Лекарственные средства растительного происхождения широко представлены на фармацевтическом рынке, основной областью их применения является терапия заболеваний дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и нервной системы [1]. Особое место занимают лекарственные средства растительного происхождения, действие которых направлено на стимулирование неспецифической иммунной системы [2]. К таким лекарственным средствам относятся препараты на основе эхинацеи пурпурной [3], показаниями к применению которых являются кратковременная профилактика и лечение в составе комплексной терапии острых респираторных заболеваний при приеме внутрь и лечение небольших поверхностных раневых повреждений при наружном применении1.

Основной группой действующих веществ эхинацеи пурпурной, по которым стандартизируют сырье, являются гидроксикоричные кислоты (ГКК) и их производные2. Целесообразной представляется разработка способов повышения степени экстракции ГКК из эхинацеи пурпурной травы с целью получения в дальнейшем лекарственных форм с повышенным содержанием ГКК.

При производстве лекарственных форм, получаемых методом экстракции, рациональным способом повышения извлечения биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья (ЛРС) является предварительная обработка — физическое, химическое или микробиологическое воздействие непосредственно на воздушно-сухое или свежее ЛРС. К способам предварительной обработки относят обезжиривание, термическую, ультразвуковую обработку и их комбинации [4–6].

При обезжиривании эхинацеи пурпурной травы из сырья удаляются липофильные компоненты (каротиноиды, хлорофиллы, алкиламиды и др.) [7], что может увеличить степень экстракции ГКК.

Цель работы — изучение влияние обезжиривания эхинацеи пурпурной травы на экстракцию гидроксикоричных кислот и оценка возможности использования процедуры обезжиривания в технологии получения настоек эхинацеи.

Объектом исследования служили промышленные серии эхинацеи пурпурной травы производства ООО «НПК Биотест» и ООО «Падис’С» и высушенная воздушно-теневым способом трава, заготовленная от культивируемых форм в Ботаническом саду УО «БГМУ» в д. Новое поле в 2021 и 2022 гг. Для оценки возможности объединения результатов четырех серий исследований (g=4) применяли критерий Кохрена3, так как объединяемые дисперсии имели одинаковое количество степеней свободы ν=2. По итогам расчета расчетное значение критерия Кохрена Gэксп составило 0,5024 (табличное значение критерия Кохрена Gтабл=0,7679). Так как Gтабл>Gэксп, то результаты, полученные на разных образцах сырья, можно объединить и использовать для последующего анализа объединенные средние значения показателей.

Изучали влияние следующих параметров обезжиривания на экстракцию ГКК: природа обезжиривающего агента, соотношение сырье:обезжиривающий агент (г:мл) (1:5, 1:10, 1:25, 1:50 и 1:100), продолжительность обработки (1–4 ч) и кратность обезжиривания (одно-, двух- и трехкратное). Подбор факторов осуществляли последовательно, на каждой последующей стадии учитывали параметр, подобранный на предыдущей стадии.

Содержание суммы производных ГКК в пересчете на цикориевую кислоту определяли по фармакопейной методике4. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре Solar серии PB2201 (ЗАО «Солар», Республика Беларусь).

Дополнительно исследование выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по методике5. В работе использовали стандартные образцы хлорогеновой (кат. № 1115545), кофейной (кат. № 1084995), цикориевой (кат. № 1105315) и кафтаровой кислот (кат. № 1086039) (все — квалификации EP CRS с содержанием действующего вещества не менее 98%, Sigma-Aldrich). В качестве компонентов подвижной фазы использовали ацетонитрил (квалификация «for HPLC», Sigma-Aldrich, кат. № 34851), кислоту фосфорную (квалификация «for HPLC», Sigma-Aldrich, кат. № 04102) и воду деионизированную.

Перед хроматографированием полученные извлечения центрифугировали на центрифуге СМ-70М.07 (ELMI, Латвия) при 7000 об./мин в течение 5 мин и отбирали надосадочную жидкость. Деионизацию воды очищенной осуществляли на деионизаторе ДВ–1 (ООО «ЦветХром», Россия).

