Онкологические заболевания характеризуются сложностью патогенеза и на разных стадиях своего развития демонстрируют ряд специфических признаков, таких как неконтролируемая пролиферация, подавление клеточной гибели, стимуляция ангиогенеза, активация инвазии и метастазирования. Поиск подходов для лечения онкологических заболеваний является одним из актуальных направлений медицины. При этом среди вновь разрабатываемых лекарственных средств всего около 5% из общего числа препаратов-кандидатов демонстрируют свою эффективность в клинических условиях [1][2]. Основной риск низкой транслируемости противоопухолевых эффектов лекарственных препаратов в клиническую практику базируется на сложности воспроизведения злокачественного новообразования в эксперименте [3]. Исследования in vitro не позволяют в полной мере воспроизвести весь комплекс патогенетических звеньев, характерных для опухолевого процесса в организме [4]. Модели in vitro пригодны на этапе скрининга, а также для подтверждения эффективности препарата в рамках пилотных экспериментов «proof-of-concept» (т.е. проверки концепции применимости). Ключевую роль в успехе трансляции противоопухолевых инноваций в клиническую практику играет выбор релевантной модели опухолевого процесса на животных [5][6].

Представленные в литературе методологические подходы к моделированию опухолевых процессов в эксперименте, а также методы исследования и оценки эффективности противоопухолевых лекарственных препаратов с различными механизмами действия требуют анализа их применимости и информативности.

Цель работы — анализ и систематизация методов, используемых в доклинических исследованиях эффективности противоопухолевых средств в условиях in vivo для формирования методической поддержки при планировании экспериментальной работы с моделированием опухолевого процесса.

В обзор включены публикации с открытым доступом в базах данных PubMed и Google Scholar на 10 октября 2024 г. В приоритете были научные статьи, опубликованные за последние 5–10 лет. Ключевыми словами для поиска являлись: ксенографтные модели; PDX (patient-derived xenograft — ксенотрансплантат, полученный от пациента); in vivo визуализация; противоопухолевая активность; модели рака на животных; доклинические исследования.

Крупнейшие на сегодняшний день клеточные банки содержат более 1800 линий клеток человека и более 1500 клеток линий животных [7][8]. Такое разнообразие клеточных линий позволяет подобрать наиболее валидную клеточную модель исходя из поставленных задач в рамках запланированных исследований. Основной критерий для создания релевантной модели in vivo: клеточная линия должна отражать основные генотипические и фенотипические характеристики опухоли, в отношении которой направлена разрабатываемая терапия. Существуют панели опухолевых линий, категоризированных не только по нозологиям, но и по генетическим особенностям, таким как мутация, на которую направлена разрабатываемая терапия, или экспрессия опухолевых неоантигенов [9–11].

Методы визуализации антителами позволяют идентифицировать поверхностные и (или) внутриклеточные онкомаркеры (иммуногистохимически [12] или при использовании проточной цитофлуометрии [13]), а затем подтверждать наличие мутаций с помощью секвенирования целевой последовательности. Для проверки соответствия клеточных линий предполагаемому генотипу существует возможность проведения STR-типирования (short tandem repeats — короткие тандемные повторы).

Высокая вероятность развития опухолевого процесса у животных характерна не для всех клеточных линий. В связи с этим на этапе планирования экспериментов целесообразно проводить анализ конкретных опухолевых линий на туморогенность, используя при этом данные научной литературы. Полученные результаты позволят повысить успешность трансфера при переходе к исследованиям in vivo.

Для повышения успешности моделирования опухолевого процесса у животных с помощью введения в их организм опухолевых клеток рекомендуется провести ряд следующих тестов: тесты на жизнеспособность и пролиферацию клеток, анализы миграции и инвазии, детекцию апоптоза и других типов клеточной смерти, окраску сенесцентных клеток, определение энергетического метаболизма и его изменений, оценку ангиогенеза, окислительного стресса, анализы экспрессии генов и белков ключевых сигнальных путей [14–16].

Большинство доступных к использованию тестов основаны на определении активности клеточных ферментов, скорости синтеза и количественного содержания ДНК, уровня клеточного АТФ и целостности мембран, которые являются индикаторами жизнеспособности клеток [17][18]. Окраска витальными красителями (трипановый синий) позволяет выявить клетки с нарушением целостности мембраны. Для оценки пролиферативного потенциала проводят исследование включения 3[Н]тимидина с последующей оценкой суммарной включенной радиоактивности, однако метод ограничен в использовании из-за требований по радиационной безопасности [19].

