Микробная контаминация лекарственных средств (ЛС), снижающая их эффективность и безопасность применения, может возникнуть на любой стадии производственного процесса. Ключевым инструментом обнаружения и снижения потенциальных производственных рисков контаминации является микробиологический мониторинг, представляющий собой комплекс мероприятий, направленных на обеспечение контроля состояния критически важных параметров окружающей среды и систем фармацевтического предприятия (персонала, воздуха, поверхностей, систем подготовки сжатого воздуха и воды и др.). Необходимость разработки единой научно обоснованной программы микробиологического мониторинга подчеркивается в нескольких отраслевых руководствах1, однако имеющиеся в различных национальных и международных нормативных документах практические рекомендации по процедуре проведения исследований различаются. Единая стратегия обработки проб, исследуемых в рамках микробиологического мониторинга, в настоящее время отсутствует.

Наиболее значимыми источниками микробного загрязнения являются персонал, рабочие поверхности, воздух, вода [1–4]. Для каждого из них можно определить характерный видовой состав микрофлоры. Так, более 50% всех изолятов представляют собой аборигенные для человека виды грамположительных кокков (например, Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Propionibacterium spp., Kocuria spp.) [1]. Источником грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas spp., Burkholderia cepacia, Ralstonia pickettii и др., как правило, является вода [5]. Bacillus spp., Corynebacterium spp., дрожжевые грибы Saccharomyces spp., Rhodotorula rubra, а также плесневые грибы Aspergillus spp. и Penicillium spp. наиболее часто обнаруживаются в образцах воздуха и на поверхностях [4–6]. Очевидно, оптимальные условия жизнедеятельности каждого из этих микроорганизмов различаются, и учесть их при микробиологическом мониторинге довольно сложно.

Цель работы — определение оптимальных условий инкубации посевов при микробиологическом мониторинге «чистых» помещений.

При планировании эксперимента было проведено изучение отечественной и зарубежной нормативной документации, регламентирующей асептические процессы в фармацевтическом производстве2, а также процедуру микробиологического мониторинга производственных «чистых» помещений3.

В работе использовали тест-штаммы бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, депонированные в официальных коллекциях: Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus fumigatus ВКПМ F-62, Aspergillus terreus ВКПМ F-1269, Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3. Помимо этого использовали бактерии, выделенные из окружающей среды и идентифицированные с помощью анализатора бактериологического Vitek2Compact30 (Biomerieux): Staphylococcus epidermidis, Kocuria rosea, Micrococcus luteus, Bacillus spp., Sphingomonas paucimobilis.

Все работы производили в контролируемых условиях шкафа ламинарного Purifier Logic A2 (Labconco corp.).

Культуры, выращенные на скошенной агаризованной среде в течение 24 ч, смывали с помощью стерильного раствора натрия хлорида 0,9%, стандартизовали с использованием оптического стандарта мутности ВОЗ 10 ЕД и доводили до требуемой концентрации методом серийных разведений. Посев производили поверхностным чашечным агаровым методом на готовые к применению питательные среды: триптиказо-соевый агар (TSA) (Biomerieux, кат. № 41466), агар Сабуро с декстрозой и хлорамфениколом (SDCA) (Biomerieux, кат. № 42620), а также агар Ризонера (R2A), приготовленный в лаборатории из сухой питательной среды (Liofilchem S.r.l, кат. № 610129) в трехкратной повторности.

Инкубацию посевов проводили в инкубаторах BD-240 и КB-115 (Binder) в следующих условиях:

Для получения статистически значимых результатов эксперименты выполняли многократно (n≥6) в условиях внутрилабораторной прецизионности: при сравнении питательных сред TSA и R2A для каждого температурного режима было выполнено 8 определений; коэффициент прорастания микроорганизмов (Кпр,%) на триптиказо-соевом агаре при разных режимах инкубирования рассчитывали по результатам 8 определений; изучение динамики роста бактерий K. rosea выполняли в ходе 6 определений; выявление оптимальных условий культивирования плесневых грибов проводили с использованием массива данных нескольких определений, содержащих не менее 35 единичных значений для каждого режима инкубации.

Посевы просматривали ежедневно, по окончании срока инкубации выполняли подсчет колоний с помощью счетчика Scan 100 (Interscience).

Перед статистической обработкой результатов проводили оценку их нормальности с помощью теста Шапиро–Уилка (α=0,05) и на основании полученных данных выбирали инструмент для выполнения дисперсионного анализа (P=95%): односторонний ANOVA или тест Краскела–Уоллиса. При обнаружении статистически значимых различий между группами проводили попарные сравнения с использованием апостериорных критериев Тьюки–Крамера или Данна соответственно.

