Фармакологическое действие лекарственных растительных препаратов (ЛРП) определяется сочетанием биологически активных соединений в их составе. Одним из условий воспроизводимости фармакологического эффекта при применении ЛРП является изготовление препарата из подлинного и доброкачественного лекарственного растительного сырья (ЛРС). Однако в ряде случаев существует проблема идентификации производящего лекарственного растения, являющегося источником подлинного ЛРС, и его отличия от морфологически схожих видов, часто произрастающих в тех же условиях [1]. Даже подлинное ЛРС может не отвечать критерию доброкачественности вследствие повышенного содержания допустимых примесей близких видов неядовитых растений [2] и поллютантов [3].

К лекарственным растениям, для которых известен ряд морфологически схожих видов, относится ромашка аптечная (Matricaria recutita L.), широко применяемая как в мировой [4][5], так и в российской медицинской практике1 [6]. Цветки ромашки аптечной применяются как антибактериальное, противовоспалительное, спазмолитическое средство при заболеваниях верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта [5][7].

Цветки ромашки аптечной следует отличать от сходных по строению корзинок других растений семейства сложноцветных (Asteraceae), не подлежащих заготовке [4]. Согласно инструкции2 по сбору и сушке соцветий ромашки аптечной основными ромашковидными растениями европейской части России являются ромашка душистая (Matricaria suaveolens (Pursh) Buchenau), пупавка собачья (Anthemis cotula L.), пупавка полевая (Anthemis arvensis L.), во флоре Сибири преобладают нивяник обыкновенный (Leucanthemum vulgare Lam.), трехреберник непахучий (Tripleurospermum inodorum (L.) Sch.Bip.), ромашка душистая [8] и широко культивирующийся в качестве декоративного растения пиретрум девичий (Pyrethrum parthenium (L.) J.G.Sm.) [9].

Эти растения обладают различным химическим составом травы, цветков, различается также состав их эфирных масел. Так, основными действующими веществами эфирного масла ромашки аптечной являются хамазулен и бисаболол [10], тогда как в видах-примесях содержатся другие компоненты: эфирное масло M. suaveolens содержит β-мирцен, (Е)-β-фарнезен, геранил-3-метилбутаноат, гермакрен D [10–13], T. inodorum — матрикариа-эфир, гермакрен D, (Е)-β-фарнезен [10][13], L. vulgare — сабинен, мирцен, эвдесмол, (Е)-β-фарнезен [10], P. parthenium — камфору, (Е)-хризантенилацетат [14–16].

Поскольку ЛРС часто заготавливают сборщики без ботанического и фармакогностического образования, и на следующий этап обращения сырье уже может поступать в измельченном виде, то определение его доброкачественности становится затруднительным. Важно заметить, что сырье, содержащее примеси в недопустимом количестве, по товароведческим показателям и по количественному содержанию эфирного масла и флавоноидов, нормируемых согласно требованиям фармакопейной статьи, может соответствовать принятым нормам. Однако в связи с отличием состава действующих веществ из-за присутствия примесей может измениться фармакологическое действие ЛРП либо могут развиться нежелательные реакции при его приеме.

В фармакопейной статье ФС.2.5.0037.153 описаны методы определения подлинности и чистоты (наличия примесей) ЛРС по морфологическим признакам, достаточным для измельченного сырья, в котором присутствуют частицы с размерами более 2 мм. Вместе с тем в настоящее время значительная доля ЛРП, изготовленных из ромашки аптечной, выпускается в фильтр-пакетах, в которых частицы размером более 2 мм отсутствуют. Поэтому для определения подлинности данной продукции использование диагностических морфологических признаков существенно затруднено.

В цветках ромашки определяют количественное содержание эфирного масла, суммы флавоноидов в пересчете на рутин и экстрактивных веществ, извлекаемых водой. Однако данные показатели в связи с содержанием суммы подобных веществ во многих видах растений не могут быть использованы в качестве эффективного и достоверного критерия качества ЛРС. Одним из возможных путей видоспецифичной диагностики ЛРС может быть получение хроматограммы эфирного масла, в котором могут быть выявлены нехарактерные компоненты [17][18]. В этом случае требуется использование нескольких хроматографических методов анализа: высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием для фенольных компонентов ЛРС и газовой хроматографии для компонентов эфирного масла, что существенно усложняет процесс контроля качества ЛРС.

В наших предыдущих исследованиях [19] было показано, что состав микроэлементов растений определяется в первую очередь видовой принадлежностью растения, что позволяет говорить о гомеостазе микроэлементного статуса растения и использовать его при решении задач хемосистематики [20]. Важным обстоятельством является установленная корреляция между микроэлементным статусом и компонентным составом эфирного масла, получаемого из растения [21].

