Быстрый прогресс, связанный с изучением биологии стволовых клеток, привел в последние годы к разработке новых методов лечения ряда нейродегенеративных заболеваний [1]. Использование стволовых клеток предполагает особенно привлекательную альтернативу терапии небольшими молекулами с одной мишенью, обеспечивая многогранный эффект лечения. Помимо прямой замены ткани, стволовые клетки могут образовывать синапсы, регулировать воспаление и обеспечивать устойчивое обогащение микроокружения посредством секреции паракринных факторов [2][3]. В настоящее время инъекционные препараты стволовых клеток центральной нервной системы проходят клинические испытания с целью лечения инсульта и болезни Паркинсона [4][5]. Доклинические исследования по трансплантации стволовых клеток в модели болезни Альцгеймера у мышей показали краткосрочный положительный эффект, который часто связан с доставкой нейротрофических факторов [6][7]. Этот эффект подтвержден результатами ряда текущих клинических исследований препаратов различных типов мезенхимальных стволовых клеток (МСК) при их внутривенном и внутрижелудочковом введении [8] пациентам с болезнью Альцгеймера.

К наиболее перспективным примерам экспериментальных исследований в области ксеногенной клеточной трансплантации можно отнести трансплантацию инсулин-продуцирующих клеток человека при моделировании диабета у мышей низкими дозами стрептозотоцина [9], нейральных стволовых клеток (НСК) человека при моделировании болезней Паркинсона [10], Хантингтона [11] и эпилепсии [12]. При этом во всех приведенных работах показана эффективность ксеногенной клеточной трансплантации. Таким образом, использование ксеногенного клеточного продукта — глиальных клеток-предшественников (ГКП), полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека, может представлять собой новый терапевтический подход к лечению целого ряда неврологических заболеваний.

При всех преимуществах клеточной терапии, включающих возможность лечения ряда неврологических заболеваний, необходимо также учитывать риски, связанные с безопасностью этого подхода [13][14]. Так, неконтролируемое размножение трансплантированных клеток может приводить к образованию опухолей [15][16]. Этот риск особенно высок при использовании стволовых/прогениторных клеток, которые способны к бесконтрольному делению.

Ограничения к применению клеточной терапии могут быть связаны с вероятностью иммунного отторжения используемого препарата. При трансплантации ксеногенных клеток запускается иммунный ответ с активацией Т-лимфоцитов и продукцией антител, что приводит к элиминации трансплантата [17]. Использование клеток или клеточных продуктов в высоких концентрациях может вызывать воспалительные реакции, связанные как с непосредственным воздействием клеток на организм, так и с ответом на секретируемые этими клетками вещества.

Одним из потенциальных осложнений при клеточной терапии является эмболия [18] в результате внутриартериальной/внутривенной инъекции, что вызывает серьезные осложнения после лечения, в том числе инфаркт или инсульт [19]. Минимизировать риски, ассоциированные с эмболией сосудов, можно путем правильного подбора концентрации трансплантата.

Предположительно действие ГКП основано на секреции паракринных факторов, способных влиять на функциональное состояние головного мозга животных. Также сделано предположение, что при определенной концентрации исследуемый биомедицинский клеточный продукт будет безопасен при ретроорбитальном введении, но при этом будет оказывать модулирующие эффекты на клетки-мишени головного мозга.

Ретроорбитальное введение является более безопасным и эффективным, чем введение в хвостовую вену у мышей, особенно при многократном введении [20]. Поскольку основной эксперимент должен быть продолжительным, было выбрано именно ретроорбитальное введение.

Использование ГКП является одной из стратегий в клеточной терапии различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных [21]. Однако из-за специфики получения ГКП и отсутствия экспериментальных данных необходимо подбирать безопасные концентрации клеток и дозы для последующей оценки их эффективности.

Целью данной работы является выбор дозы биомедицинского клеточного продукта, полученного на основе глиальных клеток-предшественников, и оценка его безопасности при ретроорбитальном введении мышам линии C57BL/6J.