Коэффициент прорастания Кпр микроорганизмов рассчитывали по формуле (1).

(1)

где Ni — количество колоний, выросших при двухтемпературной схеме инкубации, N0 — количество колоний, выросших в условиях инкубации при постоянной температуре, выбранной с учетом вида микроорганизма.

Удельную скорость роста штамма (μ, ч-1) определяли по формуле (2), время удвоения концентрации микробных клеток (Td, ч) — по формуле (3). (2) (3) где Х0 и Х — начальная и конечная концентрации клеток (КОЕ/см3); t — время культивирования микроорганизмов (ч). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение нормативной документации. Представленные в нормативных документах требования, регламентирующие условия проведения микробиологического мониторинга, в том числе питательные среды, температуру и длительность инкубации посевов, существенно различаются (табл. 1).

Влияние питательной среды и температуры инкубирования на выделение бактерий. Как показывают некоторые исследования, наиболее эффективной питательной средой для выделения широкого спектра бактерий и грибов из окружающей среды фармацевтического производства является триптиказо-соевый агар (TSA) [7–9]. В отдельных работах подчеркивается возможность применения агара Ризонера (R2A) для оценки загрязнения воздуха [10][11]. Данная питательная среда была создана для стимулирования роста медленнорастущих гетеротрофных бактерий и нашла широкое применение при анализе воды [12–14].

В настоящей работе выполнено экспериментальное сравнение питательных сред TSA и R2A для выделения микроорганизмов (тест-штаммов бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, а также изолятов из окружающей среды), в ходе которого не было выявлено статистически значимых различий полученных результатов (рассчитанное значение критерия Фишера Fc=1,28 не превышало табличное Ft(0,05;52;52)=1,59). Однако объективная оценка влияния состава питательной среды невозможна без учета температурных условий инкубации.

В настоящее время в практику фармацевтических микробиологов вводится использование двухтемпературной схемы инкубации [15], несмотря на то что при низкой температуре, поддерживаемой на первом этапе инкубации, может подавляться рост грамположительных кокков4. Следует отметить, что в настоящем исследовании подавления роста бактерий не наблюдалось (табл. 2).

Проведенное сравнение показало отсутствие статистически значимых различий между выборочными средними значениями всех групп полученных результатов (рассчитанное значение критерия Фишера (Fc=0,19) меньше табличного Ft=2,44) (табл. 2). Ни температурный режим инкубации, ни используемая питательная среда не оказывали влияние на выделение (рост) изучаемых в настоящей работе бактерий. Сравнение количества бактерий, выросших на TSA при разных режимах инкубации, выявило, что коэффициент прорастания бактерий, выделенных из окружающей среды, существенно различался (на 19–37%) в зависимости от температурных условий (табл. 3). В качестве критерия приемлемости при интерпретации полученных данных (табл. 3) использовали значение «не менее 70%»5. Обнаружено, что лишь в случае бактерий K. rosea установленное требование не выполнялось.

Динамика роста бактерий K. rosea, выделенных из окружающей лабораторной среды. Микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде фармацевтического производства, находятся под воздействием различных физических, химических или биологических факторов. Влияние стрессовых условий приводит к запуску адаптационных механизмов и вызывает краткосрочные или долгосрочные изменения физиологии микробных клеток [16–19]. Одним из примеров служит более продолжительная лаг-фаза у выделенных микроорганизмов по сравнению с музейными штаммами [20]. Как следствие, для роста производственных изолятов требуется немного более длительный период культивирования (на 2–4 сут) [20].

Температура является важным фактором регулирования роста микроорганизмов, поскольку она напрямую влияет на различные клеточные компоненты и метаболические процессы. Некоторые внутриклеточные биомолекулы, такие как ДНК, РНК, липиды и белки, могут служить бактериям в качестве термосенсоров, позволяющих детектировать изменение температуры окружающей среды [23–25]. Патогенные микроорганизмы (например, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp. и др.) используют такие механизмы восприятия температуры для запуска экспрессии генов вирулентности, контроля подвижности и развития биопленок [24–26]. Среди механизмов адаптации выделяют индукцию белков теплового (холодового) шока, которая, в свою очередь, приводит к модификациям клеточной мембраны, изменению ферментативной активности и транспорта питательных веществ, а также к снижению скорости роста [8][17–20].

В настоящей работе был использован выделенный из окружающей лабораторной среды штамм K. rosea, характеризующийся замедленным ростом.

