Инструментальные методы определения бактериальных эндотоксинов (БЭ) в России начали активно использовать с момента утверждения ОФС 1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины» Государственной фармакопеи Российской Федерации XIII изд. (далее — ОФС 1.2.4.0006.15)1, в которой описаны фотометрические методы определения БЭ, применяемые в мире на тот момент [1]. Эти методы основаны на регистрации оптической плотности смеси реактива с испытуемым образцом при определенной длине волны на протяжении времени реакции (кинетические методы) или по окончанию инкубации реакционной смеси при 37 ºC (методы по конечной точке). Кинетические методы характеризуются более простыми условиями выполнения испытаний. Выбор в пользу кинетических методов основывается на следующих факторах: количественное определение БЭ; высокая чувствительность; возможность автоматизации эксперимента за счет использования соответствующего оборудования; минимизация ошибок, связанных с субъективной оценкой результатов оператором; возможность архивирования и хранения данных; возможность одновременного анализа нескольких образцов. Высокая чувствительность и специфичность инструментальных методов позволяет оценивать растворы лекарственных препаратов, устраняя влияние мешающих факторов за счет увеличения разведения [2].

Концентрация БЭ может определяться кинетическими методами путем сравнения продолжительности протекания реакции реактива с растворами лекарственного препарата и контрольным стандартом эндотоксина (КСЭ) по стандартной кривой зависимости содержания БЭ от времени реакции, построенной в соответствующем диапазоне концентраций растворов КСЭ [3]. Требования к критериям стандартной кривой регламентированы ОФС 1.2.4.0006.15: значение коэффициента корреляции |r|≥0,98.

Вторым фармакопейным критерием испытания для положительного контроля образца является соответствие полученного результата («степень извлечения или восстановления БЭ», «открываемость эндотоксина»2, «PPC (product positive control)», «Spike Recovery (SR%)») установленному диапазону 50–200%. Положительный контроль образца готовят либо в пробирках, либо непосредственно в лунках микропланшета: к испытуемому раствору добавляют заданное количество эндотоксина, используя раствор КСЭ, и выполняют анализ параллельно с испытуемым раствором [2]. При этом важно учитывать изменение концентраций эндотоксина и образца при их смешивании. Затем с учетом трех значений (теоретическое или номинальное значение концентрации КСЭ в образце, обнаруженное количество БЭ в растворах образца и положительного контроля образца) с помощью специальной программы рассчитывается величина, которая должна укладываться в диапазон 50–200% [4]. Очевидно, что выполнение данного критерия аналогично требованиям, предъявляемым к результатам гель-тромб теста, где допускается двукратное отличие найденной величины чувствительности реактива лизата амебоцитов от заявленной. В целом, такой подход учитывает возможность инструментальной ошибки анализа, например при изменении техники дозирования, неравномерном нагреве микропланшета, момента добавления реактива, при наличии других мешающих факторов лекарственного препарата и пр.3

Общие правила выполнения методик кинетическими методами приведены в ОФС 1.2.4.0006.15. При описании схемы испытаний в фармакопейной статье намеренно исключены детали, которые могли бы препятствовать внедрению новых подходов и усложнять выполнение анализа с использованием кинетических методов. Например, статья не определяет, какую лабораторную посуду и материалы лучше использовать (стекло или пластик); точное число растворов КСЭ с разными концентрациями для построения стандартной кривой; используемый прибор; параметры измерения оптической плотности (диапазон заданных уровней оптической плотности, длина волны, временной интервал между считываниями и т.д.). Таким образом, для испытания любого индивидуального лекарственного препарата методика определения БЭ может быть модифицирована в части условий, не установленных в ОФС 1.2.4.0006.15, в том числе могут быть свободно выбраны тип кинетического метода; набор реактивов с определенной чувствительностью; прибор для измерения; программное обеспечение.

