vedomostiregmedРегуляторные исследования и экспертиза лекарственных средствRegulatory Research and Medicine Evaluation3034-30623034-3453Federal State Budgetary Institution ‘Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products’ of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI ‘SCEEMP’)10.30895/1991-2919-2024-14-3-330-337vedomostiregmed-637Research ArticleБИОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫBIOANALYTICAL METHODSОпределение биологической активности гонадотропинов на крысах беспородных и линии Sprague Dawley. Часть 2. Определение биологической активности лютеинизирующего гормонаDetermination of Biological Activity of Gonadotrophins in Randombred and Sprague Dawley Rats. Part 2. Determination of Biological Activity of Luteinising Hormonehttps://orcid.org/0000-0003-2656-8131БатуашвилиТ. А.BatuashviliT. A.
Батуашвили Тамара Ариеловна, канд. биол. наук
Петровский бульвар, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Tamara A. Batuashvili, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
batuashvili@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6728-594XЧечетоваЕ. О.ChechetovaE. O.
Чечетова Екатерина Олеговна
Петровский бульвар, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Ekaterina O. Chechetova
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
stepanuk@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7143-8227ШадринП. В.ShadrinP. V.
Шадрин Павел Валерьевич
Петровский бульвар, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Pavel V. Shadrin
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
https://orcid.org/0000-0001-8615-952XНеугодоваН. П.NeugodovaN. P.
Неугодова Наталия Петровна, канд. биол. наук
Петровский бульвар, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Natalia P. Neugodova, Cand. Sci. (Biol.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation202420062024143330337Copyright © Батуашвили Т.А., Чечетова Е.О., Шадрин П.В., Неугодова Н.П., 20242024Батуашвили Т.А., Чечетова Е.О., Шадрин П.В., Неугодова Н.П.Batuashvili T.A., Chechetova E.O., Shadrin P.V., Neugodova N.P.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vedomostincesmp.ru/jour/article/view/637ВВЕДЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ. Тенденция к сокращению использования лабораторных животных при оценке качества лекарственных препаратов, а также появление новых технологий получения гонадотропных препаратов обусловливают необходимость разработки новых методик определения биологической активности природных и рекомбинантных препаратов передней доли гипофиза.
ЦЕЛЬ
ЦЕЛЬ. Выбор оптимальных условий определения биологической активности лютеинизирующего гормона в мочевых и генно-инженерных препаратах в испытаниях на крысах беспородных и линии Sprague Dawley.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Определение величины биологической активности мочевых и рекомбинантных препаратов лютеинизирующего гормона (ЛГ) проводили трехдозовым рандомизированным методом in vivo по схеме Steelman and Pohley путем сравнения биологической активности испытуемых и стандартных (СО) образцов. Для анализа были использованы результаты, полученные в течение двух лет. В качестве СО использовали стандарт ВОЗ, содержащий 183 МЕ фолликулостимулирующего гормона и 177 МЕ ЛГ/амп. Испытание проводили на неполовозрелых крысах-самцах беспородных и линии Sprague Dawley. В зависимости от статуса крыс выбирали условия проведения испытания.
РЕЗУЛЬТАТЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен сравнительный анализ результатов определения активности ЛГ in vivo на крысах-самцах по интегральному показателю s/b, позволяющему оценить одновременно разброс ответов и дозозависимость. Было показано, что использование самцов крыс линии Sprague Dawley (s/b=0,82±0,44) для определения биологической активности ЛГ возможно наравне с беспородными животными (s/b=0,68±0,58). Значения показателей s/b близки, несмотря на то что количество животных линии Sprague Dawley в испытаниях было в два раза меньше.
ВЫВОДЫ
ВЫВОДЫ. Показана возможность определения биологической активности ЛГ в препаратах менотропинов не только на беспородных, но и на линейных крысах-самцах. Проведение испытания на крысах линии Sprague Dawley позволяет подтвердить достоверность результатов, используя меньшее количество животных, что, в свою очередь, является не только гуманным, но и более выгодным экономически.
INTRODUCTION
INTRODUCTION. The tendency towards reducing the use of laboratory animals in pharmaceutical quality assessment, along with the development of new technologies for gonadotrophin production, necessitate the development of novel assays to determine the biological activity of natural and recombinant anterior pituitary preparations.
AIM
AIM. This study aimed to select the optimum conditions for the determination of the biological activity of luteinising hormone (LH) in urinary and genetically engineered LH preparations by tests in randombred and Sprague Dawley rats.