Получение глиальных клеток-предшественников. Культура ГКП была получена ранее из ИПСК человека [22]. Для репрограммирования дермальных фибробластов и получения ИПСК использовали набор CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen). Для дифференцировки в нейральном направлении ИПСК культивировали в среде DMEM/F12 (Gibco) с добавлением малых молекул SB431542 (Stemcell Technologies), 2 мкМ дорсоморфина (Stemcell Technologies), 200 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich). Полученную культуру нейральных стволовых клеток культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10 нг/мл фактора роста фибробластов (FGF-2) (ProSpec), 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (ProSpec) и 20 нг/мл цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) (PeproTech) до формирования клеток веретенообразной морфологии, соответствующей ГКП. В качестве подложки использовали матригель (Corning). Пересев культуры осуществляли каждые два-три дня, используя 0,05% раствор трипсина (Capricorn Scientific).

ГКП культивировали в среде следующего состава: DMEM/F12 («ПанЭко»), НEPES 15 мМ («ПанЭко»), 1мМ глутамин («ПанЭко»), 1% смесь незаменимых аминокислот («ПанЭко»), 100 мг/л пенициллин-стрептомицин («ПанЭко»), 1% N2 добавка («ПанЭко»), 1% фетальная бычья сыворотка (Gibco), 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл CNTF. В качестве подложки использовали матригель (Corning). Культивирование проводили в CO2-инкубаторах при постоянной температуре 37 ºC и 5% CO2. При достижении конфлюентности 85–95% клетки снимали раствором 0,05% трипсин-ЭДТА (Capricorn Scientific), центрифугировали 5 мин при 1400 об./мин, осадок разводили культуральной средой в соотношении 1:2 и переносили в новые культуральные флаконы Т175 (SPL Life Sciences). Перед введением в ретроорбитальный венозный синус мыши клеточный осадок разводили с использованием фосфатно-солевого буфера (phosphate-buffered saline, PBS) («ПанЭко») до получения растворов, содержащих в одной дозе (150 мл) 500×10³, 150×10³, 50×10³ и 15×10³ клеток.

Лабораторные животные. Мыши были предоставлены из биоресурсной коллекции Центра коллективного пользования Института физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН). В двух экспериментах было использовано 40 животных из имеющегося стока, не вошедших в размножение половозрелых самцов линии C57BL/6J в возрасте 6 мес. и массой 30–33 г. Способ введения клеток в ретроорбитальный венозный синус животных был выбран как менее травматичный, чем интракраниальная трансплантация, и допускающий многократные инъекции.

Животные были рандомизированы на основании их массы согласно стандартной операционной процедуре ИФАВ РАН таким образом, чтобы средняя масса животных в группах не отличалась более чем на 10%. При этом учитывалась возможность содержания в клетках, поскольку половозрелых самцов из разных клеток не допускается ссаживать в одну, также исключалось одиночное содержание.

Все эксперименты с животными были проведены на базе Центра доклинических испытаний ИФАВ РАН в оборудованном виварии с двухкоридорной системой и разделением потоков. Световой цикл состоял из 12 ч дня и 12 ч ночи. Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (температура 19–25 ºС, относительная влажность 30–70%). Использовали беспылевой подстил и корм торговой марки «Чара» с предварительным автоклавированием при 120 ºC, позволяющим обеспечить отсутствие видоспецифичных патогенных микроорганизмов. Животных поили фильтрованной водопроводной водой, прошедшей обработку ультрафиолетовым излучением. Работы с животными осуществляли в соответствии с ГОСТ 33215-20141 и ГОСТ 33216-20142. Каждую неделю перед введением ГКП проводили клинический осмотр и взвешивание животных.

Проведение исследований было одобрено на заседании локального биоэтического комитета ИФАВ РАН (протоколы заседаний № 80 от 28.07.2023; № 81 от 30.08.2023).

Протокол ретроорбитального введения глиальных клеток-предшественников мышам линии C57BL/6J. Для оценки безопасности введения ГКП мышам и подбора дозы для хронического эксперимента было проведено два пилотных эксперимента.