Для определения жизнеспособности клеток широко используют фермент-субстратные методы c последующим колориметрическим или флуориметрическим анализом. К их числу можно отнести измерения внеклеточного уровня цитозольного фермента лактатдегидрогеназы (LDH-тест). Также применяют тесты, основанные на превращении субстрата жизнеспособными клетками в окрашенный или флуоресцентный продукт, содержание которого прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Принцип действия этих тестов основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток восстанавливать соли тетразолия до водонерастворимых кристаллов пурпурного формазана, которые после растворения в органических растворителях определяют колориметрическим способом [20]. Для этой цели могут быть использованы различные соли тетразолия: 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ), 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий (MTS), 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид (ХТТ), 2-(2-метокси-4-нитропентил)-3-(4-нитропентил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолий (WST-8). Кроме того, используют проникающие сквозь клеточную мембрану ДНК-красители, имеющие флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами для специфического окрашивания ядер: 7-аминоактиномицин D (7-AAD), пропидий йодид, DRAQ7™ и др. [21][22].

Ключевую роль в количественной оценке жизнеспособности индивидуальных клеток играет метод проточной цитофлуориметрии. Фенотипирование опухолевых клеток имеет особое значение для исследования противоопухолевой активности исследуемых препаратов в отношении пула опухолевых и лейкемических стволовых клеток [23]. Кроме того, существует подход, основанный на анализе способности одной клетки вырасти в колонию (клоногенный анализ или анализ образования колоний)1 [24]. Для непрерывного мониторинга пролиферации клеток используют платформы, требующие специализированного оборудования: IncuCyte, Cell-IQ, Evos XL Core, ZEISS Celldiscoverer 7, Cytation 5, xCELLigence RTCA, которые позволяют в режиме реального времени визуализировать и регистрировать клеточные изменения. Для тестирования миграции опухолей и инвазии наиболее распространенным методом является Скретч-тест (scratch assay), направленный на оценку скорости зарастания дефекта монослоя клеток. Принцип данного метода заключается в создании стандартизованного повреждения монослоя, которое инициирует миграцию опухолевых клеток, находящихся на краю данного повреждения, в свободную сторону [25]. Более информативными методами для этих целей являются: анализ миграции клеток с помощью камеры Бойдена, миграции клеток в капиллярной камере, анализ зоны исключения клеток, миграции сфероидов и мониторинг миграции клеток в реальном времени, в том числе с помощью оборудования xCELLigence.

При большом количестве исследований в области экспериментального моделирования опухолевых заболеваний in vivo идеальной (универсальной) модели все еще не существует. Поэтому при выборе моделей необходимо оценить их особенности, достоинства и недостатки, степень пригодности для решения поставленных задач. При моделировании опухолевого процесса на животных должно быть соблюдено ключевое условие — сходство механизмов заболевания в модели и у человека на различных уровнях (в зависимости от поставленных задач — тканевой, молекулярный) [26–29].

Для моделирования злокачественных опухолей и последующей оценки эффективности исследуемых препаратов с противоопухолевым эффектом могут быть использованы животные различных видов, включая Danio rerio (зебрафиш) [30][31], генетически модифицированных свиней [32–35] и нечеловекообразных приматов [36–39]. Эти модели имеют значительный потенциал в области онкологических исследований, однако классическим объектом для моделирования рака являются лабораторные мыши [40–42]. Основные разновидности опухолевых моделей на мышах представлены на рисунке 1.

С точки зрения прогностической фармакологии основными задачами при разработке и в доклинических исследованиях противоопухолевых препаратов являются [43]:

Использование одной модели не позволяет отразить патогенез опухолевого процесса с учетом генетики, эпигенетики, иммунологии, гистопатологии и гетерогенности. В ходе одного исследования, связанного с разработкой и тестированием противоопухолевых препаратов, возможно использование нескольких моделей in vitro и in vivo [44][45]. Также в некоторых случаях динамику опухолевого роста in vivo целесообразно оценивать с использованием гетеротопических моделей, а оценку продолжительности жизни — с помощью ортотопических.