MATERIALS AND METHODS
MATERIALS AND METHODS. The biological activity of urinary and recombinant LH preparations was determined in vivo in a three-dose randomised Steelman–Pohley bioassay, which compared the biological activity of the test samples to a reference standard (RS). The analysis used two years’ worth of test results. The RS used was the WHO international standard containing 183 IU of follicle stimulating hormone bioactivity and 177 IU of LH bioactivity per ampoule. The bioassay was performed in immature male randombred and Sprague Dawley rats; the bioassay conditions were selected according to the rat type.
RESULTS
RESULTS. The results of the in vivo determination of LH biological activity in male rats were compared by the standard deviation to slope ratio (s/b), which helps estimate response variation and dose dependence at the same time. The study demonstrated the possibility of using Sprague Dawley rats (s/b=0.82±0.44) for the determination of LH biological activity along with randombred animals (s/b=0.68±0.58). The s/b ratios were close, although Sprague Dawley rats and randombred rats were used in the assay at a 1:2 ratio.
CONCLUSIONS
CONCLUSIONS. It is possible to determine the biological activity of LH from menopausal gonadotrophin preparations in both randombred and Sprague Dawley male rats. The use of Sprague Dawley rats for testing can confirm the reliability of test results using fewer animals than needed for standard tests; this is not only humane but also cost effective.
гонадотропные гормоныменотропинырекомбинантные гонадотропинылютеинизирующий гормонбиологическая активностькрысы беспородныеSprague Dawleyлинейные крысылабораторные животныеgonadotrophic hormonesmenopausal gonadotrophinsrecombinant gonadotrophinsluteinizing hormonebiological activityrandombred ratsSprague Dawleylaboratory animalsРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00026-24-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 124022300127-0).The study reported in this publication was carried out as part of publicly funded research project No. 056-00026-24-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (R&D public accounting No. 124022300127-0).ВВЕДЕНИЕ
Для успешного фолликулогенеза наряду с фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) в состав мочевых и рекомбинантных гонадотропных препаратов входит лютеинизирующий гормон (ЛГ) — гликопротеин, состоящий из двух субъединиц, биологические свойства которого определяет β-субъединица. Молекулы ЛГ отличаются от ФСГ наличием сульфидных мостиков. В организме секреция гормона происходит под воздействием гонадолиберина (гонадотропин-рилизинг-гормон), который синтезируется в гипоталамусе. Помимо участия в выработке эстрогенов, прогестерона и тестостерона ЛГ способствует формированию желтого тела, процессу овуляции, а также созреванию фолликулов [1].
Как и хорионический гонадотропин человека, ЛГ обладает лютеинизирующей активностью, но имеет существенные молекулярные и функциональные отличия, которые хорошо улавливает рецептор, находящийся на гранулезных клетках и взаимодействующий с обоими гормонами. Только гетеродимерные полностью гликозилированные формы гормонов способны проявлять биологическую активность (БА). По этой причине для получения рекомбинантных гормонов пригодны только культивируемые клетки млекопитающих, в которых происходит корректное гликозилирование целевых белков [2][3]. Учитывая особенности и технологии получения мочевых и рекомбинантных гонадотропинов, требуется обязательный контроль биологической активности препаратов данной группы.
Большинство препаратов группы менотропинов содержат ЛГ и ФСГ в соотношении 1:1 или 1:21. Однако рекомбинантные гонадотропные препараты выпускают как в виде монопрепаратов (содержащих либо рекомбинантный ФСГ (рФСГ), либо рекомбинантный ЛГ (рЛГ), так и в виде препаратов содержащих оба гормона (рФСГ и рЛГ).
Цель работы — выбор оптимальных условий определения биологической активности лютеинизирующего гормона в мочевых и генно-инженерных препаратах в испытаниях на крысах беспородных и линии Sprague Dawley.
Задачи исследования:
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение величины биологической активности ЛГ проводили биологическим трехдозовым рандомизированным методом по схеме Steelman and Pohley, сравнивая биологическую активность испытуемого образца (ИО) со стандартным образцом (СО) [4].
В качестве СО использовали стандарт ВОЗ, содержащий 183 МЕ ФСГ и 177 МЕ ЛГ/амп. (кат. №10/286)2. Испытания проводили с использованием крыс-самцов беспородных3 и линии Sprague Dawley4. Животных содержали в стандартных условиях вивария. Доступ к воде и пище был свободным. Все манипуляции на животных проводили в соответствии с требованиями нормативных документов5. Масса крыс на начало опыта составляла 32–36 г. В качестве ответа принимали относительную массу органа (ОМО), в данном случае — комплекса добавочных половых желез (mоргана/mтела, мг/г).