Выделяют два типа кинетических методов: турбидиметрический (метод С) и хромогенный (метод D). Процедура подготовки испытуемых растворов идентична, а принципы взаимодействия реактива с БЭ различны. При работе по методу С результаты оцениваются по степени изменения мутности реакционной смеси, по методу D — по окрашиванию реакционной смеси в желтый цвет за счет высвобождения хромофора — пара-нитроанилина4.

Для проведения анализа используется набор реактивов: лизат амебоцитов, который имеет определенный состав в зависимости от выбранного метода; КСЭ; вода для определения БЭ (вода для БЭТ) и (или) буфер для разведения реактива. Набор реактивов сопровождается сертификатом, где приводится информация о чувствительности реактива и активности КСЭ. В инструкции к каждому набору даны индивидуальные рекомендации по работе с реактивами (диапазон концентраций растворов КСЭ, условия приготовления и хранения восстановленных реактивов). Также приводятся параметры инструментальной регистрации результатов, зависящие от используемого типа прибора (микропланшетного фотоколориметра или оптического ридера для пробирок) и набора реактивов [5]. Обработка результатов анализа кинетическими методами выполняется с применением специально разработанного программного обеспечения. В программах расчета учитываются требования ведущих мировых фармакопей к фотометрическим анализам, специфика используемых реактивов.

Кинетические методы можно использовать для качественного и количественного анализа. В первом случае испытание выполняют в максимально допустимом разведении (МДР) или МДР/2. Такой подход позволяет установить, соответствует ли содержание БЭ установленному значению предельного содержания БЭ или нет. Если инструментальные методы используются для обнаружения фактического содержания БЭ, то для конкретного лекарственного препарата необходимо дополнительно привести указание о наименьшем разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы5. Условия методик, применяемые при анализе каждого препарата, уникальны; в частности, различаются используемые разведения, что требует разработки или модификации методики определения содержания БЭ в каждом индивидуальном препарате.

Цель работы — разработка методики количественного определения БЭ кинетическим хромогенным методом.

В качестве объектов экспериментальной работы были выбраны два инъекционных препарата с действующими веществами различных фармакологических групп: моноклональные антитела — «меполизумаб» (образец № 1) и антикоагулянт прямого действия — «надропарин» (образец № 2) с нормами предельного содержания БЭ «не более 20 ЕЭ/мл» и «не более 95 ЕЭ/мл» соответственно.

Испытания выполняли с помощью наборов реактивов для хромогенного кинетического метода производства компании Associates of Cape Cod, в состав которых входили: реактив лизата амебоцитов с чувствительностью 0,005 ЕЭ/мл, КСЭ, вода для БЭТ. В исследовании использовали фотоколориметр для микропланшет «BioТek EL×800» со специальным программным обеспечением «Endoscan-V». Для построения стандартной кривой готовили растворы из КСЭ с концентрациями 5,0; 0,5; 0,05; 0,005 ЕЭ/мл. Положительный контроль образца готовили с концентрацией эндотоксина 0,5 ЕЭ/мл. Для разведения образцов использовали воду для БЭТ.

Испытывали растворы образцов лекарственных препаратов с разной кратностью разведения, но не превышающей значения МДР (для образца № 1 МДР = 1:4000; для образца № 2 МДР = 1:19000). В процессе исследований фиксировали содержание БЭ в образцах в виде точного числового значения или в виде приблизительного (со знаком сравнения «<»). Результаты считали достоверными при соблюдении следующих условий6:

1) коэффициент корреляции стандартной калибровочной кривой составляет 0,988–0,999 (при норме ≥ 0,980);

2) концентрация эндотоксина в положительном контроле образца составляет 50–200% от номинальной величины7;

3) результат, полученный для воды БЭТ (отрицательный контроль), не превышает значения наименьшей концентрации эндотоксина на калибровочной стандартной кривой.

В исследовании использовали хромогенный кинетический метод как наиболее высокочувствительный с пределом обнаружения до 0,005 ЕЭ/мл. Кроме того, в испытаниях препарата с действующим веществом надропарин использование данного метода предпочтительнее — данный препарат обладает прямым антикоагулянтным действием, нарушающим механизм свертывания реакционной смеси, на котором основан турбидиметрический метод [6].