Опухоли, индуцированные у лабораторных животных с помощью химического или физического воздействия, как и при спонтанном опухолевом процессе, развиваются непосредственно из клеток хозяина. Следовательно, преимуществом этих моделей в сравнении с моделями перевиваемых опухолей является бóльшая приближенность патогенеза к действительному клиническому сценарию [46]. Однако существует видовая чувствительность к химическим веществам-канцерогенам, связанная с особенностями их метаболизма у различных животных в органах-мишенях [47–49]. Поэтому наиболее часто применяют модели перевиваемых опухолей и используют для этого линии раковых клеток, тканевые или клеточные материалы, полученные от человека или лабораторных животных.

В зависимости от метода трансплантации такие модели могут быть разделены на гетеротопические и ортотопические. В качестве примера гетеротопической трансплантации можно привести подкожное или внутрибрюшинное введение опухолевых клеток молочной железы. В этом случае опухоль будет развиваться в области участка введения с образованием твердых (солидных) опухолевых узлов под кожей или асцитных изменений в брюшной полости соответственно. Процедура инокуляции в этом случае проста в техническом исполнении, что удобно для проведения скрининговых исследований противоопухолевых препаратов.

Ортотопическая трансплантация предполагает инокуляцию опухоли непосредственно в орган-мишень путем инъекции или, нередко, хирургических манипуляций. Например, модель рака мочевого пузыря у мышей была создана с использованием ортотопической трансплантации клеток карциномы мочевого пузыря человека UM-UC-3 [50]. Было показано, что хирургическая трансплантация усиливает метастатическую активность опухоли [51]. Такой подход позволяет приблизить процесс моделирования к естественному развитию опухоли с учетом формирования стромы, микроокружения, ангиогенеза и ответа на терапию.

В зависимости от происхождения трансплантируемого опухолевого материала модели на животных разделяют на сингенные и ксенографтные. Сингенные модели предполагают использование опухолевого материала, полученного от животных того же вида, на котором производится моделирование. Также необходимо сродство генетического фона для того, чтобы обеспечить максимальный уровень приживления трансплантата и снизить вероятность не связанного с онкологией иммунного ответа. Опухоли в этом случае, как правило, изначально спонтанные или химически индуцированные, поддерживаются и банкируются в виде клеточных линий и могут быть сравнительно легко привиты животным в исследовании. Однако в таких моделях отсутствует возможность изучить отдельные патогенетические механизмы, видоспецифичные для человека.

Ксенографтные модели являются наиболее часто используемыми в доклинических испытаниях. В данном случае для трансплантации используется опухолевый материал или клеточные линии, полученные от человека, что приближает такие модели к фактическим клиническим сценариям.

Следует учитывать, что в зависимости от участка трансплантации поведение опухоли может меняться: во время введения опухолевые клетки подвергаются кинетическим изменениям, часто при пассажах снижается скорость удвоения, однако ксенотрансплантированные опухоли человека сохраняют множество оригинальных морфологических и биохимических характеристик. Поэтому именно ксенографтные модели на текущий момент являются наиболее востребованными [52].

Поскольку трансплантат имеет видовую специфику, для исключения реакции «трансплантат против хозяина» животные для моделирования должны обладать определенной степенью иммунодефицита, который может быть достигнут путем медикаментозной иммуносупрессии или хирургически (удаление тимуса). Однако такие подходы трудоемки и не в полной мере поддаются валидации, в отличие от использования генетически модифицированных иммунодефицитных животных. Наиболее часто используют атимических мышей (например, линия Balb/c-Nude) и мышей с комбинированным иммунодефицитом (severe combined immunodeficiency, SCID). На фоне отсутствия определенных компонентов иммунной системы такие животные не демонстрируют отторжения трансплантируемого материала.

Использование мышей линии NSG (NOD/SCID/Gamma) позволило вывести биомоделирование на новый уровень. Тяжелый комбинированный иммунодефицит животных этой линии определяет возможность выполнения трансплантации различных типов человеческих клеток и тканей. В случае модификации этой линии и ее аналогов (NOG hIL2, NSG-SGM) может быть учтена специфика гемопоэза и иммунитета человека, реализована экспрессия человеческих цитокинов, что позволяет в еще большей степени воссоздать вероятные иммунные ответы на терапию, например в случае применения биологически модифицированных клеточных продуктов, таких как CAR-T (chimeric antigen receptor T-cells — Т-клетки с химерным антигенным рецептором) [53].