В первом эксперименте животным контрольной группы вводили ретроорбитально по 150 мкл DPBS (фосфатно-солевой буфер в среде Дульбекко) (количество животных в группе n=9), а животным экспериментальной группы (n=9) — по 150 мкл ГКП, содержащего 500×10³ клеток в одной дозе (кл./мышь). Инъекции проводили один раз в неделю в течение 2 мес. под общим изофлурановым наркозом.

Во втором эксперименте животные были разделены на четыре группы. В группе контроля (n=5) животным вводили ретроорбитально по 150 мкл DPBS, В трех экспериментальных группах (n=5 в каждой) животным вводили по 150 мкл ГКП, содержащего 150×10³, 50×10³, 15×10³ кл./мышь соответственно. Инъекции проводили один раз в неделю в течение 1 мес. под общим изофлурановым наркозом.

Протокол проведения теста «Открытое поле». В первом эксперименте после двухмесячного введения клеток был проведен тест «Открытое поле» для оценки активности животных. Животных помещали в отдельную комнату для акклиматизации за 1 ч до начала теста. Установка «Квадратное открытое поле» представляет собой усеченный куб с размером сторон 40 см, в котором выделен центральный квадрат с размером сторон 20 см. Время теста для одного животного составляло 5 мин при ярком освещении (250 лк).

Забор биологического материала у животных. По окончании эксперимента у 5 животных из каждой группы прижизненно была взята кровь из подъязычной вены в объеме 150–200 мкл. Из массива данных для статистической обработки были исключены пробы крови с гемолизом.

Головной мозг животного после эвтаназии и некропсии был последовательно зафиксирован в 10% растворе формалина (Labiko) (24 ч), 30% растворе сахарозы (АО «ЛенРеактив») (24 ч), растворе (1:1) сахарозы с Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek) (24 ч) и хранился при +4 ºС для последующего проведения иммуногистохимического исследования.

Иммуногистохимическое исследование коры головного мозга мышей. Образцы головного мозга мышей покрывали реагентом Tissue-Tek O.C.T. Compound. Подготовку сагиттальных срезов толщиной 7 мкм выполняли на криотоме Leica CM1950 (Leica Biosystems). Готовые срезы переносили на предметные стекла Superfrost Plus (Thermo Fisher Scientific) и хранили при +4 ºС. Демаскировку образцов проводили в 10-кратном цитратном буфере (Sigma-Aldrich, кат. № C9999) на водяной бане. Подготовленные образцы инкубировали в PBS с добавлением 1% раствора бычьего сывороточного альбумина («ПанЭко»), 0,05% Triton X-100 («ПанЭко») в течение 1 ч, а затем обрабатывали первичными антителами к маркеру астроцитов — глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) — 1:200 ab7260б (Abcam) и к микроглие — адаптеру 1, связывающему ионизированный кальций (IBA1) — 1:200 ab178847 (Abcam) и инкубировали ночь при +4 ºС. Затем стекла отмывали от первичных антител и инкубировали с перекрестно-адсорбированными вторичными антителами. Для окраски образцов в первом эксперименте использовали вторичные антитела в разведении 1:1000 Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 568 (А-11011, Thermo Fisher Scientific); во втором эксперименте с разными дозами ГКП использовали вторичные антитела в разведении 1:600 Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor™ 488 (A-11008, Thermo Fisher Scientific) и 1:600 Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor™ 555 (A-21422, Termo Fisher Scientific). Окраску проводили в течение 2 ч в темноте. Затем стекла повторно отмывали, срезы инкубировали с раствором DAPI (Sigma-Aldrich, кат. № D9542) в PBS (разведение 1:1000) для контрастирования ядер. Заключение срезов под покровные стекла проводили с помощью среды Aqua-Poly/Mount (Polysciences).

Изображения были получены на конфокальном микроскопе Leica TCS SP8 (Leica Microsystems), для их обработки использовали программу ImageJ. Было подсчитано общее количество иммунопозитивных клеток в случайно выбранных полях зрения в пределах среза мозга площадью 1 мм² для каждого образца.