В качестве растворителя для приготовления растворов в рабочих концентрациях использовали альбумино-фосфатный буфер6.
В испытание брали шесть групп животных, в каждой из которых было от 5 до 10 крыс в зависимости от выбранной методики. Во время проведения опыта ежедневно в течение четырех суток крысы получали подкожные инъекции 1 раз/сут в одно и то же время. Трем группам вводили растворы СО (малая, средняя, большая дозы), а трем другим — ИО соответственно. Курсовые дозы, полученные каждым животным в течение опыта, соответствовали требованиям выбранной методики (табл. 1, 2). На пятый день проводили эвтаназию и выделяли комплекс добавочных половых желез. Очищенные и просушенные фильтровальной бумагой органы взвешивали и вычисляли ОМО. БА рассчитывали в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации7. В общей сложности в течение двух лет было использовано 360 беспородных и 180 животных линии Sprague Dawley.
Таблица 1. Реакция беспородных самцов крыс на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона (добавочные половые железы)
Table 1. Responses of male randombred rats to the international standard for luteinising hormone (accessory sex organs)
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
4,5
1,45±0,11
16,5
1,60±0,07
39,0
1,86±0,12
Таблица 2. Реакция самцов крыс линии Sprague Dawley на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона (добавочные половые железы)
Table 2. Responses of male Sprague Dawley rats to the international standard for luteinising hormone (accessory sex organs)
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
4,5
1,29±0,07
14,3
1,92±0,16
35,0
2,24±0,26
На первом этапе была проведена оценка собранных за весь период проведения испытания данных, характеризующих ответ животных беспородных и линии Sprague Dawley на подкожное введение СО ЛГ при определении БА менотропинов. Графики зависимости эффекта от дозы проанализировали по тангенсу угла наклона (коэффициенту регрессии b) и разбросу (дисперсии s²). Чем больше угол наклона линии, тем выше дозозависимость; чем меньше дисперсия результатов в испытании, тем они более точны и воспроизводимы. Для крыс каждого статуса вычисляли интегральный коэффициент s/b. Чем меньше его значение, тем выше чувствительность крыс.
Вторым этапом работы стал анализ ответов, полученных при определении БА (сравнение ИО с СО) различных препаратов менотропинов на беспородных и линейных животных. Регрессионный и дисперсионный анализ данных, а также вычисление БА ЛГ проводили с помощью электронных таблиц Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При оценке данных СО ЛГ величины курсовых доз и соответствующие ответы животных, в которых значения ОМО различались статистически незначимо, усреднили и объединили. Полученные результаты представлены в таблицах 1, 2 и на рисунке 1.
Рис. 1. Объединенная реакция крыс-самцов беспородных и линии Sprague Dawley на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона с линейной аппроксимацией
Fig. 1. Pooled responses of male randombred and Sprague Dawley rats to the international standard for luteinising hormone, with linear approximation
Следующим этапом исследования была оценка статистической значимости дозозависимости с помощью дисперсионного анализа и ее сравнение для крыс беспородных и линии Sprague Dawley, получавших СО ЛГ.
Для применения модели параллельных прямых дозозависимость должна быть линейна и статистически значима. Эти параметры характеризуют источники дисперсии — показатели «Нелинейность» и «Регрессия» соответственно. Наблюдаемое значение критерия Фишера для первого показателя должно быть меньше, а для второго — больше критического.
Дисперсионный анализ полученных линий регрессии показал наличие статистически значимой дозозависимости и незначимой нелинейности (табл. 3, 4) для реакции животных на введение растворов СО ЛГ [5].
Таблица 3. Результаты оценки реакции беспородных крыс-самцов на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона (методом дисперсионного анализа)
Table 3. Analysis of variance of pooled responses of male randombred rats to the international standard for luteinising hormone
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. «–» — не применимо.
Note. —, not applicable.
Регрессия
Regression
1
1,94
1,94
19,41>6,83
99
Отклонение от регрессии (нелинейность)
Departure from regression (non-linearity)
Таблица 4. Результаты оценки реакции крыс-самцов линии Sprague Dawley на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона (методом дисперсионного анализа)
Table 4. Analysis of variance of pooled responses of male Sprague Dawley rats to the international standard for luteinising hormone
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. «–» — не применимо.
Note. —, not applicable.