Микроорганизмы K. rosea способны расти при 10–45 ºC, оптимальным температурным диапазоном является 20–30 ºC [21][22]. В этих условиях наблюдается максимальная удельная скорость роста, а также выработка молекулярных факторов устойчивости к неблагоприятным условиям окружающей среды [22]. Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что наиболее подходящими условиями культивирования микроорганизмов с угнетенными физиологическими функциями и замедленным ростом, к которым можно отнести изучаемый изолят K. rosea, является инкубация на питательной среде TSA при одной температуре 30–35 ºC не менее 5 сут, что подтверждается динамикой роста (табл. 4, рис. 1).

Определение оптимальных условий роста плесневых грибов. Одним из показателей качества воздуха производственной (лабораторной) среды является содержание плесневых грибов в пробах микробиологического мониторинга [27–29]. Для выделения грибов, как правило, используют рекомендованные рядом нормативных документов специальные микологические среды, такие как агар с экстрактом солода и агар Сабуро (с добавлением антибиотиков или без них) (табл. 1). Для большинства грибов-изолятов окружающей среды «чистых» помещений (например, Alternaria spp., Cladosporium spp., Trichophyton spp., Penicillium spp.), а также некоторых комменсалов кожи человека (Malassezia spp.) температурный оптимум роста (Topt) находится в диапазоне 20–25 ºС [15]. Другие виды, например Aspergillus spp., демонстрируют лучшие показатели роста при 30 ºС и выше [29].

По данным I. Symonds et al. [7] оптимальной температурой роста мезофильных неспорообразующих бактерий является 30–35 ºC, тогда как наилучшее восстановление дрожжевых и плесневых грибов и спорообразующих бактерий происходит при 20–25 ºC. Использование двухтемпературной инкубации (при 20–25 ºC в течение 3 сут с последующей инкубацией при 30–35 ºC в течение 2 сут) приводило к снижению количества выделяемых бактерий и грибов. Эти результаты согласуются с данными, полученными О. Gordon et al. [9], которые показали, что восстановление микроорганизмов при однотемпературных режимах инкубации происходит гораздо лучше, чем при двухтемпературной инкубации с первоначальной температурой 20–25 ºС. Помимо этого, авторами было продемонстрировано, что восстановление грибов и дрожжей происходит более эффективно при температуре 20–25 ºC.

Экспериментальное сравнение различных условий инкубации (табл. 5) выявило статистически значимое различие результатов количественного определения плесневых грибов: рассчитанное значение критерия Краскела–Уоллиса Hc=14,24 превышает его табличное значение Ht=9,49; p=0,007. Апостериорное попарное сравнение, выполненное с помощью критерия Данна (скорректированное с помощью поправки Бонферрони значение α=0,005), показало, что средние ранги существенно отличаются в группах 1 и 3, а также в группах 3 и 5. Это свидетельствует о том, что инкубация в условиях однотемпературного режима при температуре 33 ºC на питательной среде TSA не позволяет объективно оценить количественное содержание плесневых грибов. При этом наибольшее медианное количество колоний наблюдалось при использовании агара Сабуро.

Вклад авторов. Авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Н.Г. Сахно — подбор и анализ материалов литературы, выполнение эксперимента, написание текста рукописи; О.С. Тынчерова — выполнение эксперимента; О.В. Гунар — идея исследования, редактирование и критический пересмотр текста рукописи.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Nadezhda G. Sakhno selected and analysed literature, performed the experiments, and drafted the manuscript. Olga S. Tyncherova performed the experiments. Olga V. Gunar conceived the idea of research, edited the manuscript, and critically reviewed it.

1. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 77 «Об утверждении Правил надлежащей производственной практики Евразийского экономического союза».Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 № 916 «Об утверждении Правил надлежащей производственной практики».Рекомендация Коллегии Евразийской экономической комиссии от 01.03.2021 № 6 «О Руководстве по асептическим процессам в фармацевтическом производстве».МУК 4.2.734-99. 4. Методы контроля. Микробиологический мониторинг производственной среды. Методические указания. 2. Рекомендация Коллегии Евразийской экономической комиссии от 01.03.2021 № 6 «О Руководстве по асептическим процессам в фармацевтическом производстве» 3. МУК 4.2.734-99. 4. Методы контроля. Микробиологический мониторинг производственной среды. Методические указания. 4. USP <1116> Microbiological control and monitoring of aseptic processing environments. 5. ОФС.1.1.0021.18 Валидация микробиологических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. М.; 2018.