Статистический анализ данных был проведен в программах SigmaPlot 15.0 и GraphPad Prism 7. Для проверки распределения на нормальность использовали критерий Шапиро–Уилка. В первом эксперименте в случае, когда распределение данных отличалось от нормального в тесте «Открытое поле», при оценке результатов биохимического и иммуногистохимического анализа был применен критерий Манна–Уитни, при прохождении теста на нормальность распределения использовали t-критерий Стьюдента.

Во втором эксперименте в случае отличия распределения данных биохимического анализа крови и иммуногистохимического исследования от нормального был применен ранговый дисперсионный анализ (ANOVA on ranks) с последующей обработкой тестом Данна, при нормальном распределении — однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA).

Характеристика глиальных клеток-предшественников. ГКП были получены ранее из ИПСК человека путем их поэтапной дифференцировки и имели веретенообразную морфологию (рис. 1), согласно методике, указанной в X. Wei и соавт. [23].

Тест «Открытое поле». В эксперименте с высокой дозой клеток — 500×10³ кл./мышь, проводили тест «Открытое поле» для оценки активности животных. В тесте оценивали общее пройденное животным расстояние, среднюю скорость движения, время, проведенное в периферической и центральной зонах. В течение 5 мин теста фиксировали поведенческие паттерны: вертикальные подъемы тела с опорой и без опоры, частоту аутогруминга, частоту дефекации. Между контрольной и экспериментальной группами значимых различий выявлено не было (рис. 2, 3). Введение ГКП не повлияло на активность и поведение животных.

Поскольку в первом эксперименте даже при введении ГКП в высокой дозе клеток различий в поведении животных в тесте «Открытое поле» не обнаружено, во втором эксперименте этот тест не проводили.

Оценка уровня биохимических маркеров воспаления в крови мышей. По окончании обоих экспериментов проводили биохимический анализ венозной крови животных в каждой группе (n=5) и оценивали маркеры повреждения клеток. Для анализа были выбраны следующие показатели: аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТ), общий билирубин.

При ретроорбитальном введении ГКП в дозе 500×10³ кл./мышь наблюдали статистически значимое увеличение концентрации АСТ, АСТ/АЛТ, ЛДГ и общего билирубина. Повышение уровней данных ферментов в крови свидетельствует о различных состояниях, связанных с повреждением клеток и тканей органов животных, что может указывать на их иммунные реакции при ксеногенной трансплантации, вызванные инфильтрацией клеток в печень или другие паренхиматозные органы (табл. 1).

Введение животным ГКП в более низких дозах 15×10³, 50×10³ и 150×10³ кл./мышь не приводило к повышению в крови концентрации маркеров повреждения клеток, что свидетельствует о возможном использовании ГКП в данных дозах для терапии заболеваний при введении в ретроорбитальный синус животных (табл. 2).

Иммуногистохимическое исследование коры головного мозга. Для оценки нейровоспаления у животных после введения ГКП проводили количественную оценку активированных астроцитов и микроглии в головном мозге. При введении ГКП в дозе 500×10³ кл./мышь медианное значение количества GFAP-позитивных клеток в коре головного мозга мышей (М) составило 276 кл./мм² (n=9) и было достоверно выше, чем в группе контроля (M=226 кл./мм², n=16) при сравнении групп критерием Манна–Уитни (p=0,0235). Количество GFAP-позитивных астроцитов коры головного мозга мышей после иммуногистохимического окрашивания представлено на рисунке 4, опубликованном на сайте журнала3.

Во втором эксперименте при оценке нейровоспаления у животных после введения ГКП в низких дозах было отмечено, что среднее число GFAP-позитивных клеток в коре головного мозга мышей, получавших ГКП в дозе 150×10³ кл./мышь, было достоверно выше, чем в группе контроля, при уровне значимости (р) равном 0,046 (рис. 5). У животных, получавших ГКП в дозе 15×10³ и 50×10³ кл./мышь, не наблюдали статистически значимых различий с группой контроля. Количество GFAP-позитивных астроцитов коры головного мозга мышей после иммуногистохимического окрашивания представлено на рисунке 6, опубликованном на сайте журнала4.