При использовании иерархической кластеризации микроэлементного статуса в качестве критерия сходства используется Евклидово расстояние в N-мерном пространстве, и если это расстояние превышает изменчивость определяемых параметров по промысловой заросли (~15%), то кластеры считаются разными [22]. Применение такого подхода при анализе ЛРС «Чабреца трава» [20] показало, что сформированный кластер качественного ЛРС «Чабреца трава» значимо отличается от кластера некачественного сырья.

Микроэлементный состав растения определяется не только условиями в месте его произрастания, но и в значительной степени его геномом, поскольку микроэлементы необходимы для синтеза растением видоспецифичных соединений. Растения семейства сложноцветных в качестве запасного вещества накапливают инулин в отличие от характерного для растений других семейств крахмала [7]. Поскольку исследования по связи микроэлементного состава с таксономическим положением были выполнены для крахмалоносных семейств [19–22], представляет интерес определить информативность микроэлементного состава для инулинсодержащих растений.

Цель работы — исследовать возможность использования метода иерархической кластеризации содержания микроэлементов в сложной биологической матрице (смеси растений) на примере ромашки аптечной.

В качестве объектов исследования были выбраны ромашка аптечная, пиретрум девичий, нивяник обыкновенный, трехреберник непахучий и ромашка душистая, собранные в окрестностях пос. Михайловский Новосибирской области (широта 55º04´, долгота 83º27´). В качестве сырья заготавливали цветки с цветоносами длиной не более 3 см по правилам заготовки ЛРС «Ромашки аптечной цветки». После сбора сырье доводили до воздушно-сухого состояния. Из высушенного сырья были приготовлены смеси на основе M. recutita с добавлением 10 и 25% по массе сырья примесных видов, заготовленного по тем же правилам (табл. 1). Исходное сырье и полученные смеси измельчали в ротационной мельнице TSM6A (Bosch) и разделяли на фракции с помощью лабораторных сит («Экрос») с размерами ячеек 5,0 мм (верхнее сито) и 0,2 мм (нижнее сито). Фракции крупнее 5,0 мм и меньше 0,2 мм отбрасывали.

Количественное определение элементов проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на спектрометре ELAN DRC-II (Perkin Elmer Inc) в соответствии с утвержденной методикой4.

Точную навеску измельченного сырья массой около 0,1–0,2 г помещали во фторопластовый вкладыш лабораторного автоклава. Дальнейший анализ проб проводили, как описано в работе [23]. Для минерализации проб использовали кислоту азотную концентрированную («Ленреактив», кат. № 011584) и кислоту фтористоводородную («Ленреактив», кат. № 200629). Контроль правильности определения проводили методом добавок.

Для построения калибровочных графиков использовали многоэлементные стандартные растворы ICP-MS-68-A и ICP-MS-68-В 0,01 г/л (High-Purity Standards), а также одноэлементный стандартный раствор Hg 1 г/л (High-Purity Standards). Стабильность градуировочных характеристик контролировали путем сравнения результатов определения содержания введенного внутреннего стандарта индия (¹¹⁵In, High-Purity Standards, кат. № 100024-2-100) в каждом анализируемом образце.

Для обеспечения стабильного режима работы масс-спектрометра все измерения проводили в термостатированных условиях при 22,0±1,5 ºС. Проводили пять параллельных определений для каждого анализируемого образца, за результат принимали среднее значение.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения Statistica 10, имеющего встроенные алгоритмы анализа данных многофакторных экспериментов. В качестве алгоритма анализа был принят метод иерархической кластеризации5. Полученные экспериментальные данные были представлены в виде матрицы, столбцы которой соответствовали исследуемым растительным образцам, а в строках были полученные средние значения содержания микроэлементов в растительном объекте. Для исключения влияния на результат величины абсолютных значений количества микроэлементов была произведена нормировка данных с использованием встроенной функции стандартизации по строкам и с приведением всех преобразованных переменных к единому диапазону значений, выраженных в каждой ячейке матрицы как отношение количества микроэлемента в каждом образце к среднему значению его содержания по всем исследуемым образцам.

Построение дендрограммы. Для построения дендрограммы в качестве способа измерения дистанции между кластерами было выбрано Евклидово расстояние между точками в многомерном пространстве, а в качестве алгоритма объединения — метод Варда [24], согласно которому для оценки расстояний между кластерами используются методы дисперсионного анализа. В качестве меры подобия (целевой функции) применяют внутригрупповую сумму квадратов отклонений, которая представляет собой сумму квадратов расстояний между каждой точкой (объектом) и средней по кластеру, содержащему этот объект. На каждом этапе объединяются такие два кластера, которые приводят к минимальному увеличению целевой функции, т.е. внутригрупповой суммы квадратов отклонений. Значимость увеличения целевой функции оценивается по критерию Фишера при уровне доверительной вероятности 0,95. В качестве критериев объединения точек в кластер использовали граничное условие о том, что Евклидово расстояние между точками меньше величины ε [24], критическое значение приемлемости которой было принято как изменение микроэлементного состава по объекту менее 15% и которая в данном случае выполняла роль доверительного интервала для оценки значимости различий между кластерами [19].

