависит от разрешающей способности микроскопа и обычно превышает 1 мкм. Микроскопы с общим увеличением более ×1500 позволяют охарактеризовать объекты размером от 0,5 мкм с разрешением отдельных структур объекта до 0,1 мкм19. Для определения невидимых частиц используются несколько модификаций ММ: подсчет невидимых частиц на поверхности высушенного мембранного фильтра после пропускания через мембрану растворов лекарственных препаратов20, микроскопический метод с визуализацией потока.

Для рутинного контроля лекарственных средств предусмотрен фармакопейный метод ММ. Исследование проводится с использованием бинокулярного микроскопа с увеличением ×100±10, оснащенного откалиброванным микрометром и подставкой для размещения мембранного фильтра21. Для испытания также требуется фильтрационная установка с подходящим мембранным фильтром с размером пор не менее 1 мкм. Метод ММ предусмотрен для выявления посторонних (инородных) частиц, когда использование метода светоблокировки невозможно из-за природы лекарственного средства. Существенные недостатки данного способа — это трудности в подсчете частиц с низкой контрастностью, например частиц белка и частиц с незначительным рельефом поверхности. Метод ММ в большой степени зависит от подготовки операторов, которые осуществляют визуальный осмотр, от настройки микроскопа для получения качественного изображения. Проблемы возникают при оценке частиц неправильной формы или частиц с размерами, граничащими с диапазоном определения (например, размер частиц 9 или 11 мкм)22.

Методы СФМ и ММ используются в рутинном контроле лекарственных препаратов, нормативные требования гармонизированы в ведущих фармакопеях, в том числе и в фармакопее Российской Федерации, и обусловлены как спецификой конкретного метода, так и фасовкой препарата. Содержание посторонних невидимых частиц размером 10 мкм и более и частиц размером 25 мкм и более в препаратах с максимальным номинальным объемом 100 мл в одном контейнере при использовании метода ЛД не должно превышать 6000 и 600 соответственно, при использовании метода ММ — 300 и 3000 соответственно.

Для препаратов с номинальным объемом более 100 мл результаты по содержанию частиц не менее 10 мкм и не менее 25 мкм приводятся не на контейнер, а на 1 мл, для метода ЛД содержание частиц минимального нормируемого размера не должно превышать 25 частиц и для максимального — 3 частицы, для метода ММ — 12 и 2 частицы соответственно.

Из микроскопических методов наиболее перспективным считается микроскопический метод с визуализацией потока, который дает возможность не только подсчитать количество невидимых частиц, но и оценить их морфологию. Микроскопия с визуализацией потока — быстрый автоматизированный метод, который позволяет получить изображение (размер, количество, форма) микроскопических частиц в жидкости, проходящей через проточную ячейку23. Метод широко используется для определения характеристик и подсчета твердых частиц, рекомендован для анализа прозрачных частиц, которые сложно обнаружить с помощью иных методов, позволяет оценить распределение частиц по размерам и их концентрацию [12]. Кроме того, частицы можно группировать по морфологии, зафиксировать в определенном диапазоне размеров изображения всех частиц и архивировать полученное изображение.

Этот способ также дает возможность исследовать загрязнение образца посторонними частицами24. Визуализация потока в диапазоне частиц размером 2–100 мкм позволяет различать удлиненные волокна, плотные симметричные пузырьки воздуха, круглые капли силиконового масла, аморфные белковые частицы и часто используется как дополнение к методам СФМ и мембранного микроскопа (ММ)25.

Метод ММ с визуализацией потока активно применяется для анализа белковых частиц, в том числе для определения частиц, полученных из терапевтических моноклональных антител [13]. Преимущество вышеописанного способа — это селективность, повторяемость, высокое разрешение; ограничения связаны с трудностью визуализации частиц с невысокой оптической контрастностью, зависимостью результатов от алгоритма, используемого для отбора классификации частиц, испытуемый образец невозможно использовать повторно26.

Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)27 в основном используется при технологических разработках в производстве лекарственных препаратов (ЛП), в том числе для получения информации о частицах нежелательного источника контаминации лекарственного средства.

Методы ММ с визуализацией потока и СЭМ не используются для рутинного контроля лекарственных средств, а являются дополнительными инструментами для определения особенностей гранулометрического состава и выявления нежелательной контаминации посторонними частицами как лекарственных препаратов, так и ингредиентов, входящих в состав конкретного ЛП.