Количество IBA1-позитивных клеток в коре головного мозга мышей в группе животных, получавших ГКП в дозах 150×10³ и 50×10³ кл./мышь, было в среднем выше, чем у животных, которым вводили препарат в дозе 15×10³ кл./мышь, однако различий с группой контроля (введение DPBS) не отмечено (рис. 7). Количество IBA1-позитивной микроглии коры головного мозга мышей после иммуногистохимического окрашивания представлено на рисунке 8, опубликованном на сайте журнала5.

Наиболее изученными клеточными трансплантатами для терапии различных неврологических заболеваний являются препараты на основе МСК и НСК человека [22][24]. Показано, что МСК обладают иммуносупрессорными свойствами и как при ксеногенной, так и аллогенной трансплантации не вызывают значимых иммунологических реакций. Однако их длительное введение в организм все еще недостаточно изучено [25]. Внутривенное введение аллогенных МСК (10×10⁶ кл./кг) крысам не приводило к значимым изменениям биохимических показателей через 2 недели после введения, однако вызывало воспаление легких [26]. В другом исследовании изучали безопасность двукратного внутривенного введения МСК, полученных из пуповины человека, крысам в дозах с различным количеством клеток (от 3,0×10⁵ до 1,5×10⁷ кл./кг, что примерно соответствует 9×10³–4×10⁶ кл./мышь), при этом не было показано ни острой, ни долгосрочной токсичности клеток [27]. Длительное (11 мес.) введение НСК человека крысам не приводило к снижению жизнеспособности животных или к видимым негативным последствиям, однако детальное изучение безопасности авторы не проводили [28]. Кроме того, было показано, что интраназальное введение аллогенных НСК детям с церебральным параличом в течение 3 мес. не вызывало значительных побочных эффектов такой терапии и в целом оказалось безопасным для пациентов [29].

Данные по изучению влияния долгосрочного введения ГКП при аллогенной или ксеногенной трансплантации в литературе отсутствуют. Однако известны примеры исследований, направленных на изучение терапевтических свойств ГКП при различных неврологических заболеваниях и свидетельствующих об отсутствии значимых побочных эффектов по крайней мере при однократном применении глиальных клеток [30].

В нашем исследовании введение сниженных доз (50×10³ и 15×10³ кл./мышь) ксеногенных клеток не влияло на изменение биохимических показателей крови животных в отличие от более высоких доз. Влияния ГКП на поведение животных выявлено не было, однако такое влияние вполне может быть незаметно при малой использованной выборке. При этом было обнаружено, что введение ГКП в дозе 150×10³ кл./мышь оказывало влияние на активацию глии головного мозга животных, что может быть связано с особенностями метаболизма введенных клеток.

Проведено исследование по выбору дозы биомедицинского клеточного продукта на основе глиальных клеток-предшественников (ГКП), полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, при многократном внутривенном введении в ретроорбитальный венозный синус мышей. Полученные результаты могут быть использованы при инъекциях стволовых/прогениторных клеток для минимизации осложнений у животных в доклинических исследованиях и создания основы для безопасного применения клеточной терапии в клинической практике.

Изучен профиль безопасности длительного (30 и 60 сут) ретроорбитального введения ГКП как потенциального препарата для терапии неврологических заболеваний. Показано, что продолжительное многократное введение клеток в синус мышей в концентрации 500×10³ кл./мышь приводило к повышению уровня ферментов АЛТ, АСТ, ЛДГ и общего билирубина в крови животных, что может быть связано с развитием воспалительной реакции из-за накопления человеческих клеток в таких васкуляризированных органах, как печень и легкие. При этом в головном мозге не наблюдали изменения количества астроцитарных клеток (GFAP+). Введение сниженных доз ГКП (50×10³ и 15×10³ кл./мышь) не вызывало изменения уровней маркеров, ассоциированных с повреждением клеток (АЛТ, АСТ, ЛДГ, ГГТ), а также общего билирубина по сравнению с аналогичными параметрами в группе контроля. При изучении воспалительных процессов в головном мозге было обнаружено увеличение числа активированных астроцитов (GFAP+) после введения ГКП в дозе 150×10³ кл./мышь, в то время как количество активированной микроглии (IBA1+) не отличалось от контрольного значения во всех группах.