Регрессия
Regression
1
12,56
12,56
37,64>6,86
99
Отклонение от регрессии (нелинейность)
Departure from regression (non-linearity)
На основании полученных данных (табл. 1, 2) был проведен анализ линий дозозависимости СО ЛГ беспородных и линейных крыс [6]. Сравнить коэффициенты регрессии с помощью t-критерия не представлялось возможным, так как линии характеризовались разным разбросом (рис. 1, табл. 1, 2). При этом дисперсия дозозависимости животных линии Sprague Dawley была значительно выше, чем у беспородных (Fнабл > Fкритич). Поэтому о непараллельности линий дозозависимости реакции крыс беспородных и линии Sprague Dawley на введение СО ЛГ судили по непересекающимся доверительным границам коэффициентов регрессии b: 0,16±0,07 (беспородные животные) и 0,47±0,15 (линейные животные) при P=95% (табл. 5) [5]. Интервалы доверительных границ не пересекаются, поэтому различие реакции животных следует считать статистически значимым (рис. 1). Следовательно, при введении СО ЛГ дозозависимость у животных линии Sprague Dawley (P=95%) значительно выше, чем у беспородных (табл. 6) [6][7].
Таблица 5. Анализ линий регрессии, характеризующих реакцию крыс-самцов беспородных и линии Sprague Dawley на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона
Table 5. Analysis of regression lines characterising responses of male randombred and Sprague Dawley rats to the international standard for luteinising hormone
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. F — критерий Фишера; f — число степеней свободы.
Note. F, Fisher’s test; f, number of degrees of freedom.
Коэффициент линейной регрессии b
Slope, b
0,16
0,47
Дисперсия s²
Variance, s²
0,10
0,34
Среднее значение натурального логарифма курсовой дозы x
Mean ln (accumulated dose) x
2,55
2,64
Средний ответ y
Mean response y, mg/g
81,59
81,87
Сравнение дисперсий s²
Comparison of variances, s²
Fнабл (Fcalculated )=3,37
f большей дисперсии
f, maximum variance
f меньшей дисперсии
f, minimum variance
Дисперсии статистически значимо различаются
Significant difference between variances
Fкритич (Fcritical )=1,34 (P=95%)
118
137
Таблица 6. Показатели, характеризующие реакцию крыс-самцов беспородных и линии Sprague Dawley на введение стандартного образца лютеинизирующего гормона
Table 6. Parameters characterising responses of male randombred and Sprague Dawley rats to the international standard of luteinising hormone
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. s — среднее квадратическое отклонение; P — доверительная вероятность.
Note. s, standard deviation; P, confidence probability.
Показатель
Parameter
Значение показателя в группе животных
Parameter value in the group of animals
Беспородные
Randombred
Sprague Dawley
Коэффициент линейной регрессии (опорное значение ± полуширина доверительного интервала b±Δb, P=95%)
Slope (average value ± confidence interval half-width b±Δb, P=95%)
0,16±0,07
0,47±0,15
Дисперсия (s²)
Variance (s²)
0,10
0,34
Интегральный показатель s/b
Standard deviation/slope ratio (s/b)
1,93
1,25
Таким образом, у беспородных животных меньше разброс результатов, а у крыс линии Sprague Dawley выше дозозависимость. Для сравнительной оценки чувствительности крыс разных статусов применили интегральный коэффициент s/b, который характеризует баланс разброса ответов и степени дозозависимости. Чем ниже значение данного коэффициента, тем выше чувствительность. Значение для линейных животных составило 1,25, для беспородных — 1,93 (табл. 6), что свидетельствует о более высокой чувствительности линейных животных к СО ЛГ.
Анализ результатов определения БА (сравнение ИО с СО) показал, что различие средних значений интегрального показателя для животных обоих статусов (0,68±0,58 и 0,82±0,44 для беспородных и линейных крыс соответственно) статистически незначимо при том, что число линейных животных в каждом испытании было в два раза меньше, чем беспородных. Таким образом, можно сделать вывод, что для сокращения числа животных при определении биологической активности ЛГ в препаратах менотропина возможно использовать крыс линии Sprague Dawley.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам проведенного анализа установлено, что:
Результаты исследования будут учтены при пересмотре общей фармакопейной статьи «Биологические испытания гонадотропинов» для следующего издания отечественной фармакопеи.