Все рассмотренные методы определения размеров и распределения невидимых частиц применяются в фармацевтической практике для оценки качества лекарственных средств. Выбор метода зависит от задачи и объекта исследования. Для выявления невидимых посторонних частиц в лекарственных препаратах в соответствии с нормативными требованиями преимущественно используются методы светоблокировки и микроскопический, основанный на пропускании испытуемого образца через мембранные фильтры. Для определения фракционного состава в виде распределения частиц по размерам практикуются методы светоблокировки и динамического рассеивания света. При применении каждого из перечисленных методов следует учитывать тип и размер частиц, технологию лекарственного средства, физико-химические свойства испытуемого образца, скорость анализа, требования к точности метода, наличие оборудования и программного обеспечения, компетенцию персонала. В ряде случаев требуется комбинирование разных методов для получения наиболее достоверных результатов или применение наиболее универсальных способов, в частности микроскопического метода с визуализацией потока, которые позволят определить размер, форму, природу невидимых частиц и содержание частиц конкретного размера в общем количестве.

Использование рассмотренных методов в соответствии с фармакопейными требованиями и рекомендациями как каждого отдельно, так и в комплексе, позволят достоверно и качественно оценить лекарственное средство, конкретную лекарственную форму по содержанию невидимых частиц при исследовании предельного их содержания и распределения по размерам для получения продукта высокого качества и безопасного при медицинском применении.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: С.И. Кулешова — концепция, сбор данных, написание текста и критический пересмотр его содержания; М.Л. Горюнова — сбор данных, анализ данных, подготовка текста рукописи; О.Н. Высочанская — сбор данных, анализ данных, подготовка текста рукописи.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Svetlana I. Kuleshova conceptualised, collected data, drafted for manuscript and critical review of its content. Maria L. Goryunova collected and analysed data, drafted for manuscript. Olga N. Vysochanskaya collected and analysed data, drafted for manuscript.

1. ISO 22412:2017 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS). 2. ISO 9276-2:2014 Гранулометрический анализ. Представление результатов. Часть 2: Расчет средних размеров, диаметров частиц и моментов по распределению частиц по размерам. 3. ОФС.1.4.2.0006 Невидимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.5.7 Test for particulate contamination, 5.7.1 Subvisible particles. International Pharmacopoeia. 12th ed. 2025.2.9.19 Particulate contamination: sub-visible particles. European Pharmacopoeia 11.8.2.9.53 Particulate contamination: sub-visible particles in non — injectable liquid preparation. European Pharmacopoeia 11.8.<1788> Methods for the determination of subvisible particulate matter. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 4. <430> Particle size analysis by dynamic light scattering. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 5. <430> Particle size analysis by dynamic light scattering. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024.<1788> Methods for the determination of subvisible particulate matter. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024.2.9.31 Particulate size analysis laser light diffraction. European Pharmacopoeia 11.8. 6. ОФС.1.4.2.0008.15 Определение частиц по размеру методом лазерной дифракции света. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018. 7. ОФС 2.1.9.26 Определение размера частиц методом дифракции лазерного излучения. Фармакопея Евразийского экономического союза. Т. 1, ч. 2. М.; 2023. 8. ISO 9276-2 Representation of results of particle size analysis. Part 1: Graphical representation. 9. ОФС.1.4.2.0008.15 Определение частиц по размеру методом лазерной дифракции света. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018. 10. https://www.microtrac.com/files/3682/combination-of-laser-diffraction-and-image-analysis-ru.pdf 11. ISO 22412:2017 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS). 12. <430> Particle size analysis by dynamic light scattering. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 13. <729> Globule size distribution in lipid injectable emulsions. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 14. ISO 22412:2017 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS). 15. https://www.microtrac.com/ru/products/dynamic-light-scattering/ 16. https://www.beckman.co.il/ru/resources/industry-standards/usp-787/light-obscuration-optical-method-for-particle-detection 17. 5.7.1 Subvisible particles. International Pharmacopoeia. 12th ed. 2025.2.9.19 Particulate contamination: sub-visible particles; 2.9.53 Particulate contamination: sub-visible particles in non-injectable liquid preparation. European Pharmacopoeia 11.8.<1788> Methods for the determination of subvisible particulate matter. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024.<430> Particle size analysis by dynamic light scattering. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 18. ОФС.1.4.2.0006 Невидимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 19. ОФС.1.2.1.0009 Оптическая микроскопия. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023. 20. <1788.2> Membrane microscope method for the determination of subvisible particulate matter. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 21. 5.7.1 Subvisible particles. International Pharmacopoeia. 12th ed. 2025. 22. <1788.2> Membrane microscope method for the determination of subvisible particulate matter. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 23. https://www.fluidimaging.com/blog/what-is-flow-imaging-microscopy 24. Schwandt CS, Koten M, Stoeffler S. Flow imaging microscopy: A new analytical capability. https://www.mccrone.com/mm/flow-imaging-microscopy-a-new-analytical-capability 25. <1788.3> Flow imaging method for the determination of subvisible particulate matter. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 26. <1787> Measurement of subvisible particulate matter in therapeutic protein injections. United States Pharmacopeia USP–NF/PF; 2024. 27. ОФС.1.2.1.001 Сканирующая электронная микроскопия. Государственная фармакопея Российской Федерации. XV изд. М.; 2023.