Настоящее исследование является пилотным, поскольку данные о безопасности длительного ретроорбитального введения ГКП получены впервые. На основании приведенных в этой работе результатов можно сделать вывод, что применение стволовых клеток в дозах, не превышающих 50×10³ кл./мышь, при выбранном способе введения не вызывает воспалительных реакций в головном мозге животных (низкие уровни GFAP и IBA1) и не изменяет биохимических показателей крови (АЛТ, АСТ, ЛДГ, ГГТ, общего билирубина), что подтверждает безопасность их введения в течение продолжительного времени. Введение клеток в дозах 150×10³ кл./мышь не вызывает изменения показателей крови животных, но влияет на состояние астроцитов и глии головного мозга. Возможно, в этом и заключается их воздействие на организм.

Полученные результаты свидетельствуют о важности подбора оптимальной дозы ГКП для проведения клеточной терапии, а также о потенциальной безопасности длительной терапии ГКП при соблюдении оптимальных условий дозирования. Необходимы дополнительные доклинические исследования с целью определения терапевтической эффективности установленных доз препарата, а также для разработки оптимального протокола клеточной терапии с использованием ГКП перед клиническими испытаниями.

Дополнительная информация. На сайте журнала «Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств» размещены рисунки 4, 6 и 8.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig4

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig6

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig8

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: В.О. Небогатиков — планирование исследования, выполнение эксперимента, проведение сравнительного анализа полученных результатов; сбор данных литературы; Д.И. Салихова — выполнение эксперимента, анализ полученных данных, систематизация и оформление результатов исследования, редактирование текста рукописи, сбор данных литературы; Е.В. Белоусова — работа с клеточными линиями, проведение вычислений, выполнение сравнительного анализа полученных результатов, работа с графическим материалом; Е.В. Броновицкий — работа с животными, статистическая обработка данных, редактирование текста рукописи; Е.А. Орлова — работа с лабораторными животными, редактирование текста рукописи; М.А. Лапшина — работа с клеточными линиями, редактирование текста рукописи; Д.В. Гольдштейн, А.А. Устюгов — основная идея исследования, редактирование текста рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Соответствие принципам этики. Проведение исследования было одобрено на заседании локального биоэтического комитета ИФАВ РАН (протоколы заседаний № 80 от 28.07.2023; № 81 от 30.08.2023).

Благодарности. Авторы выражают благодарность Центру коллективного пользования ИФАВ РАН за возможность использовать животных из биоресурсной коллекции с привлечением аппаратной базы Центра (Госзадание № FFSG-2024-0020).

Additional information. Figures 4, 6, and 8 are published on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation.

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig4

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig6

https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig8

Authors’ contributions. All authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Vladimir O. Nebogatikov designed the study, conducted the experiments and the comparative analysis of the results obtained, and collected literature data. Diana I. Salikhova conducted the experiments, analysed the data obtained, collated and presented the study results, edited the manuscript, and collected literature data. Ekaterina V. Belousova worked with cell lines, performed calculations, conducted the comparative analysis of the results obtained, and worked with the graphical materiaL. Evgeny V. Bronovitsky worked with animals, performed statistical processing of data, and edited the manuscripT. Ekaterina A. Orlova worked with animals and edited the manuscript. Mariya A. Lapshina worked with cell lines and edited the manuscript. Dmitry V. Goldshtein and Aleksey A. Ustyugov conceived the main idea of the study, edited the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication.

Ethics approval. The study was approved at a meeting of the Local Bioethics Committee of the Institute of Physiologically Active Compounds (IPAC) of the Russian Academy of Sciences (RAS) (minutes of meetings No. 80 of 28.07.2023 and No. 81 of 30.08.2023).

Acknowledgments. The authors express their gratitude to the Centre for Collective Use (IPAC, RAS) for the opportunity to use animals from the Bioresource Collection using the equipment of the Centre (State Assignment No. FFSG-2024-0020).

1. ГОСТ 33215-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур.2. ГОСТ 33216-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.3. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig44. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig65. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-650-fig8