Образцы препаратов в неразведенном виде обладали ингибирующим действием в реакции взаимодействия лизата амебоцитов с эндотоксином, поэтому выполняли испытания образцов в разных разведениях и устанавливали индивидуальное наименьшее разведение, при котором отсутствуют мешающие факторы.

Согласно результатам анализов образца меполизумаба в разведениях от 1:10 до 1:40 обнаружена примесь БЭ в количестве 0,0078–0,224 ЕЭ/мл (табл. 1), тогда как в МДР (1:4000) и МДР/2 (1:2000) фиксировали значение «менее 20 ЕЭ/мл» и «менее 10 ЕЭ/мл». Соответственно, анализ образца в наибольшем разведении выполняется как качественный анализ содержания БЭ.

Первое испытание с образцом надропарина выполняли в разведении 1:4000, затем кратность разведения уменьшали в 2–4 раза. Начиная с разведения 1:1000 влияния мешающих факторов не обнаружено, так как степень извлечения БЭ в положительном контроле образца соответствует установленному диапазону 50–200% (табл. 1). При использовании данного разведения в рутинных анализах будет соблюдаться экономия растворителя (воды для БЭТ) и расходных материалов, а также время приготовления испытуемых разведений.

В результате выполненных исследований разработаны методики определения БЭ хромогенным кинетическим методом в препаратах меполизумаба и надропарина, установлены их наименьшие разведения, начиная с которых не наблюдалось ингибирующего или усиливающего действия в реакциях взаимодействия лизата амебоцитов с эндотоксином. Количественное определение содержания БЭ в препарате меполизумаба может быть выполнено в разведении 1:10. Анализ препарата в разведении более чем в 50 раз позволяет осуществить только качественную оценку наличия БЭ. Содержание БЭ в лекарственном препарате «надропарин» возможно определить начиная с разведения 1:1000.

При разработке методик количественного определения БЭ с использованием кинетических методов необходимо определять наименьшее разведение образца, в котором отсутствуют мешающие факторы, и в дальнейшем вносить эту информацию в документацию методики. Данный подход повышает точность выполнения анализа, обеспечивает экономию материальных ресурсов и времени при проведении рутинных испытаний.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Вклад авторов распределен следующим образом: О.В. Шаповалова — планирование исследования, сбор данных литературы, написание текста рукописи; Н.П. Неугодова — обоснование концепции исследования, критический пересмотр текста рукописи и утверждение окончательного варианта статьи для публикации; Г.А. Сапожникова — получение первичных данных, их анализ и систематизация.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Olga V. Shapovalova planned the study, collected literature data, and drafted the manuscript. Natalia P. Neugodova substantiated the study concept, critically revised the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication. Galina A. Sapozhnikova obtained, analysed, and systemised primary data.

1. ЛАЛ-тест. Специальный номер. Август 2002. Центр по биотехнологии, медицине и фармации. 2002.2. 2.1.6.21 Применение испытания на бактериальные эндотоксины. Фармакопея Евразийского экономического союза. Т. 1, ч. 3. 2020.3. McCullough KZ. Variability in the Bacterial Endotoxins Test.Cornelis P, Pett N, Spackman E. What is a PPC? What is inhibition and enhancement? 2024. https://www.nelsonlabs.com/what-is-a-ppc-what-is-inhibition-and-enhancement4. LAL/TAL Endotoxin Detection Test Methods. https://horseshoecrab.org/horseshoe-crabs-bacterial-endotoxin-test-methods/5. Guidance for industry. Pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. FDA; 2012.Monograph (1085) Guidelines on the endotoxins. Test 85. United States Pharmacopeia. 43rd ed. 2019.6. ОФС.1.2.4.0006.15 Бактериальные эндотоксины. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. I. М.; 2018.Исрафилов АГ, Тутнова АД. Некоторые преимущества кинетических методов контроля бактериальных эндотоксинов над гель-тромб-тестом.7. Charles River Endoscan IV Manual.