Анализ проводили на жидкостном хроматографе Ultimate 3000 (Ultimate, Германия) с насосом на четыре растворителя и устройством для вакуумной дегазации элюента, автосэмплером с термостатом, термостатом для колонок с краном переключения, диодно-матричным и флуоресцентным детекторами. Обработку хроматограмм и спектров поглощения проводили с помощью компьютерной программы Chromeleon 7. Относительное содержание ГКК в сырье рассчитывали методом внутренней нормализации.

В качестве обезжиривающих агентов использовали органические растворители (все — х.ч., ОДО «ХимХром»): гексан, гептан, петролейный эфир 40–70, диэтиловый эфир, бензол, о-ксилол, толуол, дихлорэтан, дихлорметан и хлороформ (табл. 1).

После проведения обезжиривания липофильную вытяжку отфильтровывали, сырье с фильтра отжимали и оставляли на несколько (до пяти) суток при комнатной температуре для естественного улетучивания обезжиривающего агента под вытяжкой.

Оценку содержания остаточных количеств органических растворителей после обезжиривания выполняли методом газовой хроматографии. Во флакон емкостью 20 мл помещали 1,0 мл тестовой смеси, которая включала 25 стандартных легколетучих веществ, и 8,0 мл воды, закрывали пробкой, закатывали металлическим колпачком и помещали в парофазную приставку на 15 мин. Условия пробоподготовки в приставке: температура нагрева пробы — 90 °С; стабилизация бани — 1 мин; время нагрева образца 15 мин; миксер — 1 мин (мощность встряхивания — 1); вторая стабилизация образца — 1 мин; установка давления — 0,4 мин; давление — 15 psi; стабилизация давления — 0,4 мин; наполнение петли — 0,3 мин; стабилизация петли — 0,3 мин; время инжекции — 0,4 мин; температура петли — 100 °С; температура линии — 105 °С. Парогазовая фаза автоматически вводилась в газовый хроматограф.

В аналогичных условиях выдерживали исследуемые пробы (1,0 г обезжиренного или нативного сырья или 1,0 мл настойки, полученной из нативного; обезжиренного; обезжиренного и термически обработанного; термически обработанного и обезжиренного сырья и 8,0 мл воды), после чего пробы охлаждали до комнатной температуры и вводили в хроматограф.

Использовали газовый хроматограф с масс-спектрометрическим детектором Agilent Technologies 7890B (США), колонку кварцевую капиллярную 30 м × 0,25 мм, ΔF=0,25 мкм с неподвижной жидкой фазой 100% полидиметилсилоксаном (HP-1), детектор — масс-селективный MSD 5977B, тип — «квадруполь» (температура 280 °C), интервал сканируемых масс — 40–300 m/z; для идентификации веществ допускался временной интервал поиска ±2%. Условия хроматографического анализа: температура термостата колонки (начальная температура 35–40 °C — 6 мин; программирование температуры от 10 °C/мин до 100 °C, выдержка 1 мин при 100 °C, подъем температуры 15 °C/мин до 180–200 °C, выдержка 7 мин при температуре 180–200 °C); температура инжектора 280 °C, Transfer Line 300 °С; объем вводимой газовой пробы 0,2–1,0 мл; газ-носитель — гелий со скоростью 1,0–2,0 мл/мин; деление потока в инжекторе 1:10 — 1:20.

Идентификацию остаточных органических растворителей проводили путем сопоставления времен удержания веществ исследуемых проб и веществ тестовой смеси. Допустимое отклонение времени удержания составляло ±1%. Расчет содержания растворителей проведен методом одного стандарта.

Термическую обработку проводили при помощи стерилизатора воздушного «Витязь ГП 10-3» (ОАО «Витязь», Республика Беларусь) при следующих условиях: температура в упаковке — 60 ºС; продолжительность — 0,5–2 ч; толщина слоя обрабатываемого порошка сырья — 2–4 см. Ультразвуковая обработка проведена в экстракторе НО-455.00 ПС (ООО «Александра-Плюс», Российская Федерация) в следующих условиях: продолжительность — 45 мин; частота колебаний ультразвука — 21 кГц; толщина слоя обрабатываемого порошка сырья — до 1 см. Ультразвуковую экстракцию проводили на этом же приборе в течение 60 мин при указанной частоте ультразвуковых колебаний.