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Т.А. Батуашвили — планирование исследования, выполнение эксперимента, проведение сравнительного анализа полученных результатов, сбор данных литературы; Е.О. Чечетова — выполнение эксперимента, анализ полученных данных, систематизация и оформление результатов исследования, редактирование текста рукописи; П.В. Шадрин — проведение вычислений, выполнение сравнительного анализа полученных результатов, работа с графическим материалом; Н.П. Неугодова — идея исследования, редактирование текста рукописи, утверждение окончательного варианта рукописи для публикации.
Соответствие принципам этики. Проведение исследования было одобрено на заседании локального этического комитета ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (протокол заседания № 3 от 16.11.2023).
Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Tamara A. Batuashvili planned the study, conducted experiments, performed the comparative analysis of the results obtained, and collected literature data. Ekaterina O. Chechetova conducted experiments, analysed the data obtained, collated and formatted the study results, and edited the manuscript. Pavel V. Shadrin carried out calculations, performed the comparative analysis of the results obtained, and worked with the graphical material. Natalia P. Neugodova elaborated the main idea of the study, edited the manuscript, and approved the final version of the manuscript for publication.
Ethics approval. The study was approved at a meeting of the Local Ethics Committee of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (Minutes of Meeting No. 3 dated 16.11.2023).
1. https://www.rlsnet.ru/active-substance/menotropiny-757
2. https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/blood-products/catalogue/alphabetical-list.pdf?sfvrsn=15455482_2
3. ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, Филиал «Андреевка».
4. НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН.
5. СП 2.2.1.3218-14 Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). 2014.
6. ОФС.1.2.4.0014.18 Биологические испытания гонадотропинов. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018.
7. ОФС.1.1.0014.15 Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1. М.; 2018.
ReferencesРудакова ЕБ, Серова ОФ, Стрижова ТВ, Федорова ЕА, Острина СЯ. Роль лютеинизирующего гормона в овариальной стимуляции в программах экстракорпорального оплодотворения (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2022;28(1):129–35. https://doi.org/10.17116/repro202228011129Rudakova EB, Serova OF, Strizhova TV, Fedorova EA, Ostrina SYa. The role of luteinizing hormone in ovarian stimulation of IVF programs (literature review). Russian Journal of Human Reproduction. 2022;28(1):129–35 (In Russ.). https://doi.org/10.17116/repro202228011129Орлова НА, Ковнир СВ, Ходак ЮА, Ползиков МА, Воробьев ИИ. Рекомбинантный лютеинизирующий гормон человека для лечения бесплодия: получение линий-продуцентов. Акушерство, гинекология и репродукция. 2017;11(3):33–42. https://doi.org/10.17749/2313-7347.2017.11.3.033-042Orlova NA, Kovnir SV, Khodak YuA, Polzikov MA, Vorobyov II. Recombinant human luteinizing hormone for the treatment of infertility: the generation of producer cell lines. Obstetrics, Gynecology and Reproduction. 2017;11(3):33–42 (In Russ.). https://doi.org/10.17749/2313-7347.2017.11.3.033-042Mullen MP, Cooke D, Crow M. Structural and functional roles of FSH and LH as glycoproteins regulating reproduction in mammalian species. In: Vizcarra J, ed. Gonadotropin. Chapter 8. InTech; 2013. P. 155–80. https://doi.org/10.5772/48681Mullen MP, Cooke D, Crow M. Structural and functional roles of FSH and LH as glycoproteins regulating reproduction in mammalian species. In: Vizcarra J, ed. Gonadotropin. Chapter 8. InTech; 2013. P. 155–80. https://doi.org/10.5772/48681Steelman SL, Pohley FM. Assay of the follicle-stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 1953;53(6):604–16. https://doi.org/10.1210/endo-53-6-604Steelman SL, Pohley FM. Assay of the follicle-stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 1953;53(6):604–16. https://doi.org/10.1210/endo-53-6-604Burn JH, Finney DJ, Goodwin LG. Biological standardization. London: Oxford University Press; 1952.Burn JH, Finney DJ, Goodwin LG. Biological standardization. London: Oxford University Press; 1952.Урбах ВЮ. Биометрические методы. Статистическая обработка опытных данных в биологии, сельском хозяйстве и медицине. М.: Наука; 1964.Urbakh VYu. Biometric methods. Statistical processing of experimental data in biology, agriculture and medicine. Moscow: Nauka; 1964 (In Russ.).Беленький МЛ. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Медгиз; 1963.Belenkiy ML. Elements of quantitative assessment of pharmacological effects. Leningrad: Medgiz; 1963 (In Russ.).
The authors declare that there are no conflicts of interest present.