Особый интерес для исследований представляют гуманизированные животные [54]. Взаимосвязь состояния иммунной системы организма с вероятностью канцерогенеза и с ответом на противоопухолевую терапию [55] использована в исследованиях по иммунотерапии рака [56][57]. Гуманизированные мыши — модельный объект, особенностью которого является наличие человеческих генов, клеток или тканей, что позволяет в большей степени отобразить специфику патофизиологических процессов, характерных для человека [58].

Гуманизированные мыши с функционирующими звеньями иммунной системы человека используются для исследования роли иммунных механизмов в патогенезе рака у человека [59–61]. Для получения таких животных применяется трансплантация человеческих гематопоэтических клеток, для приживления которых необходимо предварительное подавление гематопоэза, которое достигается путем облучения иммунодефицитных мышей (irNSG, irradiated NOD/SCID/Gamma) или же путем генетической модификации (линия NBSGW) [62].

Области применения, ограничения и преимущества моделей трансплантируемых опухолей у мышей представлены в таблице 1.

Изменение размера опухоли является наиболее важным показателем при проведении исследований эффективности противоопухолевых препаратов. В зависимости от участка расположения опухоли для измерения ее размера могут быть использованы штангенциркуль (солидные опухоли, инокулированные подкожно) или специальные методы визуализации: компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, 3D-система оптической визуализации in vivo (in vivo imaging system, IVIS). IVIS особенно важна для оценки динамики роста гематологических опухолей (так называемых «жидких» опухолей) и ортотопически инокулированных опухолей. В ходе исследования производят мониторинг увеличения или уменьшения размера опухоли индивидуально по каждому животному и затем групповой анализ.

Для работы с животными и получения ксенографтных моделей клеточные линии часто модифицируют для визуализации. Наиболее распространенная модификация для биолюминесцентной детекции осуществляется благодаря стабильной повышенной экспрессии люциферазы. Обычно используют два типа люцифераз: целентеразин расщепляющие или люциферин расщепляющие, иногда одновременно оба типа. Овер-экспрессия люцифераз в клеточных линиях достигается доставкой соответствующего гена под конститутивным промотором, что позволяет осуществить стабильную экспрессию. Наиболее используемым методом доставки генов люцифераз является лентивирусная трансдукция [67]. Лентивирус, несущий целевой ген, производится в иммортализованных клетках почки эмбриона человека HEK293T методом транзиентной трансфекции трех и более плазмидных векторов, кодирующих оболочку лентивируса, систему упаковки и ген люциферазы. Лентивирусные частицы спустя 2–3 суток после трансфекции собирают в культуральную среду и концентрируют в ней для последующего заражения необходимой клеточной линии. Данные генно-инженерные модификации не влияют на свойства и чувствительность опухолевых клеток, но позволяют им расщеплять субстрат, вводимый животному, с выделением света, что детектируется оборудованием для визуализации.

Применение оптической биолюминесцентной визуализации позволяет проводить широкий спектр биологических исследований in vivo на мелких лабораторных животных. Поскольку большинство клеток организма не обладают собственной люминесценцией, использование данного типа визуализации позволяет достичь высокого отношения сигнал/шум и избежать фоновой автофлуоресценции ткани. Использование меток с излучением в диапазоне от красного до инфракрасного (>600 нм) является наиболее предпочтительным из-за низкого поглощения в тканях при этих длинах волн. Результаты моделирования распространения фотонов через ткани показывают, что количество биолюминесцентных клеток на уровне нескольких сотен может быть обнаружено подкожно, в то время как для обнаружения сигналов на глубине ~2 см в ткани требуется ~10⁶ клеток [68].

Кроме подхода, основанного на люминесценции, в последнее время широко используют флуоресцентную детекцию, основанную на трансдукции клеточных линий лентивирусами, кодирующими флуоресцентные белки дальне-красного и ближнего инфракрасного спектра [69][70]. Данный подход не требует наличия субстрата, а оптическая визуализация в ближней инфракрасной области спектра позволяет повысить чувствительность детекции и избежать автофлуоресценции, возникающей из-за эндогенных флуоресцентных молекул в биологических тканях [71].