Механическое перемешивание при обезжиривании и получении настоек осуществляли при помощи орбитального шейкера KS 130 basic (IKA, Германия) при 240 об./мин. Продолжительность перемешивания при получении настоек составила 60 мин.

Настойки получали методом мацерации и ее модификациями (бисмацерация, ремацерация) путем настаивания ЛРС в широкогорлых сосудах из темного стекла с крышкой. Для интенсификации извлечения использовали ультразвуковую экстракцию в течение 60 мин и механическое перемешивание в течение 60 мин после проведения мацерации в течение 7 сут.

Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы Microsoft Office Exсel 2016 (пакет «Анализ данных»). Каждое испытание проводили три раза (n=3). Результаты представляли в виде X ± ∆x, где X — среднее значение выборки; ∆x — полуширина доверительного интервала средней величины. Для выявления статистически значимого влияния факторов обезжиривания проводили дисперсионный анализ. Значения статистически значимо различались при p-value (р) < 0,05.

Предварительное обезжиривание эхинацеи пурпурной травы петролейным эфиром и гептаном приводило к статистически значимому повышению экстракции ГКК на 15,6% (отн.) (р=0,018) и 24,5% (отн.) (р=0,010) соответственно по сравнению с ЛРС, которое не подвергалось обезжириванию (рис. 1). При этом обезжиривание гептаном на 6,4% (отн.) (р=0,068) (относительное стандартное отклонение (RSD)=11,8%) увеличивало экстракцию ГКК по сравнению с петролейным эфиром (RSD=25,4%) и имело лучшую воспроизводимость, поэтому в дальнейших экспериментах для обезжиривания использовали гептан.

Содержание ГКК при обезжиривании в течение 1, 2 и 4 ч составило 6,80±0,27; 5,10±0,34 и 3,82±0,45% соответственно. Увеличение длительности обезжиривания приводило к снижению содержания ГКК (коэффициент корреляции r=–0,9046). Максимум наблюдали при обработке в течение 1 ч, дальнейшее увеличение продолжительности обезжиривания до 2 ч снижало содержание на 36,0% (отн.) (р=0,013).

Содержание ГКК практически не менялось при разных соотношениях сырья и экстрагента (р=0,25) (рис. 2), поэтому при выборе соотношения исходили из необходимости экономии растворителя и в дальнейшем применяли соотношение 1:5 (г:мл).

При одно-, двух- и трехкратном обезжиривании содержание ГКК составило 7,78±0,50; 6,59±0,39 и 3,61±0,29% соответственно. С увеличением кратности обезжиривания содержание ГКК снижалось (r=0,9568), однократное обезжиривание на 17,9% эффективнее двукратного. При проведении дисперсионного анализа влияния параметров обезжиривания на экстракцию ГКК установлено, что вязкость (р=2,8×10-3), относительная плотность (р=2,1×10-3), температура кипения (р=4,8×10-3) агента, продолжительность (р=3,8×10-3) и кратность обезжиривания (р=5,8×10-4) статистически значимо (p<0,05) влияли на экстракцию ГКК. Диэлектрическая постоянная обезжиривающего агента (р=0,09) и соотношение сырья и гептана (р=0,24) не влияли на процесс экстракции статистически значимо.

На основе экспериментально подобранных параметров предложена следующая методика обезжиривания эхинацеи пурпурной травы: 100 г воздушно-сухого ЛРС помещают в плотно закрывающуюся или укупоренную емкость, добавляют 500 мл гептана, плотно закрывают или укупоривают и помещают на механическую мешалку или перемешивают иным способом при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем проводят фильтрацию и отжим сырья, обезжиренное ЛРС после фильтрования и отжима оставляют до 5 сут для естественного удаления остатков обезжиривающего агента. Обезжиренное ЛРС используют для экстракции ГКК.