Для выявления закономерностей в многофакторных данных, полученных на биологических матрицах, использование статистического аппарата оценки доверительных интервалов параметрическими многофакторными корреляционными методами мало применимо и наиболее эффективно использование методов кластерного анализа. В этом случае вводится понятие виртуального многомерного пространства, базисными ортами которого являются нормированные концентрации микроэлементов. Построенное иерархическое дерево кластеров по результатам, приведенным в таблице 2, представлено на рисунке 1.

На основании построенного иерархического дерева и принятого критерия несходства статистически значимыми являются только кластеры в виде синглетонов [25] каждого из примесных видов, собственно M. recutita (доверительная вероятность p=0,95), тогда как для кластеров, объединивших синглетоны 2-4-8 и 1-3-5-6-7, принятый порог статистической значимости не был превышен (p=0,96).

В полученном распределении кластеров попадание образца 6 в кластер с образцами 1, 3, 5, 7 пока не находит своего объяснения и требует дальнейшего изучения. В целом анализ иерархического дерева позволил показать, что наиболее близки по микроэлементному статусу ромашка аптечная и пахучая, и это коррелирует с их таксономией. Смеси же, что вполне естественно, занимают промежуточные кластеры между ромашками (преобладающий вклад в их состав вносит ромашка аптечная). Все примесные виды растений и смеси с содержанием 10% и более примесей только по критерию несходства значимо отличаются от кластера микроэлементного состава ромашки аптечной, при этом сама кластерная группа не может рассматриваться как статистически значимый объект по результатам кластерного анализа.

Таким образом, необходима дальнейшая стандартизация метода кластерного анализа микроэлементного состава ЛРС «Ромашки аптечной цветки» для решения вопроса о возможности его использовании как потенциального инструмента для анализа сложных смесей растительного происхождения.

Построенное на примере растений семейства сложноцветных и их смесей иерархическое дерево кластеризации по 56 микроэлементам позволило определить сходство микроэлементного состава близкородственных видов Matricaria recutita и Matricaria suaveolens. Предложенный метод позволяет выявить присутствие примесных видов растений при их содержании в смеси более 10%.

Показана потенциальная возможность использования метода иерархической кластеризации содержания микроэлементов в биологической матрице для анализа сложных систем, и в том числе смесей растений.

При дальнейшей стандартизации метода данный подход может быть использован в качестве дополнительного критерия комплексной оценки качества лекарственного растительного сырья.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Д.Л. Прокушева — концепция работы, культивирование, сбор и сушка сырья, написание разделов рукописи «Введение» и «Заключение»; Д.С. Круглов — разработка методики пробоподготовки сырья для микроэлементного анализа, анализ данных, написание разделов рукописи «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждение»; В.В. Величко — редактирование и переработка текста рукописи, написание резюме, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.

Благодарности. Авторы выражают благодарность коллективу Химико-аналитического центра «Плазма» (г. Томск) и его директору Н.В. Федюниной за помощь в проведении настоящей работы.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Darya L. Prokusheva conceptualised the study; cultivated, collected, and dried herbal drugs; and drafted the Introduction and Conclusion sections. Dmitriy S. Kruglov developed the sample preparation procedure for trace element analysis, analysed data, and drafted the Materials and Methods section and the Discussion section. Victoria V. Velichko edited and revised the manuscript, drafted the abstract, and approved the final version of the manuscript for publication.

Acknowledgments. The authors express their gratitude to the staff of the Chemical-Analytical Center “Plasma” (Tomsk) and its director N.V. Fedyunina for assistance in carrying out this work.

1. Государственный реестр лекарственных средств https://grls.rosminzdrav.ru2. Правила сбора и сушки лекарственных растений. Сборник инструкций. М.: Медицина; 1985.3. ФС.2.5.0037.15 Ромашки аптечной цветки. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4. М.; 2018.4. НСАМ № 512-МС Определение элементного состава образцов растительного происхождения (травы, листья) атомно-эмиссионным и масс-спектральным методами анализа. М.: ФГБУ ВИМС; 2017.5. Буреева НН. Многомерный статистический анализ с использованием ППП “STATISTICA”. Учебно-методический материал по программе повышения квалификации «Применение программных средств в научных исследованиях и преподавании математики и механики». Нижний Новгород; 2007.6. В случае, когда синглетон характеризуется доверительной вероятностью р=0,95, а критерий несходства в виде индивидуальной изменчивости содержания имеет р=0,95, то общая доверительная вероятность их совместного применения будет равна произведению доверительных вероятностей 0,95×0,95=0,9025.