Для достижения уровня модификации клеток, близкого к 100% в популяции, как при работе с люциферазами, так и с флуоресцентными белками, используют бицистронные системы генной экспрессии, и часто вторым овер-экспрессируемым геном является ген устойчивости к селективным антибиотикам: пуромицину, зеоцину, генетицину, бластицидину, гигромицину. В связи с этим модифицированные линии проходят этап селекции от 1 до 3 недель. После проведенной селекции наличие данных антибиотиков в культуральной среде не обязательно.

Подходы с применением систем визуализации позволяют производить оценку эффективности противоопухолевых препаратов на моделях как солидных, так и гематологических опухолей, при этом существует возможность отслеживать динамику опухолевого процесса на одном животном.

Другой значимый показатель в исследованиях эффективности лекарственных препаратов с противоопухолевым действием — продолжительность жизни животного с опухолевым процессом. Учитывают гуманные конечные точки: животные должны быть выведены из исследования в случае устойчивой тенденции к потере массы тела, проявления признаков боли и дистресса. Отдельно оценивают физическое состояние животного (body condition score, BCS), так как при развитии опухолевого процесса масса тела животного может выходить на плато, а в некоторых случаях даже расти только за счет увеличения массы опухоли при том, что животное может быть истощено [72]. Кроме того, показателями для выведения животного из эксперимента являются: нарушение целостности опухолевого узла, превышения им размеров 1,5–2 см в диаметре или 2000 мм³ в объеме, нарушение основных физиологических функций на фоне онкологического процесса (невозможность передвигаться, принимать пищу) [73][74].

Кроме данных о динамике роста опухоли и продолжительности жизни лабораторных животных, могут быть использованы и другие показатели эффективности терапии в зависимости от типа опухоли и метода лечения. Так, возможна оценка уровня подавления метастатической активности опухоли в условиях противоопухолевого лечения с оценкой количества и размера метастаз. В том случае, если терапия направлена на усиление противоопухолевого иммунитета, необходимы исследования, направленные на выявление рецидивов опухолевого процесса.

Успешная трансляция результатов доклинических исследований эффективности противоопухолевых препаратов в клинику в значительной степени зависит от правильности выбора экспериментальной модели (релевантного вида животного, соответствия генетического статуса животного и человека, сходства патогенеза заболеваний и способа терапии).

В работе систематизированы представленные в литературе экспериментальные подходы для моделирования опухолевых процессов у лабораторных животных и способы оценки эффективности противоопухолевых препаратов. Проведен сравнительный анализ используемых в доклинических исследованиях моделей опухолевого процесса у мышей. Определены преимущества и ограничения каждой из них, позволяющие сделать выбор релевантной модели для конкретных задач исследования.

Ввиду высокой востребованности исследований в области онкологии и стремительно растущей информационной и методологической базы количество подходов и инструментов для доклинических исследований противоопухолевых препаратов непрерывно растет. Появляются новые методы флуоресцентного или люминесцентного мечения опухолевых линий для их визуализации in vivo, новые возможности тестирования клеточного материала перед in vivo этапом. Такое обилие инструментов позволяет максимально комплексно подойти к дизайну исследования и его реализации, что позволяет учесть больше специфических факторов и облегчает преодоление трансляционных барьеров между разными этапами исследований. Использование информации, представленной в настоящей работе, позволит обеспечить достоверность получаемых экспериментальных данных об эффективности противоопухолевых лекарственных средств, а также повысить успех трансляции результатов исследований в клиническую практику.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: М.Л. Васютина, Я.Г. Торопова, К.В. Лепик, А.В. Петухов — концепция работы, написание текста рукописи, формулирование выводов; М.С. Истомина, К.А. Левчук, Е.В. Щелина, А.Е. Ершова — сбор и анализ источников литературы; О.Н. Демидов — участие в формулировании выводов, критический пересмотр текста и утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Marina L. Vasyutina, Yana G. Toropova, Kirill V. Lepik, and Alexey V. Petukhov conceptualised the study, drafted the manuscript, and formulated the conclusions. Maria S. Istomina, Ksenia A. Levchuk, Ekaterina V. Shchelina, and Alina E. Ershova collected and analysed literature. Oleg N. Demidov participated in the formulation of the conclusions, critically revised the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication.

1. Croft J. Colony formation assay counting: Advancing the frontiers of cancer research. Presentation. 2018. https://www.researchgate.net/publication/328048722_Colony_formation_assay_counting_Advancing_the_frontiers_of_cancer_research