При использовании предложенного способа предобработки выход ГКК при экстракции обезжиренного сырья (7,90±0,41%) возрастал на 34,1% (отн.) (р=0,013) по сравнению с ЛРС, которое не прошло предварительную обработку (5,80±0,31%).

Относительное содержание индивидуальных ГКК в обезжиренной и нативной эхинацеи пурпурной траве практически одинаково (табл. 2), что указывает на то, что обезжиривание не влияет на качественный состав доминирующих ГКК.

При получении настоек методом мацерации наибольшая степень извлечения ГКК наблюдалась при экстракции 60% этанолом (рис. 3a). При мацерации от 1 до 7 сут содержание ГКК плавно возрастало (r=0,9023), затем с 7 по 14 сут снижалось (r=0,9602), максимум содержания фиксировался на 7 сут (рис. 3b). При соотношении сырья и экстрагента 1:10 (г:мл) содержание ГКК значимо больше (на 15,2% (p=0,040)), чем при 1:5 (г:мл) (рис. 3c). Степень измельчения сырья значимо не влияла (р=0,072) на содержание ГКК (рис. 3d). При отстаивании от 1 до 3 сут содержание ГКК практически не изменялось по сравнению с исходной вытяжкой (р=0,26). На 4 сут содержание ГКК значимо снижалось на 56,5% (отн.) (р=1,9×10-4) (рис. 3e).

Максимальное содержание ГКК отмечено в настойках, полученных с применением механического перемешивания или ремацераций (рис. 4), что больше на 29,1% (отн.) (р=0,024) и 35,6% (отн.) (р=0,015) соответственно, чем при использовании ультразвуковой обработки. При получении настоек из обработанного ультразвуком сырья содержание ГКК составило 1,99±0,14%, что значимо (р=0,31) не отличалось от настоек, полученных при комбинировании мацерации с последующей ультразвуковой экстракцией.

При проведении дисперсионного анализа влияния на экстракцию ГКК технологических параметров получения настоек эхинацеи установлено, что продолжительность мацерации (р=1,8×10-4), соотношение сырья и экстрагента (р=2,2×10-6), способ получения (р=2,0×10-4) и продолжительность отстаивания (р=4,6×10-4) влияли на состав полученного экстракта статистически значимо (p<0,05).

С учетом подобранных технологических параметров можно предложить следующую технологию получения настойки эхинацеи. Сырье со степенью измельчения от 500 до 2000 мкм заливают рассчитанным объемом 60% этанола (с учетом коэффициента спиртопоглощения) при соотношении сырья и экстрагента 1(г):10(мл) и оставляют для настаивания в течение 7 сут. Затем в течение 60 мин механически перемешивают, извлечение сливают, процеживают, отжимают сырье, вытяжку оставляют для отстаивания при температуре не выше 10 ºС в течение не более 3 сут, после чего фильтруют.

Настойки, полученные из предварительно обработанного сырья, содержали больше ГКК (от 21,6% (отн.) (р=0,0097) до 48,1% (отн.) (р = 0,0019)), чем полученные из нативного сырья. Наибольший выход ГКК в настойку наблюдали при термической обработке сырья (рис. 5).

Качественный состав смеси ГКК в настойках, полученных из нативного и обработанного сырья, одинаков (рис. 6. «Хроматограммы образцов настоек, полученных из лекарственного растительного сырья (ЛРС) нативной и предварительно обработанной эхинацеи пурпурной травы», опубликован на сайте журнала6). Спектральные характеристики идентифицированных ГКК также являлись практически идентичными (рис. 7. «Спектры поглощения гидроксикоричных кислот, идентифицированных в образцах настоек эхинацеи пурпурной травы», опубликован на сайте журнала7).

При получении настойки эхинацеи другими способами содержание ГКК составляло в два и более раз меньше (р=0,0063), чем при получении предложенным выше способом с дополнительной термической обработкой сырья. Так, в работе8 при получении настойки ремацерацией 40% этанолом при соотношении 1(г):1(мл) по 24 ч содержание ГКК составило 2,120±0,135%; в работе [8] — мацерацией в течение 7 сут 55% этанолом — 0,560±0,021%; в исследовании [9] комбинацией ремацерации по 24 ч при соотношении 1(г):5(мл) 40% этанолом с последующей термической экстракцией при 70 ºС 1(г):8(мл) 30 мин — 0,530±0,013%.

В результате газохроматографического анализа в образцах, полученных из сырья эхинацеи пурпурной травы, подвергавшегося обезжириванию, обнаружен остаточный экстрагент — гептан (класс 3: малоопасные растворители). Количество гептана составило: в обезжиренном сырье; образцах настоек, полученных из обезжиренного сырья; обезжиренном с последующей термообработкой сырье; термически обработанном с последующим обезжириванием сырье 0,017; 0,010; 0,0093 и 0,011% (предел содержания составляет 0,5%9). В образцах нативного сырья (эхинацеи пурпурной травы) и настойки, полученной из нативного сырья, обезжириванию не подвергавшихся, гептан не обнаружен.

Предварительное обезжиривание эхинацеи пурпурной травы обработкой малополярными растворителями увеличивает экстракцию ГКК, экстракция значимо и воспроизводимо возрастает при обезжиривании гептаном. Подобраны следующие параметры проведения обезжиривания эхинацеи пурпурной травы: обезжиривающий агент — гептан; соотношение обезжиривающий агент : сырье — 1(г):5(мл); продолжительность обезжиривания — 1 ч; кратность обезжиривания — однократное. Следует отметить, что обезжиренное сырье и настойки, полученные из обезжиренного сырья при разных вариантах предварительной обработки, содержат гептан в количестве меньшем, чем фармакопейная норма содержания данного остаточного растворителя.

Применение предварительной обработки (обезжиривание, термическая обработка и их комбинации) приводило к повышению содержания ГКК в настойках, максимальный выход был зафиксирован при использовании термической обработки. Однако все изучаемые виды предобработки повышали экстракцию ГКК при получении настоек, в том числе обезжиривание, что позволяет рекомендовать их использование в зависимости от материально-технической базы. Выявлено, что разработанный способ с учетом предварительной обработки сырья повышает выход ГКК в два и более раз по сравнению с ранее описанными в литературе способами.

Экспериментально установлены технологические параметры получения настоек из эхинацеи пурпурной травы: объемная доля этанола — 60%; продолжительность мацерации — 7 сут с последующим механическим перемешиванием в течение 60 мин; соотношение сырья и 60% этанола — 1(г):10(мл); степень измельчения сырья — от 500 до 2000 мкм; продолжительность отстаивания вытяжки — не более 3 сут.

Рекомендуется использовать предварительную обработку (обезжиривание, термическую обработку и их комбинации) для разработки новых технологий получения настоек эхинацеи в промышленных условиях с целью обогащения конечной продукции ГКК.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Р.И. Лукашов — выполнение экспериментальных работ, оформление результатов, написание текста рукописи; Н.С. Гурина — постановка цели работы, методическое руководство выполнением экспериментальной работы, обсуждение результатов.

Authors’ contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Raman I. Lukashou conducted the experiments, presented the results, and drafted the manuscript. Natalia S. Gurina set the aim for the study, provided methodological guidance for the experiments, and discussed the results.

1. Государственный реестр лекарственных средств Республики Беларусь. https://rceth.by/Refbank/reestr_lekarstvennih_sredstv 2. ФС 07/2016:1823. Эхинацеи пурпурной трава. Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2 изд. Т. 2. Минск; 2016. 3. ФС 01/2013:РБ50301 Статистический анализ результатов химического эксперимента. Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2 изд. Т. 1. Минск; 2012. 4. ФС 07/2016:1823 Эхинацеи пурпурной трава. Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2 изд. Т. 2. Минск; 2016. 5. Там же. 6. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-2-207-216-fig6 7. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-2-207-216-fig7 8. Рогожникова ЕП. Совершенствование технологии получения настоек из разного вида лекарственного растительного сырья: дис. ... канд. фарм. наук. М.; 2021. 9. ФС 01/2013:50400. Остаточные количества органических растворителей. Государственная фармакопея Республики Беларусь. 2 изд. Т. 1. Минск; 2012.